聶佳琪，潘 鳳，李曉寧，崔?？担瑥埿駯|，楊 蘭，張文杰

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，每年全球新確診病例超過100萬[1]。能量代謝的重新編程和免疫逃避[2]是癌癥的兩個(gè)新興標(biāo)志[3]。乳酸代謝中的關(guān)鍵酶——乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)常以LDHA和LDHB兩種不同的亞型存在，LDHA負(fù)責(zé)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸和NAD+，而LDHB負(fù)責(zé)將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，促進(jìn)氧化代謝[4]。在腫瘤細(xì)胞中，即使在氧氣充足的情況下，丙酮酸也易被LDHA催化成乳酸，稱為Warburg效應(yīng)，也稱為有氧糖酵解[5]。增加Warburg效應(yīng)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，通過合成代謝過程避免細(xì)胞凋亡[6]。值得注意的是，產(chǎn)生的乳酸會(huì)導(dǎo)致酸性腫瘤微環(huán)境的形成，這種低pH環(huán)境可影響腫瘤免疫監(jiān)測(cè)的各個(gè)部分，以驅(qū)動(dòng)免疫逃逸[7]，因此，有必要探究LDH表達(dá)在胃癌中的臨床價(jià)值以及對(duì)免疫微環(huán)境可能產(chǎn)生的影響。雖然，目前已有大量的體外研究關(guān)注LDHA在胃癌中的調(diào)控作用，包括其上下游的靶向結(jié)合關(guān)系[8]，以及對(duì)糖酵解的影響[9]，但鮮有研究關(guān)注LDHB在胃癌中的作用以及預(yù)后價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討LDHA和LDHB表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，并使用ssGSEA算法探究不同亞型對(duì)胃癌組織免疫微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集來源及預(yù)處理從TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫下載HTseq-FPKM格式的407例胃癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后，比較組織中LDH mRNA的表達(dá)。另外，從上述數(shù)據(jù)庫下載全體胃癌患者的臨床數(shù)據(jù)，對(duì)407例具有LDH表達(dá)信息的樣本與臨床信息進(jìn)行匹配，最終納入375例具有完整LDH表達(dá)信息和臨床病理數(shù)據(jù)的胃癌標(biāo)本。從HPA(https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫下載胃癌患者的LDH免疫組化染色圖片，其中LDHA染色包括11例正常人群及36例胃癌患者；LDHB染色包括12例正常人群及44例胃癌患者，對(duì)所有圖片使用Image pro plus軟件分析光密度值(IOD)。

1.2 生物信息學(xué)ssGSEA算法其根據(jù)每個(gè)樣本中全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)，計(jì)算每個(gè)基因的rank值，對(duì)24種免疫細(xì)胞的含量進(jìn)行評(píng)估。24種免疫細(xì)胞包括aDC細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞、DC細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、iDC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK CD56bright細(xì)胞、NK CD56dim細(xì)胞、NK細(xì)胞、pDC細(xì)胞、T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、Tcm細(xì)胞、Tem細(xì)胞、TFH細(xì)胞、Tgd細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R軟件v4.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Image pro plus軟件計(jì)算免疫組化染色的IOD值。采用t檢驗(yàn)分析計(jì)量資料差異，采用χ2檢驗(yàn)分析計(jì)數(shù)資料差異，采用Cox回歸模型篩選患者預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。采用Pearson法進(jìn)行免疫組化分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及正常組織中LDHA和LDHB的表達(dá)與癌旁正常組織相比，胃癌組織中LDHA的mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05，圖1A)。IOD半定量分析顯示，胃癌組織中LDHA蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05，圖1B)，并且染色強(qiáng)度更深(圖1C)。另外，胃癌組織中LDHB的mRNA(圖1D)及蛋白表達(dá)量(圖1E)同樣明顯上調(diào)(P均<0.05)，且染色強(qiáng)度更深(圖1F)。

圖1 胃癌組織及癌旁正常組織中LDHA和LDHB的表達(dá)：A.LDHA mRNA的表達(dá)量；B.LDHA蛋白的IOD數(shù)值；C.LDHA的免疫組化染色，SP法；D.LDHB mRNA的表達(dá)量；E.LDHB蛋白的IOD數(shù)值；F.LDHB的免疫組化染色，SP法

2.2 LDHA及LDHB表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系以LDHA和LDHB表達(dá)的中位值作為截?cái)嘀担瑢⑷w患者分為高表達(dá)組(188例)和低表達(dá)組(187例)，發(fā)現(xiàn)LDHA表達(dá)與患者性別和年齡有關(guān)；LDHB表達(dá)與患者性別、T分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P均<0.05，表1)。

表1 LDHA及LDHB表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 LDHA及LDHB表達(dá)與胃癌患者總生存期(overall survival, OS)的關(guān)系LDHA高表達(dá)組患者的OS明顯短于低表達(dá)組患者(P<0.05)；LDHB高、低表達(dá)組患者的OS無明顯差異(P>0.05，圖2)。Cox回歸分析結(jié)果顯示，LDHA表達(dá)與患者年齡、M分期一樣，均是胃癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素(P均<0.05，表2)。LDHB表達(dá)與患者OS無關(guān)(P>0.05)，但年齡和M分期仍是胃癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素(P均<0.05)。

表2 Cox回歸分析患者OS的相關(guān)因素

圖2 A.LDHA表達(dá)與胃癌患者總生存期的關(guān)系；B.LDHB表達(dá)與胃癌患者總生存期的關(guān)系

2.4 LDHA及LDHB表達(dá)與胃癌患者無瘤生存期(disease-free survival, DFS)的關(guān)系LDHA高表達(dá)組患者的DFS與低表達(dá)組患者相比，差異無顯著性(P>0.05)；LDHB高表達(dá)組患者的DFS與低表達(dá)組患者相比明顯縮短(P<0.05，圖3)。Cox回歸分析結(jié)果顯示，LDHA表達(dá)與患者的DFS無關(guān)(P>0.05)，LDHB表達(dá)對(duì)患者DFS具有較強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值(P<0.05，表3)。

圖3 A.LDHA表達(dá)與胃癌患者無瘤生存期的關(guān)系；B.LDHB表達(dá)與胃癌患者無瘤生存期的關(guān)系

表3 Cox回歸分析患者DFS的相關(guān)因素

2.5 LDHA及LDHB表達(dá)對(duì)胃癌組織免疫微環(huán)境的影響LDHA表達(dá)與Th2細(xì)胞、NK CD56dim細(xì)胞、aDC細(xì)胞、Th1細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的含量呈正相關(guān)(P均<0.05)；與NK CD56bright細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、pDC細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、Tem細(xì)胞、Tcm細(xì)胞、TFH細(xì)胞以及NK細(xì)胞的含量呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。僅NK細(xì)胞與LDHB表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；LDHB表達(dá)與Th2細(xì)胞、NK CD56dim細(xì)胞、aDC細(xì)胞、Th1細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及輔助T細(xì)胞含量呈正相關(guān)(P均<0.05，圖4)。另外，LDHB高、低表達(dá)組中有差異的免疫細(xì)胞數(shù)目較少。在不同LDHB表達(dá)的患者中，嗜酸性粒細(xì)胞、pDC細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、Tem細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th2細(xì)胞的含量具有明顯差異(6/24)(P<0.05)。值得注意的是，在不同LDHA表達(dá)的患者中，大部分免疫細(xì)胞的含量差異均有顯著性(14/24)(P<0.05，圖5)。

圖4 A.LDHA表達(dá)與24種免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析；B.LDHB表達(dá)與24種免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析

圖5 A.LDHA高、低表達(dá)組與24種免疫細(xì)胞含量的差異分析；B.LDHB高、低表達(dá)組與24種免疫細(xì)胞含量的差異分析；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位居惡性腫瘤的第2位，病死率位居第3位，僅次于肺癌和肝癌[1]。在酸性環(huán)境中的腫瘤代謝重編程[10]與PD-L1等相關(guān)的免疫逃逸機(jī)制已被證明在胃癌中具有重要作用[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)著重探討導(dǎo)致腫瘤酸性環(huán)境關(guān)鍵酶的兩種亞型對(duì)胃癌的臨床價(jià)值以及對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的影響。

乳酸生成的增加和H+離子的積累，最終導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的酸化，目前相關(guān)研究已證明腫瘤組織中酸性環(huán)境與免疫反應(yīng)之間存在密切聯(lián)系[12]。大多數(shù)情況下，酸性環(huán)境導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的活性下調(diào)，而促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和骨髓源性抑制細(xì)胞的招募，從而刺激免疫抑制[13]。另外，相關(guān)研究支持LDH在腫瘤進(jìn)展中的作用，如在C57BL/6小鼠胰腺癌模型成瘤實(shí)驗(yàn)中，敲除LDHA表達(dá)后腫瘤大小小于對(duì)照組；在相同的模型中，LDHA敲低的腫瘤中NK細(xì)胞表現(xiàn)出更高的活性[14]。與此同時(shí)，黑色素瘤中LDH相關(guān)的乳酸積累被證明可以抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的監(jiān)測(cè)作用，但有趣的是其抑制作用被認(rèn)為涉及乳酸誘導(dǎo)的T細(xì)胞和NK細(xì)胞中NFAT的下調(diào)，從而減少了IFNγ的產(chǎn)生[15]。該結(jié)論提示，LDH活化可能在不同環(huán)境下同時(shí)具有促炎和抗炎作用。目前，LDHA在胃癌中表達(dá)的研究報(bào)道較多，如mTOR/PKM2和STAT3/C-Myc信號(hào)通路可降低LDHA的表達(dá)，并調(diào)節(jié)其能量代謝和腫瘤微環(huán)境[16]。且相關(guān)臨床研究結(jié)果亦表明，LDH的水平對(duì)胃癌患者預(yù)后有著較強(qiáng)的預(yù)測(cè)價(jià)值[17]，檢測(cè)化療前LDH水平也可預(yù)測(cè)中晚期胃癌患者姑息性化療預(yù)后[18]。同以往文獻(xiàn)報(bào)道一致，本實(shí)驗(yàn)亦認(rèn)為LDHA與患者預(yù)后密切相關(guān)，并且在OS中有著較好的獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值。另外本實(shí)驗(yàn)確定了LDHA表達(dá)與Th2細(xì)胞、NK CD56dim細(xì)胞、aDC細(xì)胞、Th1細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的含量呈正相關(guān)；與NK CD56bright

細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、pDC細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、Tem細(xì)胞、Tcm細(xì)胞、TFH細(xì)胞以及NK細(xì)胞的含量呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果也可為我們未來在LDH與免疫逃逸的基礎(chǔ)研究中提新思路。另外，不同LDHA表達(dá)的胃癌患者，其DFS結(jié)局差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但隨后本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LDHB是胃癌患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其結(jié)果可作為LDHA的補(bǔ)充。遺憾的是，關(guān)于LDHB對(duì)胃癌組織中免疫微環(huán)境和預(yù)后價(jià)值的研究較少。但本實(shí)驗(yàn)提供了該亞型對(duì)胃癌患者DFS的預(yù)后價(jià)值，并且揭示了LDHB表達(dá)對(duì)免疫細(xì)胞浸潤豐度的影響，包括嗜酸性粒細(xì)胞、pDC細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、Tem細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th2細(xì)胞。這些結(jié)果提示，LDHB的表達(dá)可能同LDHA一樣，也具有一定的免疫調(diào)節(jié)價(jià)值。

目前，雖然胃癌中已有部分標(biāo)志物的預(yù)后作用被深入研究，如SPIN1[19]、AXIN2[20]等,但本實(shí)驗(yàn)對(duì)探究胃癌中乳酸代謝關(guān)鍵酶的關(guān)鍵作用提供了新思路。本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性：(1)根據(jù)美國公開回顧性數(shù)據(jù)集，LDH的預(yù)后效能可能還需國內(nèi)病例數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步驗(yàn)證。(2)由于該數(shù)據(jù)集缺乏統(tǒng)一的病理分型，未進(jìn)行各病理亞型的分層分析，如傳統(tǒng)病理分型或分子亞型。雖然，ssGSEA算法在生物信息學(xué)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，但仍需體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)雖然提示LDHA及LDHB表達(dá)對(duì)免疫細(xì)胞的影響，并且阻斷腫瘤乳酸代謝可能是腫瘤治療的另一種可以嘗試的途徑，但目前針對(duì)免疫細(xì)胞的治療方法具有強(qiáng)毒性，得出的某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果需謹(jǐn)慎應(yīng)用。