羅金風，劉廣龍，徐東艷，李小清，鄧永鍵

細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, Cdc42)是小GTP酶Rho家族成員，在響應不同信號時可以從無活性GDP結合形式轉變?yōu)榛钚訥TP結合形式[1]，參與維持細胞骨架、細胞極性、分子運輸?shù)萚2-4]。Cdc42在多種腫瘤中過度激活，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，Cdc42在結直腸癌中存在表達分布的差異，有表達朝向腺管中心的向心性表達和表達背離腺管中心的離心性表達，且其離心性表達與細胞侵襲性偽足形成有關[5]，但具體機制尚不清楚。E-cadherin分子參與維持細胞極性[6]，與腫瘤轉移行為有關[7]。那么Cdc42離心性表達是否與E-cadherin分子之間存在關系呢？本實驗采用免疫組化法檢測Cdc42和E-cadherin在結直腸癌組織中的表達分布情況，并分析其表達與臨床病理學特征的關系，同時采用實時熒光定量PCR和Western blot技術檢測兩者的表達調控關系，為轉移性結直腸癌提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 收集2007年1月～2008年12月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科存檔的結直腸癌標本198例，均具有完整的隨訪資料，其中男性106例，女性92例；年齡≤60歲80例，>60歲118例；浸潤深度達固有肌層33例，達漿膜下層133例，突破漿膜層32例；無淋巴結轉移130例，有淋巴結轉移68例；無遠處轉移180例，有遠處轉移18例。標本均經兩名經驗豐富的病理醫(yī)師明確診斷，且所有患者術前均未接受放、化療。

1.1.2細胞 結直腸癌細胞HCT116、LS174t、SW480、Caco2、SW620、LoVo，均購自ATCC庫。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 免疫組化染色采用EnVision兩步法，將組織蠟塊制作成組織芯片，3 μm厚連續(xù)切片，烤干備用。常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽進行高壓熱修復，3%H2O2封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色5 min，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化，PBS返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。用PBS代替一抗作為陰性對照。兔多克隆抗體Cdc42(ab187643，稀釋比1 ∶200)購自美國Abcam公司，即用型E-cadherin(ZM-0092)抗體、通用型試劑盒(PV 6000)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9017)，均購自北京中杉金橋公司。

1.2.2免疫熒光 組織切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復，滴加一抗孵育過夜，滴加熒光二抗孵育，DAPI(Biosharp)染核，甘油封固。Alexa Fluor 488標記抗兔IgG(購自北京中杉金橋公司)。

1.2.3細胞培養(yǎng)和轉染 所有結直腸癌細胞均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640，置于37 ℃ 5%CO2孵育箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長狀態(tài)良好，消化鋪板，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)轉染Control和Cdc42質粒，48 h后檢測轉染效率并開展后續(xù)實驗。

1.2.4實時熒光定量PCR 采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測濃度和純度均合格，逆轉錄生成cDNA，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11701)進行實時熒光定量PCR檢測，引物序列詳見表1。采用2-ΔΔCt法計算各組mRNA的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.5Western blot法 待細胞生長狀態(tài)良好時，鋪板轉染，48 h后收集細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，加入Loading Buffer變性，-20 ℃保存。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒(PG112)配制10%凝膠，恒壓120 V、90 min電泳，恒流200 mA、90 min轉模，5%牛奶室溫封閉1 h，一抗Cdc42和E-cadherin 4 ℃搖床孵育過夜，室溫孵育二抗45 min，顯影并用Image J軟件進行灰度分析。

1.3 判斷標準Cdc42陽性定位于細胞質，表達朝向腺管中心，位于腺體頂端為向心性表達，表達背離腺管中心，位于腺體基底部為離心性表達。隨機選取5個高倍視野，只要觀察到一個細胞存在離心性表達，即將此病例判讀為離心性表達，否則為向心性表達。Cdc42離心性表達的病例，做連續(xù)切片，檢測同一位置的E-cadherin表達，E-cadherin表達定位于細胞膜，陰性判讀為E-cadherin表達缺失。與離心性表達相比，向心性表達的患者預后較好，因不是本實驗的主要研究對象，故在此不進行E-cadherin表達情況的分析。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，χ2檢驗分析各組間表達的差異性；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較生存率；兩獨立樣本t檢驗分析實時熒光定量PCR結果。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織中Cdc42的表達Cdc42表達主要定位于細胞質。Cdc42表達朝向腺管中心，為向心性表達，表達背離腺管中心為離心性表達(圖1、2)，本實驗中有45.96%(91/198)病例伴Cdc42的離心性表達。統(tǒng)計分析結果顯示，Cdc42離心性表達與結直腸癌浸潤深度(P=0.011)、淋巴結轉移(P<0.001)和遠處轉移(P<0.001)密切相關，與患者性別、年齡無關(P均>0.05，表2)，且與患者不良預后相關(P<0.001，圖3)。

圖1 免疫熒光法檢測Cdc42在結直腸癌組織中的表達

圖2 免疫組化法檢測Cdc42在結直腸癌組織中的表達：A.Cdc42呈離心性表達；B.Cdc42呈向心性表達，EnVision兩步法

圖3 Cdc42不同表達模式與患者預后的關系

表2 Cdc42表達與結直腸癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.2 Cdc42離心性表達伴E-cadherin表達缺失Cdc42離心性表達的病例做連續(xù)切片，檢測同一位置的E-cadherin表達，發(fā)現(xiàn)有73.63%(67/91)伴有E-cadherin表達缺失(圖4)。統(tǒng)計分析結果顯示，伴E-cadherin表達缺失與結直腸癌浸潤深度(P=0.006)密切相關，而與患者性別、年齡、淋巴結轉移和遠處轉移無關(P>0.05，表3)，且與患者不良預后相關(P<0.001，圖5)。

圖4 Cdc42離心性表達伴E-cadherin表達缺失：A.Cdc42離心性表達；B.E-cadherin表達缺失，EnVision兩步法

圖5 Cdc42離心性表達伴E-cadherin不同表達模式與結直腸癌患者預后的關系

表3 Cdc42離心性表達伴E-cadherin缺失與結直腸癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 Cdc42與E-cadherin表達之間的關系實時熒光定量PCR檢測結果顯示，Cdc42在SW480細胞中呈低表達。選取SW480細胞進行過表達Cdc42處理，驗證過表達效率，實時熒光定量PCR和Western blot法檢測結果均顯示，當Cdc42過表達時E-cadherin表達下調(圖6)。

圖6 Cdc42與E-cadherin表達之間的關系：A.Cdc42在結直腸癌細胞中的表達；B.過表達Cdc42使E-cadherin的mRNA水平下調；C.過表達Cdc42使E-cadherin的蛋白水平下調

3 討論

近年結直腸癌的早期診斷和治療雖取得極大的進展，但腫瘤侵襲、轉移仍然是導致結直腸癌患者預后不良的主要原因。腫瘤細胞轉移是一個多步驟、多階段、多分子參與的過程[8]。首先是細胞間黏附能力的喪失，上皮細胞向間充質細胞表型轉變，該過程稱為上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[9]。EMT轉變過程由多種轉錄因子和信號通路參與，包括ZEB1、ZEB2、Twist、Snail、Slug等，各種信號通路如TGF-β、Wnt信號通路、PI3K/AKT軸等[10-11]，E-cadherin分子在其中發(fā)揮至關重要的作用。E-cadherin由CDH1基因編碼，位于染色體16q22.1上，屬于Ⅰ型鈣黏蛋白，成熟的E-cadherin蛋白是一種Ca2+依賴性跨膜糖蛋白分子，胞外域由5個鈣黏蛋白重復序列(EC)組成，與鄰近細胞相互作用介導細胞間黏附；胞內域的近膜域(juxtamembrane domain, JMD)與p120結合，防止E-cadherin的泛素化降解，連環(huán)蛋白結構域(catenin binding domain, CBD)與β-catenin結合，后者與α-catenin結合，α-catenin與細胞骨架肌動蛋白結合發(fā)揮作用[12-14]。E-cadherin主要通過黏附連接將正常和極化的上皮細胞緊密結合在一起，對于維持組織結構的完整性至關重要[15]，E-cadherin表達缺失是EMT發(fā)生的重要標志，與多種腫瘤的不良預后相關。

Cdc42參與腫瘤轉移的多個過程，如Cdc42參與侵襲性偽足的形成[5]，Cdc42調控肌球蛋白收縮性從而促進腫瘤的侵襲運動能力[16]。由此可見，Cdc42可作為腫瘤轉移的關鍵調節(jié)分子。有研究表明，Cdc42的激活會促進E-cadherin蛋白的溶酶體降解，從而有助于間充質表型的發(fā)生[17]，也可以通過其效應分子CIP4促進β-catenin蛋白易位到細胞核抑制E-cadherin的表達[18]。Cdc42在結直腸癌中表達分布存在差異，其特異性的離心性表達與結直腸癌的不良預后相關[5]，這種特異性的分布是否也與E-cadherin蛋白之間存在關系，從而促進結直腸癌的進展。

免疫組化結果顯示，Cdc42在結直腸癌中的離心性表達與組織浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關，且伴有離心性表達的患者預后不良，提示Cdc42的離心性表達可能與結直腸癌的侵襲和轉移有關。Cdc42離心性表達的病例中有73.63%伴E-cadherin蛋白的缺失，伴E-cadherin表達缺失與組織浸潤密切相關，并且患者預后明顯更差，實時熒光定量PCR和Western blot法檢測結果均顯示，過表達Cdc42后，E-cadherin表達下調，可初步證實兩者確實存在調控關系。

綜上所述，Cdc42在結直腸癌中離心性表達與腫瘤侵襲和轉移相關，預示患者的不良預后，這一過程有E-cadherin分子參與，針對兩者的監(jiān)測和靶向可以為轉移性結直腸癌提供新的治療策略。本文僅初步驗證兩者存在的關系，實驗仍然存在一定的局限性，其具體的調控機制仍需后續(xù)實驗進一步深入探討。