閆 峰田 悅黃語悠鐘麗媛羅玉敏?

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室,北京 100052;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心,廣州 510405)

缺血性腦血管病已成為威脅我國人民健康的頭號殺手,隨著人口老齡化社會的進(jìn)入,我國腦血管病的發(fā)病率在近幾年快速增長[1]。 其中慢性腦缺血作為一種常見的病理狀態(tài),伴發(fā)于血管性癡呆、老年性癡呆等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)程中。 因慢性腦缺血導(dǎo)致的運(yùn)動、認(rèn)知、行為能力以及學(xué)習(xí)記憶等功能障礙的患者人群越來越多,給患者和家人帶來了嚴(yán)重的危害,給社會造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。與急性腦缺血相比,慢性腦缺血的治療時間窗更長,早期干預(yù),可以改善臨床預(yù)后。 但目前治療慢性腦缺血的藥物較少,亟待開發(fā)。

慢性腦缺血發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,最新研究表明,血腦屏障(blood brain barriar, BBB)損傷,參與了慢性腦缺血的發(fā)生發(fā)展[2-3]。 豨薟通栓(xi-xian-tongshuan,XXTS)膠囊由豨薟草等13 味君臣佐使的中藥藥物組方,能夠活血祛瘀、祛風(fēng)化痰、舒筋通絡(luò)、醒腦開竅。 用于缺血性中風(fēng)風(fēng)痰痹阻脈絡(luò)證引起的半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜,語言蹇澀。 在慢性腦缺血的治療中是否能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用報道較少。 因此,本研究應(yīng)用慢性腦缺血大鼠模型研究豨薟通栓膠囊對大鼠慢性腦缺血的作用及對BBB的影響,為后續(xù)藥物的適應(yīng)癥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠(270~300 g,8~10 周齡)21 只,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010],飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心SPF 級動物實驗室[SCXK(京)2019-0050]。 所有動物實驗均遵守3R 原則及首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動物倫理委員會相關(guān)要求(xw20211117-1)。

1.2 主要試劑與儀器

豨薟通栓膠囊(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司,國藥準(zhǔn)字z20040065);異氟烷(河北一品制藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H19980141);IgG 熒光抗體(Alexa Flour 488,Life,1 ∶500);一抗(occludin,1 ∶250,Abcam,ab31721;claudin-5,1 ∶500, Santa,sc-28670);二抗(1 ∶2000,中杉金橋);基質(zhì)金屬蛋白酶ELISA 試劑盒(MMP-9,江蘇酶免實業(yè)有限公司,MM-20918R2); 緊密連接蛋白 ELISA 試劑盒(occludin,江蘇酶免實業(yè)有限公司MM-70051R2;claudin-5,江蘇酶免實業(yè)有限公司,MM-61504R2)。顯微鏡(Nikon,941176);水迷宮(上?？菩离娮涌萍加邢薰?;酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS,芬蘭)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Sprague-Dawley(SD)大鼠CCH 模型及分組

術(shù)前12 h 禁食水。 CCH 模型組制作:5%異氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉后取仰臥位固定,2%異氟烷維持麻醉狀態(tài)。 頸部備皮后碘伏消毒,沿頸部正中線切開皮膚,鈍性分離筋膜、肌肉組織,充分暴露頸總動脈并小心分離,注意避免損傷迷走神經(jīng),用6-0 線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈,縫合傷口。 30 min 后同樣步驟結(jié)扎左側(cè)頸總動脈。 假手術(shù)組找到雙側(cè)頸總動脈并與周圍肌肉組織分離而不結(jié)扎。 SD 大鼠隨機(jī)分組:假手術(shù)組(Sham,n=7)、模型組(CCH,n=7)、模型+豨薟通栓膠囊組(CCH+XXTS,n=7)。

1.3.2 給藥方法

大鼠術(shù)后第2 天開始灌胃給藥,豨薟通栓膠囊組大鼠給藥劑量為500 mg/(kg·d),假手術(shù)組與模型組給予相同體積的蒸餾水,所有大鼠術(shù)后持續(xù)灌胃42 d。

1.3.3 Morris 水迷宮實驗

采取Morris 水迷宮方法對大鼠的認(rèn)知、記憶功能進(jìn)行評價。 Morris 水迷宮是用來評價大鼠腦缺血后空間學(xué)習(xí)記憶特征。 本研究在大鼠手術(shù)后第37~42 天進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練,第42 天進(jìn)行記憶檢測并記錄(具體流程見圖1)。

圖1 實驗流程Figure 1 Experimental sequence

1.3.4 取材與組織標(biāo)本留存

所有組織與血液均在第42 天完成水迷宮實驗后當(dāng)天取得。 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后下腔靜脈采集靜脈血液4 mL,EDTA 抗凝。 離心(3000 r/min,10 min)后,取上清血漿并分裝,-80℃冷藏待后續(xù)檢測。 大鼠心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛后取腦組織進(jìn)行石蠟包埋及切片。

1.3.5 尼氏染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟后放入1%焦油紫染液中于37℃烤箱中染色30 min,后用蒸餾水小心沖洗腦組織表面染液。 將切片放于95%乙醇溶液中分色后放入新的95%乙醇溶液中脫水2 min。 將切片放入二甲苯溶液中浸泡10 min 后用中性樹脂封片。 顯微鏡下觀察海馬組織神經(jīng)元變化并選取代表性位置拍照。

1.3.6 IgG 法檢測血腦屏障通透性

大鼠腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后,使用5%BSA+驢血清封閉4℃過夜。 第2 天使用1 ∶200 大鼠IgG 熒光抗體避光孵育24 h。 后使用PBS 常規(guī)清洗并用含DAPI 的樹脂封片劑封片。 熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.7 ELISA 檢測血腦屏障相關(guān)因子

根據(jù)ELISA 說明書操作步驟,檢測血漿中基質(zhì)金屬蛋白酶和緊密連接蛋白的含量。

1.3.8 Western blot 檢測血腦屏障相關(guān)蛋白表達(dá)

取大鼠海馬組織放入裂解液中用超聲破碎勻漿后取上清,分光光度計測量蛋白濃度并定量變性后,取20 μg 蛋白上樣電泳、電轉(zhuǎn)。 將PVDF 膜用5%牛奶封閉1 h 后,加入一抗,4℃冰箱孵育過夜。次日常規(guī)洗膜后二抗室溫孵育1 h,常規(guī)洗膜后加發(fā)光液曝光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GaphPad Prism8 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 實驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(ˉ±sˉx)表示。 實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)統(tǒng)計,利用Tukey 進(jìn)行檢驗分析。P<0.05代表組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

由于慢性腦缺血常導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷,因此我們使用Morris 水迷宮對不同處理組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,各組大鼠在5 d 的訓(xùn)練中找到平臺的潛伏期均隨學(xué)習(xí)次數(shù)的增加而下降。 訓(xùn)練第4 天及第5 天后,Sham 組和CCH+XXTS組找到平臺的潛伏期均顯著低于CCH 組(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.001, 圖2A)。 以上結(jié)果表明給予豨薟通栓膠囊治療可以明顯改善大鼠慢性腦缺血后學(xué)習(xí)能力下降的現(xiàn)象。 在撤平臺后對大鼠記憶能力的檢測中發(fā)現(xiàn),CCH 組大鼠的穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限距離、目標(biāo)象限時間,較Sham 組均出現(xiàn)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.001,圖2B)。 給予豨薟通栓治療后,大鼠記憶力改善,CCH+XXTS 組大鼠在目標(biāo)象限停留時間顯著高于CCH 組。 (P<0.01, 圖2B)。

2.2 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷

尼氏染色結(jié)果顯示,正常對照組大鼠海馬CA1、CA3 區(qū)神經(jīng)元染色可見深藍(lán)色尼氏小體,神經(jīng)元數(shù)目較多;慢性腦缺血后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元尼氏小體染色變淡,排列散亂,數(shù)量明顯減少,胞體縮小。 給予豨薟通栓膠囊治療后,大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元,尼氏小體染色較CCH 組明顯加深,數(shù)量增多,海馬CA1、CA3 區(qū)神經(jīng)元損傷得到改善(P<0.05,P<0.01,P<0.01,圖3)。

2.3 豨薟通栓膠囊減少慢性腦缺血后大鼠腦組織IgG 滲出

IgG 分子量較大,在正常情況下其只存在于血管中。 當(dāng)血腦屏障被破壞后,血管中的IgG 會滲漏到腦組織中。 為了觀察豨薟通栓膠囊對慢性腦缺血大鼠BBB 通透性的影響,我們對腦組織切片IgG 滲漏情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,與對照組相比,慢性腦缺血損傷大鼠腦組織IgG 漏出量明顯增多,給予豨薟通栓膠囊治療后,可以顯著減少大鼠腦組織中IgG 的漏出量(P<0. 05,P<0. 01,圖4)。

注:與Sham 組相比,?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001;與CCH 組相比,##P<0.01。圖2 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力(n=7)Note. Compared with Sham group, ?P<0.05, ??P<0.01, ???P<0.001. Compared with CCH group, ##P<0.01.Figure 2 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the learning and memory abilities of CCH rats

注:與Sham 組相比,??P<0.01;與CCH 組相比,#P<0.05,##P<0.01。圖3 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷(n=3)Note. Compared with Sham group, ??P<0.01. Compared with CCH group,#P<0.05, ##P<0.01.Figure 3 Xi-xian-tong-shuan capsules reduce the number of Nissl body in hippocampus

2.4 豨薟通栓膠囊減少慢性腦低灌注大鼠血漿MMP-9、occludin、claudin-5 濃度

我們應(yīng)用ELISA 的方法檢測了Sham 組、CCH 組、CCH+XXTS 組血漿中MMP-9、occludin、claudin-5 的蛋白濃度。結(jié)果顯示與假手術(shù)相比,CCH 組血漿中MMP-9、occludin、claudin-5 濃度顯著高于Sham 組,給予豨薟通栓膠囊可顯著降低慢性腦缺血損傷后血漿中MMP-9、occludin、claudin-5 濃度(P<0. 01,P<0. 001,P<0. 0001,P<0. 0001,圖5)。

2.5 豨薟通栓膠囊增加慢性腦低灌注大鼠腦組織中緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

我們應(yīng)用Western blot 的方法檢測了Sham 組、CCH 組、CCH+XXTS 組腦組織中緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin 和claudin-5 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示與Sham 組相比,CCH 組中occludin 和claudin-5 的表達(dá)顯著減少,給予豨薟通栓膠囊治療可顯著上調(diào)上述緊密連接蛋白的表達(dá)(P<0.05,P<0.05,圖6)。

注:與Sham 組相比,???P<0.0001,????P<0.0001;與CCH 組相比,##P<0.01,####P<0.0001。圖5 豨薟通栓膠囊減少慢性腦缺血大鼠血漿MMP-9、occludin、claudin-5 水平(n=7)Note. Compared with Sham group, ???P<0.0001, ????P<0.0001. Compared with CCH group, ##P<0.01, ####P<0.0001.Figure 5 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the leave of MMP-9, occluding and claudin-5 in plasma

注:與Sham 組相比,?P<0.05;與CCH 組相比,#P<0.05。圖6 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠腦組織中occludin、claudin-5 水平(n=3)Note. Compared with Sham group, ?P<0.05. Compared with CCH group, #P<0.05.Figure 6 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the leave of occludin and claudin-5 in brain

3 討論

慢性腦血管病與動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病等常見病息息相關(guān),目前的研究發(fā)現(xiàn)慢性腦血管病的損傷機(jī)制主要包括腦白質(zhì)損傷、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞新生、神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死等,血腦屏障作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周的屏障,其在慢性腦血管病中的作用越來越受到重視[4-6]。 長期腦血管低灌注會導(dǎo)致BBB 受損,通透性增加,腦微血管中水分和血漿蛋白的滲出,進(jìn)而造成細(xì)胞間隙水分的增加,形成血管源性水腫。 我們應(yīng)用大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎慢性腦缺血模型,觀察腦慢性缺血后給予豨薟通栓膠囊42 d 后,觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和血腦屏障等情況。 我們發(fā)現(xiàn)豨薟通栓膠囊可以明顯改善慢性腦缺血造成的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的現(xiàn)象。 在水迷宮實驗中我們發(fā)現(xiàn),給予豨薟通栓膠囊治療組大鼠在撤平臺后其穿臺次數(shù)及目標(biāo)象限時間均較模型組有明顯改善。 說明了豨薟通栓膠囊對于改善慢性腦缺血后認(rèn)知記憶功能下降方面的作用。 雖然在目標(biāo)象限距離指標(biāo)中豨薟通栓治療組與模型組沒有統(tǒng)計學(xué)差異,但由于目標(biāo)象限時間和游速決定的,部分豨薟通栓治療組組動物在到達(dá)其記憶的平臺位置漂浮在水中不再移動,因而產(chǎn)生了此種結(jié)果。 在血腦屏障功能檢測中我們發(fā)現(xiàn)慢性腦低灌注損傷后大鼠血腦屏障破壞,而豨薟通栓膠囊治療后可顯著改善此情況。 我們通過實驗證實腦組織BBB 破壞后引起毛細(xì)血管的通透性增加,可以使正常情況下只存在于血管中的大分子IgG 通過破壞的BBB 進(jìn)入腦組織,因此測定腦組織中IgG 滲出量可以反映BBB 開放程度[7]。 我們通過對大鼠腦組織中IgG 的熒光染色發(fā)現(xiàn),豨薟通栓膠囊治療可以顯著減少慢性腦低灌注損傷后可腦組織中IgG 的含量。 以上結(jié)果提示我們,豨薟通栓膠囊治療可以改善慢性腦低灌注損傷后BBB 的損傷、降低其通透性。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是含有Zn2+的蛋白水解酶家族。 一方面,MMPs 可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),進(jìn)而使得腦毛細(xì)血管的通透性增加,引起水分和血漿蛋白的滲出,形成水腫。 另一方面,MMPs 對基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接的破壞直接導(dǎo)致BBB 損傷,參與多種病理情況下的BBB 的開放[8-11]。 緊密連接相關(guān)蛋白在維持BBB 完整性的過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用,其結(jié)構(gòu)和功能的破壞將引起B(yǎng)BB 通透性增加,甚至腦水腫。 其中claudin-5 和occludin 蛋白是細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密連接完整性最關(guān)鍵的成分[12-13]。 研究發(fā)現(xiàn),缺血損傷可以上調(diào)腦組織中MMP-9 的表達(dá),與缺血損傷后腦水腫和BBB 開放密切相關(guān),其機(jī)制可能與MMP-9 直接降解緊密連接蛋白有關(guān)[14]。 因此為了進(jìn)一步證實豨薟通栓膠囊對慢性腦低灌注損傷后BBB 的保護(hù)作用,我們對血液中的MMP-9以及血液和腦組織中的緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了測定。 我們發(fā)現(xiàn)血液中的claudin-5 和occludin 含量明顯升高,這與臨床研究發(fā)現(xiàn)腦血管病人血清中其二者的變化結(jié)果相一致[15],且MMP-9的表達(dá)量明顯上調(diào)。 在腦組織中的緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)檢測中我們發(fā)現(xiàn)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)明顯減少。 并且豨薟通栓治療后能夠明顯改善以上結(jié)果。 這些研究結(jié)果均提示,豨薟通栓膠囊可能通過抑制MMP-9 的表達(dá),減少腦組織中緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5 和occludin 的降解,最終發(fā)揮對BBB 的保護(hù)作用。

綜上所述,豨薟通栓膠囊可能通過保護(hù)血腦屏障的功能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,改善慢性腦缺血后大鼠的認(rèn)知功能。