黨 翠陸佳涵魏 強(qiáng)薛 婧叢 喆

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

由于病毒潛伏庫的持續(xù)存在,艾滋病迄今無法實(shí)現(xiàn)徹底治愈[1-3]。 “柏林病人”和“倫敦病人”的成功由于其特殊性而難以復(fù)制[4]。 而此時“圣保羅病人”的出現(xiàn),給通過藥物治療實(shí)現(xiàn)艾滋病功能性治愈帶來了希望。 Jon[5]通過施行“shock and kill”這一策略,在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy, ART)治療同時,服用了煙酰胺(NAM),用來激活病毒潛伏庫,在停藥后一年時間內(nèi)都未出現(xiàn)病毒反彈。 這一結(jié)果顯然是具有積極意義的。 NAM 作為維生素B3 的酰胺化合物[6],其生物安全性較高,如果可以作為病毒潛伏感染激活劑,將是非常好的選擇。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級中國恒河猴6 只,體重5~10 kg,年齡5~8歲,2 只雌性,4 只雄性,購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所[SCXK(京)2015-0011]。 實(shí)驗(yàn)動物流程操作經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審批(XJ19007、XJ19003),在本單位生物安全三級實(shí)驗(yàn)室[SYXK(京)2017-0027]進(jìn)行,嚴(yán)格遵守3R 原則。 6 只恒河猴中除1 只正常恒河猴外,其余5 只均曾感染SIV 或SHIVSF162P3,目前血漿病毒載量呈陰性。

1.1.2 細(xì)胞SIV/SHIVSF162P3感染恒河猴和正常恒河猴的外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMC)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 潛伏感染激活劑

NAM(Cat.N0636)、Prostratin(Cat.P0077)和PHA-P(Cat.L1668)購自sigma 公司;GS-9620(Cat.S7221)購自selleck 公司;IL-2(Cat.202-IL-050)購自R&D 公司。

1.2.2 抗體

使用抗體詳細(xì)信息見表1。

表1 抗體一覽表Table 1 List of antibodies

1.2.3 其他試劑

CCK8 試劑盒(Cat.C0038)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Cat.P0010)和BeyoGelTMPlus PAGE 預(yù)制膠(Tris-Gly, 4%~15%, 10 孔)(Cat.P0645S)購自碧云天公司;CD4+T Cell Isolation Kit(Cat.130-092-144)和LS 柱(Cat.130-042-401)購自Miltenyi Biotec公司;PMSF(Cat.P0100)、高效RIPA 組織裂解液(Cat.R0010)購自索萊寶公司。

1.2.4 儀器

美國BD FACS AriaⅡ分選型流式細(xì)胞儀;美國BD Accuri C6 Flow Cytometry 流式細(xì)胞儀;美國ABI 7500 Real time PCR 儀;美國Bio-Rad PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀和ChemiDocTMXRS+成像儀;日本Nicon TS100 顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC 的分離

采集EDTA 抗凝的猴外周血,利用Ficoll 分離PBMC,計數(shù),備用[7]。

1.3.2 CCK8 法測定藥物對細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(CC50)

藥物用DMSO 溶解,然后稀釋到起始工作濃度。 NAM 為200 mmol/L,Prostratin 為500 μmol/L,GS-9620 為48.6 μmol/L。 然后分別用10%胎牛血清RPMI 1640 生長液進(jìn)行10 倍系列稀釋,即原倍、1 ∶10、1 ∶100……,共8 個濃度,每個濃度4 個復(fù)孔,每孔100 μL。 每孔再加入100 μL 濃度為每毫升1×107PBMC 細(xì)胞懸液,37℃、5% CO2培養(yǎng)。 3 d 后,每孔加入10 μL CCK8 溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2.5 h,測定吸光(A) 值,計算細(xì)胞存活率,即:Cell viability(%) = (A實(shí)驗(yàn)-A空白)/(A對照-A空白) ×100%[8-9];其中,A空白孔含培養(yǎng)基和CCK8,A對照孔含細(xì)胞、CCK8,A實(shí)驗(yàn)孔含細(xì)胞、CCK8、NAM 溶液[8-9]。 用Graphpad Prism 8.0 計算藥物的CC50,以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)安全用藥濃度。

1.3.3 CCK8 法測定細(xì)胞生長曲線

利用1 mmol/L NAM 處理PBMC,分別在0、2、4、6、8、10 d 利用CCK8 檢測吸光(A) 值,4 個復(fù)孔。觀察細(xì)胞增殖情況,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時間[10]。

1.3.4 CD4+T 細(xì)胞的分選

取出所需數(shù)量的PBMC,加入CD4+T cell Biotin Antibody cocktail,4℃孵育10 min。 加入Anti-Biotin Microbeads,4℃孵育15 min,然后將LS 柱吸附于MACS 分選器上,將細(xì)胞過柱進(jìn)行分選。

1.3.5 不同組合的潛伏感染激活劑刺激細(xì)胞

將分選得到的CD4+T 細(xì)胞,用10%胎牛血清RPMI 1640 生長液稀釋為每毫升2×106個細(xì)胞,每孔加入500 μL。 之后加入稀釋好的潛伏感染激活劑500 μL,同時設(shè)立不加潛伏感染激活劑的空白對照。最終藥物濃度分別為:NAM (1 mmol/L) 、PHA(4 μg/mL ) 、 IL-2 ( 20 ng/mL ) 、 GS-9620(24.3 μmol/L) 、Prostratin (250 nmol/L) 。 培養(yǎng)時間為6 d。 第6 天收取細(xì)胞培養(yǎng)上清,測定病毒載量。 此外,在0、2、4、6 d 收取細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)的流式實(shí)驗(yàn)。 另外,NAM 刺激2 d 后,收取細(xì)胞,Western blot 檢測CD4+T 細(xì)胞核內(nèi)抗原SIRT1 的表達(dá)。

1.3.6 病毒載量的測定

從上清中提取病毒RNA,使用Real time RTPCR 法測定病毒載量[11]。

1.3.7 流式方法檢測CD4+T 細(xì)胞表面活化分子的變化[7]

在流式管管底加入細(xì)胞,然后加入CD69-BV421、CD3-BV605、CD38-FITC 、CD4-BV785、HLADR-BV510,4℃孵育30 min 后,1%多聚甲醛固定20 min,PBS 重懸,過濾,上機(jī)檢測。

1.3.8 流式方法檢測T 細(xì)胞表面CD4、CXCR4 和CCR5 的變化

將NAM 作用后的CD4+T 細(xì)胞加入流式管中,再加入CXCR4-PerCP/Cy5.5、CD3-PE、CCR5-Alexa Fluor? 647、CD4-FITC,4℃孵育30 min 后,PBS 重懸,上機(jī)檢測。

1.3.9 Western blot 檢 測CD4+T 細(xì) 胞 核 內(nèi) 抗 原SIRT1 的表達(dá)

收取NAM 作用2 d 的CD4+T 后,利用RIPA 緩沖液和PMSF (50 ∶1) 提取總蛋白,測濃度。 取20 μg 的待測樣本進(jìn)行PAGE 凝膠電泳,電轉(zhuǎn)于PVDF膜上。 封閉后,加入SIRT1 抗體(1 ∶1500)4℃孵育過夜,之后加入二抗(1 ∶3000;ZB-2305) 室溫下孵育1 h。 內(nèi)參蛋白GAPDH (1 ∶1000) 與SIRT1 蛋白相同條件孵育過夜,之后加入二抗(1 ∶3000;ZB-2301) 室溫下孵育1 h[12]。 增強(qiáng)發(fā)光法顯色,ImageJ軟件獲取圖像。 蛋白表達(dá)量=蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

流式實(shí)驗(yàn)分別使用BD Arial Ⅱ和BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品分析,利用Flowjo 10 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理;本研究所有數(shù)據(jù)采用Graphpad 8. 0 進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,ns 為P>0.05,表示無統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.05、P<0.01、P<0.001,表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 NAM 對細(xì)胞活力的影響

正常猴PBMC 經(jīng)不同濃度的NAM 刺激3 d 后,細(xì)胞存活率出現(xiàn)了不同程度的變化。 NAM 濃度≤1 mmol/L 時,其細(xì)胞存活率均在80%以上,而當(dāng)NAM濃度≥10 mmol/L 時,細(xì)胞存活率急速驟降至20%以下(圖1A),計算得到NAM 的CC50為4.01 mmol/L,選定最大無毒濃度1 mmol/L 進(jìn)行后續(xù)刺激實(shí)驗(yàn)。

利用1 mmol/L NAM 刺激PBMC 后,每2 d 檢測細(xì)胞生長情況。 對照組和NAM 組細(xì)胞增殖變化趨勢基本一致,在2 d 內(nèi)都有一個升高的過程,之后開始緩慢下降。 可以看出,1 mmol/L NAM 在6 d內(nèi),對細(xì)胞增殖無抑制作用,且NAM 組與對照組比較,在2、4、6 d 增長幅度分別提高了(4.00 ±0.11)%、(22.15±0.10)%、(13.30±0.15)%。 在第6 天后,細(xì)胞生長狀況逐漸變差(圖1B)。

2.2 不同潛伏感染激活劑對SIV/SHIV 感染猴外周血CD4+T 細(xì)胞中潛伏病毒的激活效果比較

感染猴在不同時間多次采集外周血,分離CD4+T 細(xì)胞,經(jīng)不同組合的潛伏感染激活劑作用后,部分樣本培養(yǎng)上清中病毒載量檢測呈陽性。 與此同時,所有樣本中不加潛伏感染激活劑的對照檢測均為陰性,即上清中沒有檢測到病毒。 其中,PHA+IL-2組陽性率最低,只有2 個病毒載量檢測陽性,為14.29%,NAM 單藥組為28.57%,Prostratin 單藥組為35.71%,GS-9620 單藥組最高,達(dá)到71.43%。NAM 和其他3 種潛伏感染激活劑聯(lián)合組中,NAM+Prostratin 組和NAM+GS-9620 組與Prostratin 組和GS-9620 單藥組的陽性率一致,而NAM+PHA+IL-2組陽性率則提高到35.71%,明顯高于兩個單藥組28.57%和14.29%的陽性率。 各組之間陽性率進(jìn)行卡方檢驗(yàn),有顯著性差異(P<0.001)(表2)。

注:A:PBMC 經(jīng)不同濃度的NAM 作用3 d 后細(xì)胞存活率的變化;B:1 mmol/L NAM 刺激PBMC 后,不同時間細(xì)胞存活率的變化。圖1 NAM 對PBMC 存活率的影響(n=4)Note. A,Changes in viability after treated with different concentrations of NAM for 3 d.B,Changes in viability at different times after treated with 1 mmol/L NAM.Figure 1 Changes of survival rate of PBMC treated with NAM

表2 潛伏感染激活劑組陽性率比較Table 2 Comparison of positive rate of latency-reversing agent group

所有樣本經(jīng)不同潛伏感染激活劑作用后,上清中的載量通常在102~104copies/mL 之間。 其中,PHA+IL-2 組病毒載量平均值最低,為1.64E+02 copies/mL,NAM 單藥組為2.38E+02 copies/mL,Prostratin 單藥組為4.02E+02 copies/mL,GS-9620單藥組最高,達(dá)到9.85E+02 copies/mL。 NAM 和其他3 種潛伏感染激活劑聯(lián)合組中,NAM+Prostratin組與和Prostratin 組相比變化不大,其余兩組與單藥組比都有不同程度的升高。 PHA+IL-2 組載量均值為1.64E+02 copies/mL,而NAM+PHA+IL-2 組提高到4.12E+02 copies/mL;GS-9620 組載量均值為9.85E+ 02 copies/mL,NAM +GS-9620 組提高到2.12E+03 copies/mL(圖2)。

2.3 NAM 對CD4+T 細(xì)胞活化的影響

正常猴PBMC 經(jīng)刺激后,流式結(jié)果顯示:對照組和NAM 組CD4+T 細(xì)胞在培養(yǎng)6 d 內(nèi),活化分子CD69、CD38 和HLA-DR 的表達(dá)量及變化趨勢基本一致,僅NAM 組CD38 在第2 天的表達(dá)量略高于對照組,對照組(53.53±2.96)%,NAM 組(59.6±0.37)%。 PHA+IL-2 可刺激T 細(xì)胞活化,作為T細(xì)胞活化標(biāo)志物的陽性對照組。 樣本經(jīng)PHA+IL-2 刺激后CD69、CD38、HLA-DR 表達(dá)量均有明顯上調(diào)(圖3A)。

將作用2 d 的CD4+T 細(xì)胞表面活化分子的表達(dá)量進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn),NAM 組與對照組3 個活化分子CD69、CD38 和HLA-DR 的表達(dá)量對比,均無統(tǒng)計學(xué)差異,PHA+IL-2 組與對照組對比皆有顯著性差異,其中,CD69 的表達(dá)量差異性P<0.01,CD38 的表達(dá)量差異性P<0.01,HLA-DR 的表達(dá)量差異性P<0.001(圖3B)。

注:與對照組相比,?P<0.05。圖2 不同潛伏感染激活劑對SIV/SHIV 感染猴外周血CD4+T 細(xì)胞中潛伏病毒的激活效果比較(n=14)Note. Compared with Control group,?P<0.05.Figure 2 Comparison of reactivation effect on latent reservoir in CD4+T cells from SIV/SHIV-infected maceques by different LRAs

注:A:作用不同時間,CD4+T 細(xì)胞表面活化分子CD69、CD38 和HLA-DR 表達(dá)量的變化;B:作用2 d 后,CD4+T 細(xì)胞表面活化分子CD69、CD38、HLA-DR 表達(dá)量的差異分析。 與對照組相比,??P<0.01, ???P<0.001。圖3 NAM 對CD4+T 細(xì)胞表面活化分子CD69、CD38 和HLA-DR 的影響(n=3)Note. A, Expression levels of CD69, CD38 and HLA-DR on the surface of CD4+T cells after treated with NAM. B, Comparison of expression levels treated with NAM and PHA+IL-2. Compared with Control group,??P<0.01, ???P<0.001.Figure 3 Changes of activated T cell surface marker CD69, CD38 and HLA-DR on CD4+T cell after treated with NAM

2.4 NAM 對CD4+T 細(xì)胞表面輔助受體CXCR4、CCR5 表達(dá)的影響

對正常猴PBMC 作用2 d 后,陰性對照組、NAM組和Prostratin 組CXCR4 表達(dá)量分別為(25.03±0.19)%、(27.33±0.78)%、(7.58±0.56)%;CCR5表達(dá)量分別為(5.00±0.37)%、(5.66±0.79)%、(0.31±0.05)%。 與對照組相比,Prostratin 顯著下調(diào)輔助受體CXCR4、CCR5 的表達(dá)(P<0.001),而NAM 組均稍高于對照組。 其中,CXCR4 的表達(dá)量的增加具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖4)。

圖4 NAM 對CD4+T 細(xì)胞表面輔助受體表達(dá)情況的影響(n=3)Figure 4 Effects of co-receptor on CD4+T cells treated with NAM

2.5 NAM 對CD4+T 細(xì)胞核內(nèi)抗原SIRT1 表達(dá)量的影響

正常猴CD4+T 細(xì)胞經(jīng)NAM 作用2 d 后,SIRT1蛋白表達(dá)量明顯下降(圖5A),為對照組表達(dá)量的(46.85±22.50) %。 與對照組相比,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖5B)。

圖5 NAM 對CD4+T 細(xì)胞中SIRT1 的表達(dá)量的變化(n=3)Figure 5 Effects of NAM on SIRT1 expression in CD4+T cells

3 討論

煙酰胺(NAM),是維生素B3 的酰胺化合物,其生物安全性較高,體外利用NAM 激活HIV 潛伏庫,顯示出較好的病毒激活效果[13]。 臨床實(shí)驗(yàn)中,Diaz 團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)在ART 治療同時,加服NAM 的5 名艾滋病患者之一,即“圣保羅病人”,在停藥后,病毒反彈延遲了66 周,這說明煙酰胺可能激活潛伏庫細(xì)胞的病毒表達(dá),而當(dāng)這些細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒時,就會發(fā)生凋亡或者被宿主免疫系統(tǒng)殺傷,從而減小了潛伏庫,進(jìn)而延遲了病毒反彈[5,14]。

本研究嘗試?yán)貌《据d量持續(xù)陰性的感染猴的CD4+T 細(xì)胞來研究NAM 對病毒潛伏庫的激活作用[15-16]。 研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)NAM 刺激后,病毒潛伏庫一定程度上被激活。 雖然相較于成熟的TLR7 激動劑GS-9620[17],激活效果還有差距,但NAM 和GS-9620聯(lián)用,能夠更大程度地激活病毒潛伏庫,提高培養(yǎng)上清中的病毒載量水平。 NAM+PHA+IL-2 組相比NAM 組和PHA+IL-2 組,也能看到類似的協(xié)同效應(yīng)。

在激活病毒潛伏庫的同時,NAM 并沒有引起T細(xì)胞的廣泛活化,提示其具有較好的安全性。 目前的潛伏感染激活劑中,一些激活劑,如PKC 激動劑,由于具有廣泛的非特異性T 細(xì)胞活化,可引起機(jī)體的不良反應(yīng),從而使得其難以在臨床應(yīng)用[18]。 此外,某些激活劑,如Prostratin 可通過下調(diào)CD4、CXCR4 以及CCR5 的表達(dá)來增強(qiáng)抗病毒活性[19]。NAM 對CCR5 的表達(dá)沒有影響,只略微上調(diào)CXCR4的表達(dá),這需要在應(yīng)用過程中加以注意。

關(guān)于NAM 激活潛伏庫細(xì)胞病毒表達(dá)的機(jī)制,尚未見報道。 目前,潛伏感染激活劑的藥物,主要有以下幾種類型:TLR7 激動劑、組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)、 甲基化酶抑制劑(MTi)、蛋白酶C 激活劑(PKC)、T 細(xì)胞激活劑等。 其中,HDACi 研究較為廣泛。 SIRT1 屬于HDAC Ⅲ類家族,兼有組蛋白和非組蛋白去乙酰化酶活性[20-21]。 有文獻(xiàn)證實(shí),當(dāng)SIRT1 被抑制后,去乙?；饔脤艿揭种?從而導(dǎo)致NFκB 持續(xù)活化[22],進(jìn)而活化T 細(xì)胞激活HIV 基因組表達(dá)[23]。 NAM 是SIRT1 的抑制劑[24-25],而這也可能是NAM 激活潛伏庫病毒表達(dá)的機(jī)制,但NAM 激活病毒潛伏庫的表達(dá)是否還有其他的作用機(jī)制,仍需進(jìn)一步研究。