余雯惠楊晨波叢喆薛婧

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室,北京 100021)

程序性細胞死亡蛋白(programmed cell death protein,PDCD)是一類與程序性細胞死亡相關(guān)的蛋白質(zhì)分子,普遍存在于各種生物體內(nèi),是維持正常生長所必需的[1]。 其中程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)在艾滋病領(lǐng)域研究較廣泛。 多項研究表明HIV-1 感染者體內(nèi)T細胞上高表達PD-1 分子[2-4],大量PD-1 的表達能抑制HIV-1 感染者T 細胞的功能,使其功能衰竭,增殖能力降低,從而促進了疾病進展[5]。 目前PD-1還被認為可能是HIV-1 潛伏庫的標(biāo)志物[6-7],在HIV-1 潛伏庫的建立和維持中起一定的作用,因此PD-1 也被認為是一個潛在的治療靶點[8-9]。

除PD-1 以外,其他程序性細胞死亡蛋白在HIV-1 中的研究較少。 程序性細胞死亡蛋白2(programmed cell death protein 2,PDCD2)又稱為RP8,該基因表達一種高度保守的真核蛋白[10-11],在人體的多種組織中都有表達。 PDCD2 目前被認為在促進細胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[12-14],也有研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)控細胞增殖[15]、抑制腫瘤細胞生長[13]以及維持胚胎干細胞發(fā)育[16-17]等多種細胞功能中有一定的作用。 本研究中,我們對PDCD2 能否調(diào)節(jié)T 細胞及HIV-1 潛伏感染T 細胞的凋亡水平進行了初步探索,以期為HIV-1 潛伏感染細胞的清除提供一個新的方向和實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞

人胚腎細胞系293T(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所本實驗室保存);T 淋巴細胞株Jurkat(ATCC);HIV 潛伏感染T 細胞株ACH2(中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心馬麗英研究員饋贈)。

1.2 主要試劑與儀器

Anti-PDCD2 antibody [ EPR7159 ] ( Cat.ab126614) 購自Abcam;PDCD2 Antibody(Cat.LSC169493) 購 自LSBio;β-Tubulin (D2N5G) Rabbit mAb(Cat.15115)購自Cell Signaling Technology;PEAnnexin V Apoptosis Detection Kit 1(Cat.559763)購自BD Pharmingen 公司; TRAIL/Apo2L Protein,Human(Cat.HY-P7306)購自MCE 公司;pWPXL、pMD2.G、psPAX2 慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(由Dr. Didier Trono 饋贈);轉(zhuǎn)染試劑-VigoFect(Cat.T001)購自Vigorous 公司;聚乙烯感染/轉(zhuǎn)染試劑(Cat. TR-1003)購自Sigma-Aldrich 公司;人/猴PDCD2 全長質(zhì)粒購自金斯瑞生物科技公司;PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Cat. RR037A)、TB Green Premix EX TaqTM(Cat.RR820A)購自TaKaRa 公司;TaqManTMRNA-to-CTTM1-步法試劑盒(Cat. 4392938) 購自Applied Biosystems 公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit(Cat.52906)購自QIAGEN 公司。 熒光定量PCR 儀7500 型購自ABI 公司;熒光倒置顯微鏡Nikon ECLIPSE Ti 購自Nikon 公司;化學(xué)發(fā)光成像儀ChemiDoc XRS+購自Bio-rad 公司;流式細胞儀BD Accuri C6 購自BD 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 慢病毒包裝及感染Jurkat、ACH2 細胞

將慢病毒包裝質(zhì)粒pWPXL、pMD2.G、psPAX2以2 ∶1 ∶2的比例與VigoFect 溶液配置成轉(zhuǎn)染工作液。 將該工作液逐滴加入293T 培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)6~8 h 后更換新鮮培養(yǎng)基,再繼續(xù)培養(yǎng)36 h。 收集的上清與新鮮的完全培養(yǎng)基1 ∶1混合后,用于感染Jurkat 及ACH2 細胞,12 h 后更換新鮮培養(yǎng)基,此步驟重復(fù)兩次后收集細胞用于后續(xù)實驗。 PDCD2(H)及PDCD2(RM)表示過表達人/猴PDCD2 的穩(wěn)定細胞株。

1.3.2 RT-PCR 檢測細胞內(nèi)PDCD2 mRNA 的表達水平

收取2×106個細胞并提取其RNA。 根據(jù)NCBI上人和猴PDCD2 基因和GAPDH序列,利用軟件DNAMAN 進行PDCD2 和GAPDH引物的設(shè)計。 引物序 列 為: PDCD2-F: 5’-ACCCTAGACTGGAGATT GGGACATA-3’;PDCD2-R:5’-CAACCTCAGGCATA ATCTCATCTTC-3’; GAPDH-F:5’-CTGTTCGAGAG TCAGCCGCA-3’;GAPDH-R:5’-AGGCGCCCAATAC GACCAAA-3’。 數(shù)據(jù)結(jié)果通過2-ΔΔCt法進行計算。

1.3.3 Western blot 檢測細胞內(nèi)PDCD2 蛋白表達情況

收集5×106個細胞,裂解后取上清液進行電泳、電轉(zhuǎn)及封閉,4℃過夜孵育一抗(Anti-PDCD2),室溫1 h 孵育二抗(β-Tubulin),使用ECL 法曝光,蛋白條帶的相對密度通過ImageJ 軟件進行分析[18]。 同樣分析內(nèi)參。

1.3.4 重組蛋白TRAIL 刺激Jurkat、ACH2 細胞

取生長旺盛的Jurkat 和ACH2 細胞5×105個,加入終濃度為0、25、50、100、150、300 ng/mL 的TRAIL,混勻后置于37℃,5% CO2孵箱中培養(yǎng),24 h后取細胞進行凋亡檢測,最終選擇25 ng/mL 的TRAIL 蛋白濃度用于后續(xù)刺激實驗。

1.3.5 細胞凋亡的檢測

收集5×105個細胞,預(yù)冷的PBS 及1×Annexin V Binding Buffer 洗3 遍后,加入5 μL PE-Annexin V和5 μL 7-AAD,室溫下避光孵育15 min,過濾后流式檢測細胞凋亡情況[19]。 Annexin V 陽性率的總和表示細胞的凋亡率。

1.3.6 細胞上清病毒載量的檢測

取細胞上清提取病毒RNA,使用實時熒光定量PCR 檢測細胞上清病毒載量[20-21]。 探針序列:FAM-5 ’-AAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAA-3 ’-TAMRA; 引 物 序 列: HIV gag-F: 5 ’-GGTGCG AGAGCGTCAGTATTAAG-3’;HIV gag-R:5’-AGCTC CCTGCTTGCCCATA-3’。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

通過FlowJo V10 對細胞凋亡流式的數(shù)據(jù)進行分析,各項數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與作圖選用GraphPad Prism8軟件,平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來表示實驗結(jié)果,P<0.05 為界限值,表示組間數(shù)據(jù)有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TRAIL 對Jurkat 及ACH2 細胞凋亡的影響

Jurkat 細胞在沒有TRAIL 刺激條件下,凋亡率為(1.29±0.53)%,隨著TRAIL 濃度的增加,凋亡率也逐漸增高。 從25 ng/mL 的(38.86±4.83)%逐漸增加至300 ng/mL 時的(49.44±4.79)%(圖1A)。ACH2 細胞在上述不同濃度的TRAIL 刺激下,凋亡率變化與Jurkat 細胞一致,分別為(1.83±0.25)%、(16.14 ± 0.69)%、 (16.36 ± 0.78)%、 (16.10 ±0.63)%、(16.09±1.57)%、(15.79±0.67)%(圖1B)。 最終確定使用25 ng/mL 的TRAIL 用于后續(xù)實驗。

注:A:不同濃度的TRAIL 刺激24 h 后,Jurkat 細胞凋亡水平的變化;B:不同濃度的TRAIL 刺激24 h 后,ACH2 細胞凋亡水平的變化。圖1 不同濃度的TRAIL 誘導(dǎo)Jurkat 及ACH2 細胞凋亡情況Note. A,Apoptosis rate of Jurkat cells after 24 hours of TRAIL treatment with different concentrations. B,Apoptosis rate of ACH2 cells after 24 hours of TRAIL treatment with different concentrations.Figure 1 Apoptosis of Jurkat and ACH2 cells induced by TRAIL at different concentrations

2.2 過表達PDCD2 的Jurkat 細胞在TRAIL 刺激下凋亡增加

本研究將人PDCD2 和猴PDCD2 成功克隆到pWPXL 載體中,由于pWPXL 載體本身帶有EGFP標(biāo)簽,pWPXL 空載體與病毒包裝質(zhì)粒產(chǎn)生的病毒成功感染Jurkat 細胞(Jurkat-mock)后,可見細胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達,其GFP 的陽性率達98.6%(圖2A)。 在RNA 水平上,與Jurkat 組細胞相比,Jurkat-PDCD2(H) 組及Jurkat-PDCD2(RM) 組細胞內(nèi)PDCD2 mRNA 表達量分別增加了4.67 倍和3.53倍(圖2B)。 在蛋白水平上,PDCD2 相對表達量在Jurkat-PDCD2(H)為1.26±0.07,在Jurkat-PDCD2(RM) 中為1.12±0.39。 Jurkat-PDCD2(H) (P<0.001)與Jurkat-PDCD2(RM)相對表達量顯著高于Jurkat 及Jurkat-mock,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,圖2C)。

在不含刺激劑的情況下,對照組凋亡率為(1.56±0.24)%,Jurkat-PDCD2(H)及Jurkat-PDCD2(RM)細胞凋亡率分別為(1.51±0.22)%、(1.61±0.10)%,3 組細胞間凋亡率無顯著性差異(P>0.05)。 在TRAIL 的刺激下,對照組、Jurkat-PDCD2(H) 及Jurkat-PDCD2(RM) 細胞凋亡率分別為(21.59 ± 1.45)%、 (26.59 ± 0.57)%、 (28.08 ±1.51)%。 與對照組相比,Jurkat-PDCD2(H)組(P<0.05)及Jurkat-PDCD2(RM)組(P<0.01)凋亡率明顯增加,有顯著性差異(圖2D)。

注:A:Jurkat-mock 細胞GFP 表達情況;B:熒光定量PCR 檢測Jurkat、Jurkat-mock、Jurkat-PDCD2(H)、Jurkat-PDCD2(RM)細胞株內(nèi)人/猴PDCD2 mRNA 的表達水平;C:Western blot 檢測Jurkat、Jurkat-mock、Jurkat-PDCD2(H)、Jurkat-PDCD2(RM)細胞株內(nèi)人/猴PDCD2 蛋白表達水平;D:對照組、Jurkat-PDCD2(H)及Jurkat-PDCD2(RM)在有無TRAIL 刺激下的凋亡水平。 與對照組相比,?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001。圖2 Jurkat、Jurkat-mock、Jurkat-PDCD2(H)、Jurkat-PDCD2(RM)細胞株內(nèi)PDCD2 的表達情況及細胞凋亡水平Note. A, Levels of GFP in Jurkat-mock cells. B,Levels of human /macaque PDCD2 mRNA in Jurkat,Jurkat-mock,Jurkat-PDCD2(H) and Jurkat-PDCD2(RM) cells were detected by qPCR. C, Expression levels of human/macaque PDCD2 protein in Jurkat, Jurkat-mock, Jurkat-PDCD2(H)and Jurkat-PDCD2(RM) cells were detected by Western blot. D, Apoptosis rate of Jurkat-PDCD2(H), Jurkat-PDCD2(RM) and the control cells with or without TRAIL treatment. Compared with the control group, ?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001.Figure 2 Expression levels of PDCD2 and apoptosis rate in Jurkat, Jurkat-mock, Jurkat-PDCD2(H) and Jurkat-PDCD2(RM) cells

2.3 過表達PDCD2 的ACH2 細胞在TRAIL 刺激下凋亡增加

本研究再次將克隆有人PDCD2 和猴PDCD2 的pWPXL 空載體與包裝質(zhì)粒產(chǎn)生的病毒成功感染ACH2 細胞(ACH2-mock),該細胞內(nèi)表達有綠色熒光蛋白,其GFP 的陽性率為73.5%(圖3A)。 在RNA 水平上,ACH2-PDCD2(H)組細胞及ACH2-PDCD2(RM)組細胞內(nèi)PDCD2 mRNA 表達量分別比ACH2 組細胞多5.49 倍和4.02 倍(圖3B)。 在蛋白水平上,ACH2-PDCD2(H) 及ACH2-PDCD2(RM)細胞PDCD2 相對表達量為0.68±0.19、0.63±0.16。 與ACH2 及ACH2-mock 細胞相比,ACH2-PDCD2(H)細胞(P<0.01)和ACH2-PDCD2(RM)細胞PDCD2 相對表達量顯著升高,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01,圖3C)。

在不含TRAIL 的情況下,對照組、ACH2-PDCD2(H) 及ACH2-PDCD2(RM) 細胞凋亡率分別為(1.22±0.27)%、(1.41±0.16)%、(1.47±0.25)%,3組細胞間的凋亡率無顯著性差異(P>0.05);在TRAIL 的刺激下,對照組凋亡率為(11.5±0.93)%,ACH2-PDCD2(H)及ACH2-PDCD2(RM)細胞凋亡率為(15.87±1.39)%、(17.81±1.40)%。 與對照組相比,ACH2-PDCD2(H)組(P<0.01)、ACH2-PDCD2(RM)組凋亡率顯著高于對照組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01,圖3D)。 TRAIL 刺激下,ACH2-PDCD2(H)組(P<0.01)與ACH2-PDCD2(RM)組細胞上清HIV病毒載量明顯高于ACH2 組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,圖3E)。

注:A:ACH2-mock 細胞GFP 表達情況;B:熒光定量PCR 檢測ACH2、ACH2-mock、ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)細胞內(nèi)人/猴PDCD2 mRNA 的表達水平;C:Western blot 檢測ACH2、ACH2-mock、ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)細胞內(nèi)人/猴PDCD2 蛋白表達水平;D:ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)及對照組在未刺激及TRAIL 刺激下的凋亡水平;E:熒光定量PCR 檢測未刺激及TRAIL 刺激下ACH2、ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)細胞上清HIV 病毒載量。 與對照組相比,?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001。圖3 ACH2、ACH2-mock、ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)細胞內(nèi)PDCD2 的表達情況及細胞凋亡水平Note. A, GFP expression in ACH2-mock cells. B, Expression levels of human/macaque PDCD2 mRNA in ACH2, ACH2-mock, ACH2-PDCD2(H)and ACH2-PDCD2(RM) cells were detected by qPCR. C, Expression levels of human/macaque PDCD2 protein in ACH2, ACH2-mock, ACH2-PDCD2(H) and ACH2-PDCD2(RM) cells were detected by Western blot. D, Apoptosis rate of ACH2-PDCD2(H), ACH2-PDCD2(RM) and the control cells with or without TRAIL treatment. E, RT-PCR was used to detect viral load in the supernatant of ACH2, ACH2-PDCD2(H) and ACH2-PDCD2(RM) cells stimulated by TRAIL. Compared with the control group, ?P< 0.05, ??P< 0.01, ???P< 0.001.Figure 3 Expression levels of PDCD2 and apoptosis rate in ACH2, ACH2-mock, ACH2-PDCD2(H) and ACH2-PDCD2(RM) cells

3 討論

據(jù)目前文獻報道,PDCD2 在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起重要作用,有研究者認為PDCD2 可以通過激活caspase 通路來促進人髓系白血病細胞的凋亡[12],也有研究者發(fā)現(xiàn)PDCD2 可通過p53 途徑誘導(dǎo)胃癌細胞的凋亡[22]。 本研究中我們發(fā)現(xiàn),在不含刺激劑的情況下,PDCD2 的表達水平不能影響T 細胞的凋亡,但在TRAIL 介導(dǎo)下,PDCD2 的高表達可以有效調(diào)節(jié)T 細胞的凋亡,說明PDCD2 需要在一定的刺激條件下才能充分發(fā)揮其促進T 細胞凋亡的功能。T 細胞是人體重要的免疫細胞,CD4+T 細胞則是艾滋病病毒難以根除的重要潛伏庫細胞之一。 為了探討PDCD2 在HIV-1 潛伏感染T 細胞中的作用,我們利用ACH2 細胞株,構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PDCD2 的HIV-1 潛伏感染T 細胞株,證實了PDCD2 可以促進TRAIL 刺激下HIV-1 潛伏感染細胞的凋亡以及HIV病毒的釋放,提示PDCD2 在誘導(dǎo)HIV-1 潛伏感染細胞的凋亡及HIV 病毒活化的過程中扮演重要角色。對PDCD2 促進TRAIL 誘導(dǎo)細胞凋亡的作用通路及其調(diào)控分子進行深入研究,有助于了解HIV-1 潛伏感染細胞凋亡的作用機制,為尋找清除病毒潛伏庫的方法和策略提供理論依據(jù)。

人和恒河猴的PDCD2 在CDS 序列上有21 個堿基的差異,共引起12 個氨基酸的改變。 本研究還比較了人和猴這兩種生物PDCD2 在T 細胞株中的表達和誘導(dǎo)凋亡情況。 本研究中分別構(gòu)建了人PDCD2-Jurkat/ACH2 和 猴PDCD2-Jurkat/ACH2 穩(wěn)定細胞株,qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示人和猴PDCD2 的表達量基本相同,在人和猴PDCD2 表達量基本一致的情況下,它們的表達增高均可以促進TRAIL 刺激下T 細胞的凋亡,且兩者介導(dǎo)的凋亡無顯著差異。 這些結(jié)果說明,盡管人和猴的PDCD2 在氨基酸序列上存在一定差異,但這些差異不影響PDCD2 的表達和其介導(dǎo)的T 細胞凋亡。 綜上,人和猴PDCD2 對T 細胞及HIV-1 潛伏感染T 細胞的凋亡均具有促進作用。