周麗桂謝清華鞏淼淼張永斌?師長宏?

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,廣州 510405;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,西安 710032;3.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西 延安 716000)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性發(fā)病率居第二位的腫瘤,其死亡率位居第五位[1]。 早期的激素依賴性前列腺癌(hormone-dependent prostate cancer,HNPC) 經(jīng)過雄激素剝奪療法治療(androgen deprivation therapy,ADT)后,大部分患者從中受益[2]。然而經(jīng)過一段時間后,絕大多數(shù)PCa 患者病情會復(fù)發(fā),進展為去勢抵抗性PCa (castration-resistant prostate cancer,CRPC)[3],甚至轉(zhuǎn)化為更為難治的神經(jīng)內(nèi)分泌 PCa (neuroendocrine prostate cancer,NEPC)[4]。 PCa 的高度異質(zhì)性是造成其臨床治療效果不佳的重要原因。 因此,尋找廣譜的、可用于不同臨床階段的藥物對于PCa 的治療研究具有重要意義。

藤黃酸(gambogic acid,GA)是從藤黃科植物藤黃樹分泌的干燥樹脂中提取的最主要成分,具有多種生物活性,如抗癌、抗氧化、抗炎等[5]。 大量研究表明,GA 可以抑制多種癌細胞的生長,包括慢性髓性白血病[6]、胰腺癌[7]、乳腺癌[8]、肝癌[9]、肺癌[10]等。 已有研究表明,GA 可誘導(dǎo)PTEN-/-/p53-/-前列腺癌細胞和LAPC-4 細胞的凋亡[11]以及抑制PC3細胞體外侵襲[12]和血管生成[13]。 然而,目前有關(guān)GA 對不同表型PCa 細胞的作用效果的研究報道較少。 因此,本研究旨在將GA 作用于雄激素受體(androgen receptor,AR)陽性(AR+)的具有HNPC特征的LNCaP 細胞、AR+的具有CRPC 特征的22RV1 細胞以及AR 陰性(AR-)的具有NEPC 特征的PC3 細胞,研究其對不同表型PCa 細胞是否具有廣泛的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

人PCa 細胞系LNCaP、22RV1、PC3 購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,培養(yǎng)基為含有10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 待細胞密度達到80%~90%時,使用0.25%胰酶消化進行傳代培養(yǎng)。

1.1.2 實驗動物

SPF 級6 周齡雄性BALB/c 裸鼠18 只,體重24~26 g,購自成都藥康生物科技有限公司[SCXK(川)2020-034],飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心屏障設(shè)施內(nèi)[SYXK(陜)2017-001],環(huán)境溫度23℃~25℃,相對濕度40%~60%,12 h/12 h 晝夜交替,飲用水經(jīng)高壓滅菌處理,動物自由攝食和飲水。本研究通過空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利倫理委員會審核(IACUC-20211205),遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

藤黃酸(S2448)和恩雜魯胺(S1250)購自美國Selleckchem 公司;一抗:AR 兔抗(ab108341)購自美國Abcam 公司,Cleaved caspase-3 兔抗(9661)和Bcl-2 鼠 抗( 15071) 購 自 美 國 Cell Signaling Technology 公司,β-actin 鼠抗(AT0001)購自美國Engibody 公司;二抗:山羊抗兔(E-AB-1003)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,山羊抗鼠(EF0001)購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司;RPMI-1640(美國Sigma 公司);FBS 和0.25%胰酶(美國Gibco 公司);細胞增殖和毒性檢測試劑盒(CCK8)和Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司);總RNA 提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光PCR 試劑盒(日本TaKaRa 公司);RIPA 裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);BCA 蛋白檢測試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司);蛋白酶抑制劑(北京索萊寶科技有限公司);SDS-PAGE 試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司);ECL 發(fā)光液(美國Millipore 公司)。 梯度PCR 儀(德國Eppendorf 公司);熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司);流式細胞儀(貝克曼,美國BD 公司);CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus 公司);多功能成像儀(美國Syngene 公司);多功能微孔板檢測儀(美國BioTek 公司);電泳儀(美國Bio-Rad 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞增值和毒性實驗

將人PCa 細胞LNCaP、22RV1、PC3 以5000 個細胞/孔的密度接種于96 孔板中,并在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。 待細胞貼壁后,分別用指定濃度的恩雜魯胺(enzalu tamide, Enz)、GA 處理細胞48 h,DMSO(0.1%)和培養(yǎng)基分別作為載體和空白對照。 每孔加入10 μL CCK8 試劑后37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h,然后在微孔板檢測儀450 nm處讀取吸光度值以測定細胞活力。

1.3.2 qRT-PCR

藥物處理細胞24 h 后,使用總RNA 提取試劑盒分別提取各組細胞樣本的總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后將各組樣本的cDNA 進行實時熒光定量PCR。 引物序列如表1 所示,以β-actin為內(nèi)參基因,根據(jù)公式2-ΔΔCT計算各組基因的相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.3 Western blot

藥物處理細胞24 h 后收集細胞,用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液裂解細胞。 使用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白濃度并按每孔20 μg 蛋白進行蛋白定量。 然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入一抗AR(1 ∶1000)、Cleaved caspase-3(1 ∶1000)、Bcl-2(1 ∶1000)和β-actin(1 ∶2000)4℃搖床過夜;TBST洗滌3 次后加入相應(yīng)的二抗(山羊抗兔1 ∶4000、山羊抗鼠1 ∶4000)室溫孵育2 h,顯影并拍照保存。 采用Image J 圖像分析軟件進行灰度比分析。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

藥物處理細胞24 h 后收集各組細胞,分別用PBS 和buffer 溶液洗滌細胞后棄上清,加入FITC 溶液室溫避光孵育15 min,加入PI 溶液4℃孵育5 min,30 min 內(nèi)檢測細胞凋亡情況。

1.3.5 異種移植模型

將5×106個PC3 細胞接種于裸鼠右側(cè)背部皮下,待腫瘤體積長至30~100 mm3時,將荷瘤鼠隨機分為3 組:Control 組、Enz 組和GA 組,每組6 只。 分別用載體(2% DMSO、40% PEG300、2% Tween 80 和56% ddH2O,ip,2 d 1 次)、Enz(30 mg/kg,ig,2 d 1 次)和GA(3 mg/ kg,ip,2 d 1 次)處理荷瘤鼠2周,藥物處理期間測量小鼠腫瘤體積變化。 通過公式:(長×寬2)/2 計算腫瘤體積。 2 周后腫瘤異種移植物被移除、稱重、固定、凍存。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 18.0 軟件完成數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以平均數(shù)±標準差(±s)表示符合正態(tài)分布的計量資料。對符合正態(tài)分布的多組資料采用單因素方差分析進行比較。 若滿足方差齊性則采用Dunnett-t檢驗或LSD 檢驗進行組間比較,若方差不齊則采用Dunnett’s T3 檢驗進行組間比較。P<0.05 被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GA 抑制不同表型PCa 細胞的增殖和活性

為探索GA 對不同表型PCa 細胞生長的影響,將代表不同PCa 表型的LNCaP、22RV1、PC3 細胞用不同濃度的GA 處理48 h,并選用臨床一線治療藥物Enz 進行對比。 如圖1A 所示,Enz 作用于PCa 細胞具有明顯的選擇性,對AR+的HNPC 細胞LNCaP明顯有效,IC50值為11.15 μmol/L,而22RV1 和PC3細胞均對Enz 具有耐藥性,IC50值分別為67.02、116.9 μmol/L。 與Enz 相比,GA 對PCa 細胞的作用沒有選擇性,它可以廣泛抑制LNCaP、22RV1、PC3 3 種不同表型PCa 細胞的增殖,且起效濃度比較低,IC50值分別為0.49、0.58、0.64 μmol/L。 為進一步評價GA 對PCa 細胞增殖的抑制效果,根據(jù)GA 對PCa 細胞的IC50值結(jié)果選取0、0.25、0.5、0.75 μmol/L 濃度的GA 分別處理細胞24 h,然后檢測細胞增殖標志物Ki67 的表達水平。結(jié)果如圖1B 所示,GA 以劑量依賴性方式抑制不同細胞Ki67 的表達(P<0.05)。 以上結(jié)果表明了GA 可以有效抑制不同表型PCa 細胞的增殖和活性。

2.2 GA 抑制PCa 細胞AR 的表達

AR 一直是臨床治療PCa 患者的主要治療靶點,目前提出的CRPC 分子機制大部分主要是圍繞著AR 表達的改變和AR 信號傳導(dǎo)的失調(diào)[14]。 為明確GA 對PCa 細胞AR 表達的影響,將0、0.25、0.5、0.75 μmol/L 的GA 分別作用于AR+的LNCaP 和22RV1 細胞,使用qRT-PCR、Western blot 分別從mRNA、蛋白水平檢測給藥后AR 的表達情況。結(jié)果如圖2 所示,與對照組相比,0.25 μmol/L 的GA 對LNCaP、22RV1 細胞AR 的表達基本沒有影響,無統(tǒng)計學(xué)差異;但隨著給藥濃度的提高,AR 在mRNA 和蛋白層面的表達逐漸降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 以上結(jié)果表明了GA 可在mRNA 和蛋白水平抑制PCa 細胞AR 的表達。

注:以β-actin 為內(nèi)參基因,以0 μmol/L GA 組為對照組。 A:各個濃度的復(fù)孔數(shù)量n= 6;B:各組的重復(fù)次數(shù)n= 3。 與對照組相比,?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001。圖1 GA 抑制不同表型PCa 細胞的增殖和活性Note. β-actin was used as reference gene, and 0 μmol/L GA group was used as control group. A, Number of multiple pores at each concentration,n=6. B, Number of repeats in each group, n=3. Compared with control group, ?P<0.05, ??P<0.01, ???P<0.001.Figure 1 GA inhibited the proliferation and activity of PCa cells with different phenotypes

2.3 GA 誘導(dǎo)22RV1、PC3 細胞的凋亡

為探究GA 誘導(dǎo)PCa 細胞死亡的能力,我們將0、0.25、0.5、0.75 μmol/L 的GA 作用于22RV1、PC3 細胞24 h 后,使用Annexin V-PI 雙染法通過流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。 我們發(fā)現(xiàn)0~0.75 μmol/L 的GA 作用于PC3 細胞后,細胞未見有明顯的凋亡趨勢,因此我們進一步將GA 作用于PC3 細胞的濃度調(diào)整為0、0.75、1.0、1.25 μmol/L。結(jié)果如圖3A 所示,隨著GA 作用濃度的升高,Annexin+PI-和Annexin+PI+細胞數(shù)量逐漸增加,表明PCa 細胞呈劑量依賴性凋亡。 我們進一步檢測GA 處理后PCa 細胞蛋白水平凋亡通路核心分子Cleaved caspase-3 和Bcl-2 的表達。結(jié)果如圖3B 所示,隨著GA 濃度的提高,PCa 細胞Cleaved caspase-3 的表達顯著增強(P<0.001),抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達明顯下降(P<0.001)。 這些結(jié)果表明GA 可通過影響Cleaved caspase-3 和Bcl-2 的表達誘導(dǎo)PCa 細胞凋亡。

2.4 GA 抑制PCa 細胞PC3 體內(nèi)的生長

有研究表明,在動物體內(nèi)以每2 d 1 次腹腔注射4 mg/kg 的GA 是安全的[15],并以3 mg/kg 每2 d 1 次腹腔注射GA 對雄性裸鼠的體重變化基本沒有影響[16]。 因此,對于GA 我們選取3 mg/kg 以每2 d 1 次腹腔注射的方式進行給藥。 同時,我們以Enz作為陽性對照結(jié)果與GA 的作用效果進行對比。Weyer-Czernilofsky 等[17]發(fā) 現(xiàn) 單 獨 使 用 Enz 30 mg/kg可抑制PC3 異種移植腫瘤的生長且小鼠體重保持平穩(wěn),因此對于Enz 我們選取30 mg/kg 每2 d 1 次灌胃的方式進行給藥。 整個實驗過程中各組小鼠的各項體征保持相對穩(wěn)定,實驗結(jié)果如圖4 所示,GA 顯著抑制了腫瘤的生長。 與Control 組相比,Enz組的腫瘤重量和腫瘤體積雖然有所降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異,而GA 組的腫瘤重量和腫瘤體積顯著降低(P<0.01)。 與En 組相比,GA 組對PC3 異種移植腫瘤的抑制效果更加明顯。

注:以β-actin 為內(nèi)參基因和管家蛋白,以0 μmol/L GA 組為對照組。 與對照組相比,?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001,????P<0.0001。圖2 GA 在mRNA、蛋白層面抑制PCa 細胞AR 的表達(n=3)Note. β-actin was used as reference gene and housekeeping protein,and 0 μmol/L GA group was used as control group. Compared with control group, ?P<0.05, ??P<0.01, ???P<0.001, ????P<0.0001.Figure 2 GA inhibited the expression of AR in PCa cells at mRNA and protein levels

3 討論

藤黃是一味具有消腫、攻毒、祛腐斂瘡、止血、殺蟲等功效的中藥本草,中醫(yī)古籍《不藥良方》和《救生苦海》評價其可“治一切無名腫毒”。 GA 是藤黃中的主要活性成分,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已有報道GA 對人類多種癌癥具有抗腫瘤活性,但GA 對高度異質(zhì)性的PCa 的研究較少。 Enz 屬于AR 拮抗劑,是臨床上治療已擴散或復(fù)發(fā)的晚期CRPC 的一線治療藥物,對PCa 患者具有一定的選擇性,且隨著疾病的進展,獲得性耐藥的產(chǎn)生限制了Enz 的治療效果[18]。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對PCa 細胞具有選擇性的Enz 相比,GA 對分別代表了PCa 進展過程中激素依賴性、去勢抵抗性和神經(jīng)內(nèi)分泌性3 個不同階段的LNCaP、22RV1、PC3 細胞均有明顯的抑制作用,并以劑量依賴性方式降低了PCa 細胞的增殖和活性,表明GA 對PCa 細胞的增殖具有抑制作用。有研究表明,GA 對PTEN-/-/p53-/-PCa 細胞同樣具有很好的抑制作用[11],然而該結(jié)果缺乏體內(nèi)實驗的研究。 在本研究的體內(nèi)實驗中,Enz 在30 mg/kg 的劑量下對難治性PC3 異種移植物具有一定的抑制效果,而GA 組在3 mg/kg 的劑量下已顯著性抑制了腫瘤的生長,相比較Enz 更具有明顯的抑制作用。上述結(jié)果表明GA 有望成為廣譜應(yīng)用于不同表型PCa 的理想治療藥物。

注:以β-actin 為管家蛋白,以0 μmol/L GA 組為對照組。 與對照組相比,???P<0.001,????P<0.0001。圖3 GA 誘導(dǎo)PCa 細胞凋亡(n=3)Note. β-actin was used as housekeeping protein and 0 μmol/L GA group was used as control group. Compared with control group, ???P<0.001, ????P<0.0001.Figure 3 GA induced apoptosis of PCa cells

注:與Control 組相比,??P<0.01;與Enz 組相比,#P<0.05。圖4 GA 抑制PC3 異種移植物體內(nèi)的生長(n=6)Note. Compared with Control group, ??P<0.01. Compared with Enz group, #P<0.05.Figure 4 GA inhibited the growth of PC3 xenograft in vivo

此外,本研究發(fā)現(xiàn)GA 可通過上調(diào)Cleaved caspase-3 蛋白的表達和下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達促進PCa 細胞的凋亡,這與Shi 等[6]的研究結(jié)果一致,明確了GA 誘導(dǎo)PCa 細胞凋亡與線粒體依賴性途徑有關(guān)。 AR 信號在PCa 的發(fā)生發(fā)展過程中具有十分重要的作用,是PCa 的主要驅(qū)動因子和治療靶點[19]。臨床ADT 處理和競爭性AR 抑制劑治療后PCa 進展產(chǎn)生的CRPC,其主要原因也是AR 信號恢復(fù)的結(jié)果[20]。 本研究發(fā)現(xiàn)無論是代表HNPC 還是CRPC的PCa 細胞,GA 均可在mRNA 水平和蛋白水平抑制細胞AR 的表達,說明GA 對PCa 的治療效果與調(diào)控AR 的水平密切相關(guān)。 藤黃具有一定的毒性作用,但GA 可能具有獨特的選擇性抗腫瘤機制。 與正常細胞相比,癌細胞對GA 的治療更為敏感[21]。本研究參照已有的文獻報道,選取3 mg/kg 的安全劑量,每2 d 1 次腹腔注射,取得了良好的治療效果,證實了GA 的有效性[16]。 多項研究表明,GA 具有很好的協(xié)同作用,毒副作用低,可逆轉(zhuǎn)多種癌癥對臨床藥物產(chǎn)生的耐藥性[22-24],因此GA 可能是癌細胞化學(xué)增敏的一種新藥。 研究報道,GA 與Enz或多西他賽在體外聯(lián)合使用對抑制LuCaP136 PDX衍生的類器官培養(yǎng)物的生長具有良好的協(xié)同作用[25],但GA 和Enz 在體內(nèi)聯(lián)合使用的效果尚不明確。 因此,后續(xù)可以在體內(nèi)實驗中驗證GA 與Enz或其他臨床藥物聯(lián)合使用對PCa 的治療效果。

綜上所述,GA 可通過調(diào)控Cleaved caspase-3 和Bcl-2 的表達促進PCa 細胞的凋亡進而抑制腫瘤細胞的生長,并抑制PCa 細胞AR 的表達。 與臨床一線治療藥物Enz 相比,GA 對不同臨床特征的PCa細胞均有治療效果,能廣泛抑制PCa 細胞的增殖和活性,且起效劑量較低。