孫 尚鄒 達趙振達蔣 嬡楊子歡陳龍艇李危石宋純理冷慧杰?

(1.北京大學第三醫(yī)院骨科,北京 100191;2.骨與關節(jié)精準醫(yī)學工程研究中心,北京 100191;3.脊柱疾病研究北京市重點實驗室,北京 100191)

內(nèi)源性雌激素缺乏是導致更年期婦女各種健康問題的重要原因之一[1-2]。 婦女絕經(jīng)后,不僅骨質疏松高發(fā),并且骨關節(jié)炎和椎間盤退變的發(fā)生率也高于同齡的男性[3-5]。 雌激素不僅影響骨組織重建,對關節(jié)軟骨、纖維環(huán)以及髓核組織的代謝同樣有重要的影響。 雌激素缺乏帶來的脊柱病變(椎體骨質疏松和椎間盤退變等)可以導致患者嚴重疼痛和殘疾[6]。 軟骨終板位于椎骨和椎間盤之間,是脊柱重要的組成部分。 軟骨終板可以承擔和分散脊柱壓力,具有防止椎間盤突入相鄰椎骨的重要作用[7]。 除此之外,椎間盤作為無血管組織,營養(yǎng)運輸和物質代謝需要依賴軟骨終板[7]。 軟骨終板的退變會影響椎間盤的正常形態(tài),阻礙椎間盤的營養(yǎng)和代謝,是椎間盤退變的前驅因素[8]。 而椎間盤退變會降低其承重能力和活動性,導致腰痛和坐骨神經(jīng)痛,造成患者的嚴重疼痛和殘疾。 研究軟骨終板的退變機制可能是尋找治療椎間盤退變方法的一把鑰匙,而雌激素缺乏影響軟骨終板退變的影響還有待研究。

多項研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以減輕終板軟骨細胞的變性,并上調(diào)COL-II 以促進軟骨細胞分化[9]。 雌激素可以參與調(diào)節(jié)軟骨細胞的老化,而細胞老化是細胞退變的一個重要標志[10]。 軟骨細胞是軟骨終板的主要細胞類型,軟骨終板退變的過程主要取決于軟骨細胞的變化,而雌激素缺乏時,終板軟骨細胞的變化還未有報道。 本研究探討雌激素缺乏對終板軟骨細胞變化的影響,這有助于幫助人們認識絕經(jīng)婦女軟骨終板退變的機制,并可能為雌激素缺乏引起脊柱疾病提供一種新的治療方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

采用SPF 級6 月齡SD 雌性大鼠40 只,體重為290~320 g,購買自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心[SCXK(京)2021-0013],飼養(yǎng)于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心[SCXK(京)2021-0064]。 大鼠飼養(yǎng)環(huán)境濕度40%~50%,溫度(23±2)℃,12 h 光照/12 h黑暗交替,自由飲食和活動。 實驗動物符合3R 原則,經(jīng)北京大學實驗動物倫理委員會審查(LA2019209),符合動物倫理。

1.2 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛溶液(中國Servicebio 公司,批號:CR2106101);EDTA 脫鈣液(中國Coolaber 公司,批號:SL31131120);兔抗大鼠collagen II(美國Abcam公司,批號:GR3395339-1);DMEM 低糖培養(yǎng)基(美國Hyclone 公司,批號:AG29820714);胎牛血清(中國美侖公司,批號:J0101A);CCK-8 檢測試劑盒(日本同仁公司,批號:TH531);TRIzol(美國Sigma 公司,批號:BCCD7547);DEPC 處理水(中國碧云天公司,批號:R0022);逆轉錄試劑盒(美國Thermo 公司,批號:00987373);SYBR Select Master Mix(美國Applied Biosystems 公司,批號:00722083);戊巴比妥鈉(美國Sigma 公司,批號:20170308)。

石蠟切片機(Lecia,德國)倒置熒光顯微鏡(Nikon,日本);酶標儀(Thermo,美國),實時熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems,美國);Nanodrop 2000C(濱松,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、造模與處理

手術當天測量體重后,隨機選擇分組,20 只為雙側卵巢切除實驗組(OVX),其余20 只為假手術組(SHAM)。 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 進行麻醉。 在大鼠背外側行1.5 cm 的切口來暴露卵巢,在輸卵管或子宮遠端結扎去除兩側完整卵巢組織并閉合傷口。 手術后肌肉注射抗生素(青霉素,40 kU/kg)。 術后第9 周,過量腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)安樂死。 取腰椎組織進行后續(xù)實驗。

1.3.2 提取和培養(yǎng)原代終板軟骨細胞

將腰椎組織浸泡于75%乙醇消毒15 min,在超凈臺內(nèi)分離軟組織,取出軟骨終板,剪碎,使用0.2% II 型膠原酶37℃消化4~6 h,軟骨組織被消化成沫狀,加入完全培養(yǎng)基終止消化后,立即800 r/min 離心5 min,棄上清,加入DMEM 低糖培養(yǎng)基(加入10%胎牛血清+2%雙抗)種于5 cm 培養(yǎng)瓶內(nèi)。 待終板軟骨細胞長滿后,用胰酶消化傳代,采用P2 細胞。

1.3.3 CCK-8 實驗檢測細胞活力

將終板軟骨細胞以5×103密度接種于96 孔板,待細胞貼壁后,避光,以換液形式每孔加入100 μL含CCK-8 增強型溶液的完全培養(yǎng)基,不可產(chǎn)生氣泡,置于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h,使用酶標儀檢測每個孔在450 nm 波長下的吸光度值。

1.3.4 羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色

將終板軟骨細胞以3×104密度置于24 孔板,棄培養(yǎng)基,PBS 洗3 次,每次3 min,加入4%多聚甲醛室溫固定20 min,棄固定液,PBS 洗3 次,每次3 min,按1 ∶200 加入鬼筆環(huán)肽染色液避光室溫孵育1 h,棄染色液,PBS 洗3 次,每次3 min,加入DAPI 染色劑避光孵育3 min 后置于熒光顯微鏡觀察。

1.3.5 COL-II 免疫熒光染色

將終板軟骨細胞以3×104密度置于24 孔板,待細胞長滿后,棄培養(yǎng)基,PBS 洗3 次,每次3 min,加入4%多聚甲醛固定細胞20 min,棄固定液,PBS 洗3 次,每次3 min,加入細胞通透液通透5 min,棄通透液,加入細胞封閉液封閉20 min,棄封閉液,PBS洗3 次,每次3 min,按1 ∶100 加入II 型膠原一抗4℃過夜孵育,棄一抗,PBS 洗3 次,每次3 min,1 ∶200 加入二抗室溫避光孵育1 h,棄染色液,PBS 洗3次,每次3 min,加入DAPI 染色劑避光孵育3 min 后置于熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 RT-qPCR 實驗檢測基因表達

使用TRIzol 從終板軟骨細胞中提取總RNA。RNA 的濃度和純度通過Nanodrop 2000C 測量。 使用逆轉錄試劑盒將1 μg RNA 用于逆轉錄,最終反應體積為20 μL。 ABI QuantStudio5 Q5 實時熒光定量PCR 儀用于實時逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)。 使用2-ΔΔCT方法將終板軟骨基因的相對轉錄水平標準化,例如SOX9、ACAN、ADAMTS-5、MMP-13 和COL-X。 使用GAPDH 為內(nèi)參。 引物序列見表1。

表1 引物設計Table 1 Primer design

1.3.7 COL-II 免疫組化檢測

腰椎標本用10 倍體積的4%多聚甲醛固定。 標本固定后在EDTA 脫鈣液中脫鈣至少4 周。 將脫鈣樣品嵌入石蠟中并切成4 μm 厚的切片。 用COL II抗體在4℃下孵育切片過夜,之后二抗孵育,最后用DAB 顯色。 使用全自動全景掃描儀對切片進行拍照,并使用Image Pro Plus 6 分析軟件進行免疫組化切片的半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差(±s)表示,采用SPSS 24.0 軟件(SPSS,Chicago,美國)進行數(shù)據(jù)分析。 使用t檢驗(1 個變體,兩組)來計算統(tǒng)計差異。P<0.05 具有統(tǒng)計意義。

2 結果

2.1 軟骨終板的COL-II 表達的比較

COL-II 是軟骨組織重要的組成部分。 在術后9周觀察發(fā)現(xiàn),相比較于SHAM 組,OVX 組的軟骨終板的COL-II 表達降低(圖1)。

2.2 終板軟骨細胞形態(tài)及鑒定結果

終板軟骨細胞于5 d 左右從組織塊中爬出,形態(tài)以多角形、梭形為主,以鋪路石樣形態(tài)爬滿瓶底。甲苯胺藍染色可見細胞核呈深藍色,胞質為淺藍色,內(nèi)有少量藍紫色異染顆粒,與軟骨細胞的特征一致[11](圖2)。

注:A:COL-II 在SHAM 組軟骨終板中的表達;B:COL-II 在OVX 組軟骨終板中的表達;C:各組大鼠軟骨終板II 型膠原定量比較。 與SHAM 組相比,?P<0.05。圖1 SHAM 組和OVX 組軟骨終板COL-II 的表達Note. A, Expression of COL-II in cartilage endplates in SHAM group. B, Expression of COL-II in cartilage endplates in OVX group. C,Quantitative comparison of COL-II of cartilage endplates in rats in each group. Compared with SHAM group, ?P<0.05.Figure 1 Expression of COL-II in cartilage endplates between SHAM and OVX groups

注:A:第2 代終板軟骨細胞,為多角形和梭形,呈鋪路石樣排列;B:甲苯胺藍染色顯示胞核為深藍色,胞質為淺藍色。圖2 終板軟骨細胞形態(tài)和鑒定Note. A, Second generation endplate chondrocytes are polygonal and fusiform, arranged like paving stones. B, Toluidine blue staining shows the dark blue nucleus and the light blue cytoplasm.Figure 2 Morphology and identification of endplate chondrocytes

2.3 終板軟骨細胞的細胞活力改變的情況

采用CCK-8 實驗檢測SHAM 組和OVX 組終板軟骨細胞的細胞活力,結果顯示與SHAM 組相比,72 h 內(nèi)不同時間點,OVX 組終板軟骨細胞的活力均顯著低于SHAM 組(圖3)。

注:與SHAM 組相比,????P<0.0001。圖3 SHAM 組和OVX 組大鼠終板軟骨細胞活力的對比Note. Compared with SHAM group, ????P<0.0001.Figure 3 Comparison of the cell viability of endplate chondrocytes between SHAM and OVX group

2.4 OVX 后終板軟骨細胞的細胞骨架F-actin 改變的情況

采用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽進行細胞染色,觀察兩組終板軟骨細胞細胞骨架F-actin 的改變。 實驗發(fā)現(xiàn),OVX 組的終板軟骨細胞中的分布在細胞質膜周圍的F-actin 出現(xiàn)熒光增強,F-actin 的重排加劇,形成較多的應力纖維(圖4)。

2.5 終板軟骨細胞COL-II 改變的情況

COL-II 免疫熒光染色后被熒光波段激發(fā),細胞質出現(xiàn)綠色熒光為陽性。 實驗結果顯示OVX 組熒光強度顯著低于SHAM 組,終板軟骨細胞表達的COL-II 明顯減少(圖5)。

2.6 終 板 軟 骨 細 胞 SOX9、 ACAN、 MMP13、ADAMTS-5 和COL-X 的基因表達

SOX9 和ACAN是代表軟骨細胞合成情況的標志物,MMP13 和ADAMTS-5 是代表軟骨細胞分解代謝的標志物,COL-X是軟骨細胞肥大的代表性標志物。 如圖6 所示,對比SHAM 組,OVX 組的終板軟骨細胞的SOX9 和ACAN表達發(fā)生差異性降低,其合成能力下降;MMP13 和ADAMTS-5表達發(fā)生差異性升高,說明其軟骨細胞外基質降解加劇;COL-X的表達發(fā)生差異性增高,說明肥大鈣化增強。

注:A~C:SHAM 組大鼠終板軟骨細胞F-actin 的表達(F-actin、DAPI、Merge);D~F:OVX 組大鼠終板軟骨細胞F-actin 的表達(F-actin、DAPI、Merge)。圖4 細胞免疫熒光檢測SHAM 組和OVX 組大鼠終板軟骨細胞的F-actin 的表達情況Note. A~C, Expression of F-actin (F-actin, DAPI, Merge) of rats in the SHAM group. D~F, Expression of F-actin (F-actin, DAPI, Merge)of rat endplate chondrocytes in the SHAM group (F-actin, DAPI, Merge).Figure 4 Cellular immunofluorescence detection of expression of F-actin in rat endplate chondrocytes in SHAM and OVX groups

注:A~C:SHAM 組大鼠終板軟骨細胞COL-II 的表達(COL-II、DAPI、Merge);D~F:OVX 組大鼠終板軟骨細胞COL-II 的表達(COL-II、DAPI、Merge)。圖5 細胞免疫熒光檢測SHAM 組和OVX 組大鼠終板軟骨細胞的COL-II 的表達情況Note. A~C, Expression of COL-II in endplate chondrocytes in the SHAM group (COL-II, DAPI, Merge). D~F, expression of COL-II in rat endplate chondrocytes in the SHAM group (COL-II, DAPI, Merge).Figure 5 Cellular immunofluorescence detection of expression of COL-II in rat endplate chondrocytes in SHAM and OVX groups

注:SHAM 組相比,?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001。圖6 對比兩組終板軟骨細胞基因SOX9、ACAN、ADAMTS-5、MMP13 和COL-X 表達Note. Compared with SHAM group, ?P<0.05, ??P<0.01, ???P<0.001.Figure 6 Comparison of the gene expressions of SOX9, ACAN, MMP13, ADAMTS-5 and COL-X in the endplate chondrocytes of the two groups

3 討論

雌激素是一種重要的類固醇激素。 作為一種全身性激素,雌激素可以調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、衰老和死亡,對生育功能、神經(jīng)功能、心血管健康、免疫系統(tǒng)和骨軟骨系統(tǒng)等產(chǎn)生重要作用[12]。 雌激素水平的迅速下降加速了全身器官組織的老化,絕經(jīng)后婦女患相關疾病的概率增大,導致糖尿病、阿爾茨海默癥、肌肉力量下降、骨質疏松和關節(jié)痛等多種病癥[12-15]。 既往研究發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏與軟骨退變息息相關。 雌激素缺乏會抑制關節(jié)軟骨細胞增殖和分化,加速關節(jié)骨-軟骨轉化[16-17]。 雌激素缺乏時終板軟骨細胞的變化還未見報道。 細胞活力是軟骨細胞狀態(tài)與功能的首要體現(xiàn)。 過往的研究中發(fā)現(xiàn)補充雌激素后,生長板軟骨細胞的活力增強[18]。 本研究結果發(fā)現(xiàn),雌激素缺乏會降低終板軟骨細胞的活力,顯示了雌激素在軟骨細胞活力方面作用的一致性。

COL-II 是軟骨終板的主要組成之一,作為軟骨組織含量最豐富的膠原蛋白,其在軟骨終板和髓核的含量對維持正常的椎間盤形態(tài)起到至關重要的作用。 Jiang 等[19]實驗采用6 月齡SD 大鼠進行去卵巢手術,3 個月后發(fā)現(xiàn)OVX 組的COL-II 的表達相較于SHAM 組發(fā)生顯著性減低。 Xiao 等[20]研究發(fā)現(xiàn)8 周C57BL/6J 小鼠OVX 后,12 周后OVX 的COL-II 的表達發(fā)生顯著性降低。 我們的研究采用的是6 月齡SD 大鼠進行去卵巢手術,9 周后觀察到OVX 組的軟骨終板中II 型膠原的表達出現(xiàn)差異性降低。 雖然采用的實驗動物的種類、年齡和處理時間與過往的研究不同,但是實驗結果皆表明雌激素缺乏會顯著性降低軟骨終板組織的II 型膠原流失。Shi 等[18]研究發(fā)現(xiàn),補充雌激素后的生長板軟骨細胞II 型膠原的免疫熒光強度增強,證明其表達增高。 我們的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),OVX 組的終板軟骨細胞的II 型膠原表達降低,這與動物組織染色實驗的結果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)在雌激素缺乏下,終板軟骨細胞骨架F-actin 重排加劇,應力纖維增加,細胞骨架更加紊亂。 細胞肌動蛋白細胞骨架能為細胞遷移提供動力,同時也與細胞間粘附、細胞表面的機械特性和細胞生理學息息相關[21-22]。 細胞間粘附作用可以影響軟骨細胞分化過程,例如,細胞外基質蛋白通過整合素和其他細胞外基質受體發(fā)出的粘附信號影響正常軟骨細胞的增殖和肥大[23-24]。 而肌動蛋白細胞骨架對細胞間粘附有重要作用。 由此可見,肌動蛋白細胞骨架也可對軟骨細胞分化產(chǎn)生重要影響。 除此之外,有研究發(fā)現(xiàn),軟骨細胞的細胞骨架的紊亂會導致其損傷難以修復,有序的細胞骨架有助于軟骨細胞的遷移和修復[25]。 多種刺激可以影響到軟骨細胞的細胞骨架。 促炎因子信號可以促進肌動蛋白聚合或交聯(lián)進而促進應力纖維的形成[26]。 機械刺激會導致軟骨細胞肌動蛋白聚合[27]。 激素也可以調(diào)節(jié)軟骨細胞肌動蛋白,例如,卵泡刺激素可以通過促進其重組來促進軟骨細胞的退變[28]。 我們的研究結果顯示,雌激素缺乏使終板軟骨細胞細胞骨架重排,抑制其分化和遷移,造成軟骨終板的損傷。 其機制是復雜的,可能涉及激素本身、力學傳導信號以及促炎因子信號等多種通路。

本研究發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏后,終板軟骨細胞表型發(fā)生了改變。SOX9 是重要的促進軟骨形成的轉錄因子。 有研究發(fā)現(xiàn)生長板軟骨中的肥大軟骨細胞中SOX9 的表達被抑制,但是在健康關節(jié)軟骨中的永久性軟骨細胞中正常表達[29]。ACAN是終板軟骨細胞的重要組成部分,它和SOX9 是代表終板軟骨細胞合成代謝的重要指標。 我們的研究發(fā)現(xiàn),雌激素缺乏會抑制二者的表達,進而抑制軟骨終板合成。 軟骨終板的MMP13 和ADAMTS-5 會對軟骨終板細胞外基質的降解產(chǎn)生重要影響,二者會導致II型膠原表達的減少和糖胺聚糖的流失[30],除此之外,還會引起X 型膠原的表達增加。 作為軟骨細胞的肥大標志物,X 型膠原的增多已被發(fā)現(xiàn)是軟骨終板發(fā)生鈣化的重要特征之一。 本研究結果顯示,雌激素缺乏會導致終板軟骨細胞MMP13、ADAMTS-5和COL-X的基因表達上調(diào),促進軟骨終板的基質降解和肥大分化。

綜上所述,雌激素缺乏會使終板軟骨細胞活力降低,細胞骨架發(fā)生重排紊亂,抑制終板軟骨細胞合成,促進細胞外基質降解和細胞肥大分化,其中機制有待進一步研究。