徐曉菲

（山東省肥城市畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展服務中心，山東 肥城 271600）

沙門氏菌屬于腸桿菌科，兼性胞內(nèi)致病性革蘭氏陰性菌，是引起急性胃腸炎的主要病原之一。其廣泛分布自然界，存在于家禽、家畜、鼠類等多種動物的腸道，是引起各種家禽和哺乳動物的傳染病的元兇，也可引起人類感染，且該菌在外界環(huán)境中抵抗力較強，是目前世界各國分離率最高的菌型之一，具有重要的公共衛(wèi)生意義[1]。鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠后，可造成小鼠腹瀉、腸道充血等，與人感染鼠傷寒沙門氏菌的臨床癥狀相似，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、厭食、嘔吐、腹痛、腹脹、腹瀉，腹瀉頻繁者可迅速出現(xiàn)脫水和酸中毒[2]?？股氐膹V泛使用，有效地抑制和殺滅了致病性微生物，但由于抗生素的大量使用和濫用導致耐藥性鼠傷寒沙門氏菌的問題越來越嚴重,并在人類和動物群體中廣泛傳播。因此，迫切需要尋找一種抗生素的取代品。

中草藥在我國作為一種藥物使用的歷史源遠流長，中藥中含有復雜有效成分，中藥能夠降低細菌活力、抑制細菌生長、提高機體免疫調(diào)節(jié)功能且毒性較低[3]。所以，中藥已成為去除細菌耐藥性的重要方法之一。目前，在臨床應用上，中藥對細菌性疾病具有較好的治療作用[4]。從唇形科植物黃芩的根莖中提取的黃芩苷具有顯著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、解熱、鎮(zhèn)靜、免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤等藥理作用[5]。因此，本論文通過最小抑菌濃度測定實驗、抑菌圈測定實驗、細菌生物膜實驗等體外試驗檢測黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌活性的影響；通過動物感染試驗，建立鼠傷寒沙門氏菌感染模型，觀察治療效果。通過本次試驗研究，為黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌的臨床應用提供了試驗依據(jù)，具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株鼠傷寒沙門氏菌，為臨床分離株。

1.1.2 主要試劑黃芩苷，含量98 % 以上，購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.1.3 主要溶液和試驗器材LB培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基、生理鹽水、0.1 % 結(jié)晶紫染色液、95 % 乙醇。電子稱、移液槍、離心管、試管、微量加樣器、酒精燈、96孔酶標板、接種環(huán)、鑷子、一次性手套、恒溫搖床、培養(yǎng)皿、注射器針頭、吸管、打孔器、涂菌器、高壓滅菌器等。

1.1.4 試驗動物生長狀況良好，體重18～22 g，小白鼠30只，均由獸醫(yī)預防醫(yī)學實驗室提供。

1.1.5 試驗儀器ELX800酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制（1）LB培養(yǎng)基。每升培養(yǎng)基在950 ml去離子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，搖動容器直至溶質(zhì)溶解，用5 mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至 1 000 ml，115 ℃ 高壓下蒸汽滅菌20 min。（2）LB固體培養(yǎng)基。每升培養(yǎng)基在950 ml去離子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂30 g，搖動容器直至溶質(zhì)溶解，用5 mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1 000 ml，115 ℃高壓下蒸汽滅菌20 min。（3）結(jié)晶紫的配制。用量筒量取100 ml生理鹽水，用電子天平稱取0.1 g結(jié)晶紫，分別倒入棕色瓶中，搖勻，使其充分溶解。配成0.1 % 結(jié)晶紫染色液。

1.2.2 中藥儲存液的配制在超凈工作臺上，取出藥品，搖晃使其溶解，其濃度為20 mg/ml。

1.2.3 鼠傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)用滅菌環(huán)，挑取少量沙門氏菌干粉于5 ml LB液體培養(yǎng)基中，在搖床上震蕩過夜（37 ℃，180 r/min）。第二天，用滅菌環(huán)蘸取少量菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，純化菌落。挑取單個菌落至在10 ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃、240 r/min搖菌12 h直到對數(shù)生長期，12 000 r/min離心10 min收集細菌。

1.2.4 最小抑菌濃度的測定用鑷子夾取高壓滅菌后的離心管5支，規(guī)格為4 ml，用移液槍在第1支離心管中加入LB培養(yǎng)基980 μl，剩余4支離心管中各加入800 μl LB培養(yǎng)基；無菌操作，用移液槍吸取中藥儲存液20 μl加入到第1支離心管中，混合均勻后吸取200 μl培養(yǎng)液加入第2支離心管中，依次倍比稀釋至第4支管，混勻后從第4支離心管中吸取200 μl培養(yǎng)液棄去，第5支離心管中不加藥物，做空白對照，此時，試管里的藥液濃度比依次為400、80、16、3.2μg/ml等；用微量加樣器吸取濃度為5×103CFU/ml菌液1 ml，依次加到各支離心管中，混勻后，用移液槍從每支離心管中抽取200 μl混合液至96孔酶標板中，每個樣4個重復，最終藥液濃度比依次為200、40、8、1.6 μg/ml。將酶標板置于37 ℃恒溫搖床中孵育24 h。孵育結(jié)束后，用酶標儀在630 nm波長下進行測定[6]。

1.2.5 抑菌圈的測定（1）倒板。將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，每板20 ml左右。（2）涂菌。取200 ml濃度為（或麥氏比濁器0.5）菌液，為使涂布均勻，可用涂菌器涂布。（3）打孔。取直徑6 mm的瓊脂打孔器在每板上均勻打孔5個，去除孔內(nèi)瓊脂，將加熱的固體瓊脂待冷卻后取少量滴入孔底，以便達到封孔的目的。（4）加入待檢藥液。每孔加入等體積已稀釋好的藥液36 μl，以滿而不溢為最好，設置DMSO稀釋劑對照組。（5）孵育。加滿后，在37 ℃溫箱孵育18～24 h。（6）測量。用mm尺子量取抑菌圈直徑。

1.2.6 細菌生物膜測定（1）制備生物膜。用鑷子夾取高壓滅菌后的離心管5支，規(guī)格為4 ml，用移液槍在第1支離心管中加入LB培養(yǎng)基980 μl，剩余4支離心管中各加入800 μl LB培養(yǎng)基；無菌操作，用移液槍吸取中藥儲存液20 μl加入到第1支離心管中，混合均勻，吸取200 μl培養(yǎng)液加入第2支離心管中，依次倍比稀釋至第4支管，混勻后從第4支離心管中吸取200 μl培養(yǎng)液棄去，第5支離心管中不加藥物，做空白對照，此時，試管里的藥液濃度比依次為400、80、16、3.2 μg/ml等；用微量加樣器吸取濃度為5×103CFU/ml菌液1 ml，依次加到各支離心管中，混勻后，用移液槍從每支離心管中抽取200 μl混合液至96孔酶標板中，每個樣4個重復，最終藥液濃度比依次為200、40、8、1.6 μg/ml。將酶標板置于37 ℃恒溫搖床中孵育24 h。（2）結(jié)晶紫染色。在恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h后，取出96孔酶標板，棄去細菌培養(yǎng)液；用微量加樣器加入200 μl生理鹽水，靜置30 s，棄去生理鹽水；再加入250 μl 0.1 % 結(jié)晶紫染色液，靜置1 h；然后孵育1 h，棄去結(jié)晶紫染液；再用微量加樣器加入200 μl生理鹽水，靜置30 s，棄去生理鹽水；上述步驟重復洗滌兩遍；用微量加樣器吸取200 μl 95 % 乙醇加入，吹打混合均勻；使用酶標儀在570 nm波長下進行測定。

1.2.7 動物感染試驗體重為18～22 g ICR小鼠適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為3組，每組10只，分別為空白對照組、攻毒組和黃芩苷組。第一組腹腔注射生理鹽水1 ml作空白對照，剩余兩組腹腔注射1 ml濃度為1010CFU/ml·只的鼠傷寒沙門氏菌，同時，黃芩苷組小鼠腹腔注射黃芩苷（1 g/kg）0.2 ml，連續(xù)給藥7 d，攻毒組和空白對照組腹腔注射生理鹽水作對照。攻毒后，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠存活時間。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗結(jié)果數(shù)據(jù)，通過Excel電子表格進行初步整理后，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”來表示。差異顯著性用*（表示差異顯著P＜0.05）、**（表示差異極顯著P＜0.01）、***（表示差異極顯著P＜0.001）表示。

2 結(jié)果及分析

2.1 黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌生長的結(jié)果

通過表1、圖1得知，當黃芩苷的濃度在1.6、8、40、200 μg/ml時，對鼠傷寒沙門氏菌的生長無顯著影響（P＞0.05）。

表1 不同藥物濃度對鼠傷寒沙門氏菌生長的結(jié)果

圖1 最小抑菌濃度測定

2.2 黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌抑菌圈生成的結(jié)果

由表2、圖2得知，在孔中分別加入1.6、8、40、200 μg/ml不同濃度的黃芩苷藥物，在孔周圍均無抑菌圈生成。

圖2 不同濃度的黃芪苷藥物抑菌圈大小

表2 不用藥物濃度對鼠傷寒沙門氏菌抑菌圈大小的影響

2.3 黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌生物膜形成的結(jié)果

由表3、圖3可知，黃芩苷濃度在1.6 g/ml時，對鼠沙門氏菌生物膜的形成無顯著影響（P＞ 0.05）；黃芩苷濃度在8、40、200 g/ml時，能顯著（P＜0.05）抑制鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成；當濃度在40 g/ml和200 g/ml時，極顯著（P＜ 0.01）抑制鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成。

表3 不用藥物濃度對鼠傷寒沙門氏菌生物膜形成的結(jié)果

圖3 細菌生物膜測定

2.4 黃芩苷對感染鼠傷寒沙門小鼠存活時間的結(jié)果

由表4、圖4可知，空白對照組小鼠生長狀態(tài)良好；黃芩苷組在攻毒后第3、4、5、6、7 d，存活率分別為70 %、60 %、60 %、60 % 和60 %，而攻毒組小鼠存活率分別為60 %、40 %、30 %、30 % 和30 %。結(jié)果表明，黃芩苷組小鼠的存活率明顯（P＜0.05）高于攻毒組。

表4 黃芩苷對感染鼠傷寒沙門小鼠存活時間的結(jié)果

圖4 黃芩苷對感染鼠傷寒沙門小鼠存活時間的結(jié)果

3 討論

抗生素的大量使用和濫用造成細菌耐藥性問題越來越嚴重，迫切需要尋求一種抗生素的取代品，中藥作為一種低毒的抗生素取代品已被廣泛使用，為臨床用藥提供了重要的試驗依據(jù)，也解決了細菌耐藥性等方面問題[7]。本論文通過四個實驗研究黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌活性的影響。

研究黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果，我們采用兩種方法進行測定，在最小抑菌濃度測定實驗中，用酶標儀檢測其結(jié)果，在630 nm的波長下測得發(fā)現(xiàn)，黃芩苷濃度在1.6、8、40、200 μg/ml時，均對鼠傷寒沙門氏菌的生長無顯著影響；說明在此之間的濃度均對鼠傷寒沙門氏菌的生長無抑制效果。在測定黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌抑菌圈生成的實驗中，用游標卡尺測量其抑菌圈大小，由圖2結(jié)果得知，在孔中分別加入1.6、8、40、200 μg/ml不同濃度的黃芩苷藥物，在孔周圍均無抑菌圈生成。說明黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌無抑制作用。采用以上兩種不同方法測定黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果，結(jié)果都顯示鼠傷寒沙門氏菌對黃芩苷的敏感性較低[8]。

生物膜是細菌在不利其生長的環(huán)境下，通過自身產(chǎn)生的細胞外多糖被膜多聚物相互粘連形成的細菌群落[9]。細菌生物膜的形成增加了細菌對不利條件的抵抗力，是細菌持續(xù)感染和反復感染的重要原因[10]。目前認為99 % 的細菌以生物膜的形式存在，在人類感染疾病中，有65 % 涉及細菌生物膜。細菌生物膜具有較強的抗藥性、病情長期性、可逃避宿主的細胞免疫和體液免疫導致局部炎癥反應等作用[11]。因此，細菌生物膜的研究對臨床疾病的治療具有十分重要的意義。本實驗通過結(jié)晶紫染色使粘附于平板壁的生物膜著色，洗滌后，在570 nm波長下，用酶標儀檢測其結(jié)果。藥物濃度越大，細菌生物膜數(shù)量越少，吸光度越低[12]。通過圖3的結(jié)果可知，黃芩苷濃度在1.6 μg/ml時，對鼠沙門氏菌生物膜的形成不顯著；黃芩苷濃度在8、40、200 μg/ml時，能顯著抑制鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成；當濃度在40、200 μg/ml時，抑制效果最好。說明當黃芩苷濃度＞40 μg/ml時，對鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成能達到較好抑制作用。

通過體外試驗研究黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌活性的影響之后，為進一步研究黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠的治療效果，筆者通過體內(nèi)試驗，建立鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠模型，觀察小鼠的存活時間[13]。由圖4可知，空白對照組小鼠生長狀態(tài)良好；鼠傷寒沙門氏菌攻毒后，造成小鼠的大量死亡；連續(xù)給藥7 d后，小鼠的存活率明顯提高，且從第4天開始黃芩苷組小鼠的存活率明顯高于攻毒對照組，說明黃芩苷藥液能抑制鼠傷寒沙門氏菌的侵染，對小鼠起到了保護作用，提高了小鼠的抗感染能力，延長其存活時間，這對鼠傷寒沙門氏菌的臨床治療和藥物的合理選用提供了重要的試驗依據(jù)，也為防治人類感染鼠傷寒沙門氏菌及避免由鼠傷寒沙門氏菌引起的食品安全風險提供了重要的實際性意義[14]。

綜上所述，黃芩苷不能抑制鼠傷寒沙門氏菌的生長，但可以抑制細菌生物膜的形成，降低其活性，同時，增強感染鼠傷寒沙門氏菌小鼠的抗感染能力，延長其存活時間。在臨床應用過程中，可以將黃芩苷與氯霉素、喹諾酮類等藥物配伍使用以防治鼠傷寒沙門氏菌的感染[15]。

4 結(jié)論

本研究通過最小抑菌濃度測定實驗，抑菌圈測定實驗，細菌生物膜測定實驗和動物感染性試驗研究了黃芩苷對鼠傷寒沙門氏菌活性的影響和鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠的治療效果，得到以下結(jié)論：（1）黃芩苷可以抑制鼠傷寒沙門氏菌的活性。（2）黃芩苷可以應用于防治鼠傷寒沙門氏菌疾病。