沈思思

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）是單股正鏈RNA蟲媒病毒，基因組長為11kb，有一個開放閱讀框，兩側(cè)是5′端和3′端的非編碼區(qū)，包含三種結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼（C）蛋白、前膜（PrM）蛋白和包膜（E）蛋白；七種非結(jié)構(gòu)蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[1]。該病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬，自2010年在我國東南部暴發(fā)以來，給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，該病毒的典型特征為鴨的產(chǎn)蛋量下降和神經(jīng)癥狀[2]。

齊齊哈爾市某養(yǎng)殖場圈養(yǎng)4 000只鴨，接種過禽流感三價苗、鴨瘟疫苗、新流油乳劑疫苗和鴨細小病毒疫苗。送檢的5只病鴨在發(fā)病期間出現(xiàn)綠色稀便、厭食、共濟失調(diào)等癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟和腦出現(xiàn)典型病變，卵巢受損并出血。根據(jù)臨床癥狀和病理剖檢初步懷疑是坦布蘇病毒和大腸桿菌混合感染，確診需實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集采集病鴨的相關(guān)病料，包括：脾、肝、腦、卵巢、小腸。

1.1.2 主要儀器與試劑DNA、RNA提取試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；離心機（TGL-16G）為上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；PCR儀（S1000）為美國伯樂公司產(chǎn)品；凝膠成像儀（WD-9413B）為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 被檢樣本處理解剖時，無菌采集病料于麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃ 過夜培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢，觀察菌落形態(tài)；將脾、肝、腦、卵巢、小腸病料混合，取混合后的病料進行研磨，生理鹽水稀釋，離心取上清備用。

1.2.2 DNA及RNA的提?。?）DNA的提取：取培養(yǎng)基上單個菌落生理鹽水混合均勻，用DNA試劑盒提取DNA。（2）RNA提取及cDNA的合成：將處理后的病料用RNA試劑盒提取RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 PCR擴增（1）大腸桿菌毒力基因檢測：根據(jù)參考文獻[1]，合成相關(guān)的毒力基因進行PCR擴增，毒力基因引物序列如表1。（2）病毒PCR擴增：坦布蘇病毒引物見參考文獻[3]，F(xiàn):5’C GGCTGGATGGGACACTA-3’, R: 5’ATGAG-CAG ATGGCGTTTG-3’。反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μl，2×Taq PCR Master Mix12.5 μl，上、下游引物1.0 μl，ddH2O 8.5 μl，總體積25 μl。PCR擴增條件：95 30℃ s、55 30℃ s，72 40℃ s，循環(huán)30次，72 10℃ min。反應(yīng)條件：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄30 min；預變形3 min；94 ℃ 變性45 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 反應(yīng)結(jié)束。

表1 黏附素毒力基因引物序列

1.2.4 藥敏試驗鏡檢過的單個菌落用生理鹽水稀釋后，涂布棒均勻涂抹在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，然后將12種藥敏片有序排放，37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察。

2 結(jié)果

2.1 細菌學檢測

麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色菌落，鏡檢后觀察到革蘭氏陰性，短小桿菌，多呈散發(fā)，初步診斷為大腸桿菌，見圖1。

圖1 大腸桿菌鏡檢圖

2.2 PCR擴增

2.2.1 毒力基因檢測結(jié)果檢測目的條帶為314 bp，大腸桿菌K99毒力基因一致，確定該菌株為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC），見圖2。

2.2.2 病毒PCR擴增檢測目的條帶為750 bp，與預期一致，確定為坦布蘇病毒感染，見圖2。

圖2 PCR擴增結(jié)果

2.3 藥敏試驗

抑菌圈直徑＞20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～14 mm為中敏，＜10 mm為低敏，0為耐藥。由表1可見，分離到的細菌對丁胺卡那極敏，對環(huán)丙沙星高敏，對慶大霉素低敏，其他均不敏感。

表1 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

該鴨場暴發(fā)的疾病是坦布蘇病毒與大腸桿菌的混合感染，鴨群在感染坦布蘇病毒后，免疫力下降從而感染大腸桿菌。該鴨場內(nèi)病菌應(yīng)先控制細菌感染，藥敏試驗結(jié)果看出，該鴨場內(nèi)病菌對很多抗生素有耐藥性，說明該鴨場經(jīng)常不規(guī)范使用抗生素進行治療，給該鴨場造成了很大的隱患，發(fā)現(xiàn)疾病第一時間應(yīng)及時確診合理用藥。

坦布蘇病毒目前沒有特定的治療方法，只能提前疫苗接種。對于患病鴨場，應(yīng)及時隔離病鴨并對鴨舍和鴨排泄物進行清洗、消毒，防止疾病的擴散，減少進一步的經(jīng)濟損失。保持鴨舍的干凈、衛(wèi)生，給鴨群提供良好的環(huán)境是控制疾病的第一步[4]。

4 結(jié)論

結(jié)合臨床癥狀和病理剖解初步診斷為坦布蘇病毒和大腸干菌混合感染。結(jié)合PCR檢測，大腸桿菌毒力基因篩查，確定該株大腸桿菌為致病性大腸桿菌，病毒為坦布蘇病毒感染。藥敏試驗結(jié)果表明，該菌株對丁胺卡那極敏，對環(huán)丙沙星高敏，對慶大霉素低敏，其他均不敏感。通過丁胺卡那治療，該鴨腸疾病得到初步控制。