孟德志，邢 斌，翁鴻宇，王秀媛，王 芳，楊玲玲， 柴同杰*，韋良孟*，戴培強(qiáng)

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技院，山東 泰安 271018；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京； 3.濰坊市濰城區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東 濰坊；4.山東戴爾塔生物工程有限公司，山東 泰安）

諾維氏梭菌在自然界廣泛存在，特別是土壤之中，飼草被芽胞體污染后，羊采食飼草，芽胞進(jìn)入機(jī)體，由胃腸壁經(jīng)目前未知的途徑進(jìn)入動物肝臟引起發(fā)病。大多數(shù)發(fā)病羊表現(xiàn)為突然死亡，病死羊尸體的皮下靜脈呈現(xiàn)明顯淤血，羊皮暗黑色，因此稱為“黑疫”[1]。α毒素是由A型和B型諾維氏梭菌菌株產(chǎn)生的致死性、壞死性的毒素，α毒素致組織壞死，破壞細(xì)胞骨架，作用于L酰葡糖胺等[2]，它可引起羊黑疫等疾病，不僅影響我國畜牧業(yè)的發(fā)展，還會給人類的健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。諾維氏梭菌病具有發(fā)病急、病程短、死亡率較高的特點(diǎn)，患病動物往往得不到有效治療而死亡。因此，諾維氏梭菌的快速檢測方法以及治療措施就顯得尤為重要。本研究利用生物合成基因序列，制備重組蛋白，獲得諾維氏梭菌α毒 素的單克隆抗體，為建立諾維氏梭菌的檢測診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物、菌株及細(xì)胞B型諾維氏梭菌（ATCC 27606）、pET-21a（+）載體、純化的重組α毒素蛋白、F0細(xì)胞等由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供；5～6周齡的雌性BALB/c小鼠購自濟(jì)南市歷下區(qū)山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；健康新西蘭大白兔購自泰安種兔廠。

1.1.2 主要試劑透析袋、NC膜、HRP均購于德國Roche公司，HRP-DAB底物顯色和TMB底物顯色液等都購于天根生化科技有限公司；High AffinityNi-changed Resin購自康為世紀(jì)生物科技 有限公司；anti-His兔多抗、羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP均購自杭州華安生物公司；2× TSINGKE? Master Mix、DNA Marker購自青島擎科梓熙生物科技有限公司；蛋白Marker、蛋白buffer購自北京聚合美生物科技有限公司、IMEM、HAT、HT培養(yǎng)基、NCTC生長因子、TEMED、葡萄糖、庖肉培養(yǎng)基購于北京索萊寶有限公司；Difco TM Cooked Meat Medium購自美國Becton Dickinson and Company；胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司；弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑、細(xì)胞融合試劑PEG3 000、單克隆抗體亞型鑒定試劑盒均購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 諾維氏梭菌重組蛋白的原核表達(dá)將獲得的α毒素基因序列，連接至表達(dá)載體pET21a（+）。經(jīng)測序驗(yàn)證基因序列大小為1 719 bp，所表達(dá)的氨基酸長度為573 aa。隨后添加NdeI and XhoI酶切位點(diǎn)，連接到pET-21a（+）載體上。將測序合格的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3），接種到已加入氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，大量表達(dá)并經(jīng)Ni柱進(jìn)行蛋白純化，將洗滌液與洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，并用Western Blot驗(yàn)證重組蛋白表達(dá)情況。

1.2.2 單克隆抗體的制備（1）BALB/c小鼠的免疫。選擇取6～8周齡與骨髓瘤細(xì)胞F0同源的雌性BALB/c小鼠，提前預(yù)飼一周消除應(yīng)激。將純化后的重組蛋白加弗氏佐劑乳化完全后，于第1天、第14天、第28天進(jìn)行免疫，每只BALB/c小鼠腹腔注射60 μg重組蛋白，首免加倍。于第35天尾靜脈采血和進(jìn)行間接ELISA測定小鼠血清中的抗體效價；第42天加強(qiáng)免疫，小鼠腹腔注射60 mg不加佐劑純化的重組蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第45天進(jìn)行細(xì)胞融合。（2）飼養(yǎng)細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞（F0）與脾細(xì)胞的制備。細(xì)胞融合前1 d或者2 d應(yīng)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，為細(xì)胞融合的生長提供有力的體外環(huán)境。在融合前14 d左右，將凍存的骨髓瘤細(xì)胞（F0）從液氮罐中取出，轉(zhuǎn)至37 ℃ 水浴鍋中反復(fù)搖晃3 min至細(xì)胞完全融化。離心棄上清凍存液，用已加雙抗的含有10 % FBS的IMDM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，用移液槍將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶內(nèi)，后置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞融合過程中，制備的脾細(xì)胞的生長狀態(tài)和數(shù)量都非常重要，取加強(qiáng)免疫后效價較高的BALB/c小鼠摘掉小鼠眼球并收集血液，制備小鼠陽性血清。將小鼠脫頸致死后浸泡于75 % 酒精中消毒10 min。將小鼠脾臟充分研磨，并加入IMDM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，使脾細(xì)胞盡可能多的沖洗下來。（3）細(xì)胞融合。將制備好的F0細(xì)胞和脾細(xì)胞混合，補(bǔ)加IMDM培養(yǎng)基至20 ml，1 000 r/min 離心10 min。離心后棄去上清，液體吸干凈。用1 ml 50 % 的PEG 1 500進(jìn)行細(xì)胞融合100 s。加入14 ml IMDM培養(yǎng)基，混勻，37 ℃ 水浴靜置10 min。1 000 r/min離心10 min，棄上清。離心后，棄上清，向離心管中加入7 ml已預(yù)熱的含20 % FBS的HAT培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞沉淀。用HAT培養(yǎng)液將離心管中的液體補(bǔ)充至50 ml。待細(xì)胞混勻后，將細(xì)胞懸液加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5 % CO2溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。（4）選擇性培養(yǎng)及陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆。用HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞篩選，篩選出來的雜交瘤細(xì)胞孔中有多種雜交瘤細(xì)胞混合生長，其中只有少數(shù)細(xì)胞是分泌所需的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。因此，必須對所獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選和亞克隆，以得到能夠分泌單一抗體的雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞的亞克隆培養(yǎng)采用有限稀釋法。

1.2.3 BALB/c小鼠單克隆抗體腹水的制備及純化雜交瘤細(xì)胞具有親代腫瘤細(xì)胞的遺傳特性，如接種到同源性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就可以在宿主體內(nèi)無限繁殖，直至死亡。小鼠腹水中含有大量的單克隆抗體，其效價遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞培養(yǎng)上清液。收集的單克隆抗體腹水使用正辛酸-硫酸銨方法進(jìn)行純化，利用SDS-PAGE對純化效果進(jìn)行分析，并進(jìn)行濃度測定。測定單克隆抗體濃度的方法采用紫外分光光度計(jì)測定濃度：當(dāng)吸光值260 nm/280 nm＜1.5時，則單克隆抗體濃度由下式計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm。

1.2.4 單克隆抗體的效價檢測和特異性的鑒定用重組蛋白包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA操作方法對制備的單克隆抗體進(jìn)行效價檢測，其中二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠。利用Western Blot（免疫印跡）的方法，對單克隆抗體與重組毒素蛋白的特異性結(jié)合進(jìn)行分析。

1.2.5 鼠單克隆抗體Ig亞類的鑒定按照試劑盒的步驟進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株單克隆抗體亞類鑒定，重鏈Mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA中OD值大于0.5，且比其他的OD值大3倍，則判定為陽性。輕鏈Igκ、Igλ陽性O(shè)D值大于0.5，則判定為陽性。重鏈或輕鏈檢測出有2個或者2個以上的陽性值，則判定為其他亞型，該抗體亞型不合格。需要重新檢測或者進(jìn)行亞克隆。檢測結(jié)果不能判定亞型的，按不合格處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾維氏梭菌α毒素重組蛋白的原核表達(dá)

2.1.1 質(zhì)粒構(gòu)建及酶切鑒定對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，結(jié)果如圖1所示。泳道1為pET-21a（+）酶切結(jié)果，分子量大小大約在5 000 bp，泳道2為質(zhì)粒DNA，分子量大小包含5 000 bp以及5 000 bp以上的兩條帶，表明目的片段已經(jīng)重組到質(zhì)粒。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建酶切圖

2.1.2 諾維氏梭菌重組蛋白表達(dá)結(jié)果將諾維氏梭菌α毒素構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，與誘導(dǎo)后破碎沉淀相比，目的蛋白在誘導(dǎo)后上清中表達(dá)量最大，表明該重組蛋白主要以可溶性蛋白形式表達(dá)。對破碎后的沉淀與破碎后的上清進(jìn)行鎳柱純化，收集蛋白洗脫液用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示，重組蛋白在編號11破碎后的上清中濃度最高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 諾維氏梭菌包涵體蛋白驗(yàn)證

2.1.3 諾維氏梭菌重組蛋Western Blot驗(yàn)證結(jié)果原核表達(dá)重組蛋白，對His標(biāo)簽進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證，經(jīng)鑒定蛋白大小為66 kDa（圖3）。

圖3 蛋白Western Blot鑒定分析

2.2 諾維氏梭菌單克隆抗體的制備

2.2.1 免疫BALB/c小鼠的抗體效價檢測結(jié)果BALB/c小鼠第三免疫后，尾靜脈采血，分離純化血清，以血清為一抗，通過間接ELISA方法檢測小鼠血清抗體效價，結(jié)果均在1:64 000以上（表1）。

表1 小鼠抗體效價的測定結(jié)果

2.2.2 陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立結(jié)果等到細(xì)胞融合成功一周后，利用間接ELISA方法對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，選擇OD450nm值較高且細(xì)胞生長狀態(tài)較好的陽性孔進(jìn)行融合初篩和融合復(fù)篩，經(jīng)過有限稀釋法進(jìn)行第一次亞克隆、第一次亞克隆復(fù)篩、第二次亞克隆、第二次亞克隆復(fù)篩，獲得2株雜交瘤細(xì)胞株，分別將其命名為1978CT716.15.65、1978CT142.38.7。

2.3 單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果

利用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒測定陽性雜交瘤細(xì)胞株亞型，單抗1978CT716.15.65、1978CT142.38.7都為IgG1，κ型（表2）。

表2 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果

2.4 腹水的純化及濃度測定結(jié)果

利用雌性BALB/c小鼠腹腔獲得腹水，將收集到的腹水采用正辛酸-硫酸銨方法純化，對純化的腹水進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳（圖4），所純化的腹水有兩條很明顯的蛋白條帶：53 kDa左右的重鏈和25 kDa左右的輕鏈，結(jié)果表明腹水純化的效果較好，且純度均達(dá)到80 % 以上。根據(jù)蛋白計(jì)算公式：濃度（mg/ml）=1.45× OD280nm-0.74×OD260nm得到單克隆抗體的濃度為2.29 mg/ml。

圖4 腹水的SDS-PAGE分析

2.5 單克隆抗體的特性鑒定

2.5.1 單克隆抗體效價的測定結(jié)果采用間接ELISA方法檢測獲得的單克隆抗體效價。1978CT142.38.7株雜交瘤細(xì)胞上清抗體效價達(dá)到1:1 600，1978CT716.15.65株雜交瘤細(xì)胞上清抗體效價達(dá)1:12 800。純化的腹水抗體效價分別為1:64 000和1:512 000。利用腹水獲得的單克隆抗體要比細(xì)胞上清效果更好（表3）。

表3 單克隆抗體效價的測定結(jié)果

2.5.2 單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果采用間接的ELISA法分別檢測2株單克隆抗體與重組毒素蛋白、產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白的反應(yīng)情況。結(jié)果表明，2株單克隆抗體均能和重組毒素蛋白結(jié)合，效價分別為1:512 000、1:64 000，但都不與無關(guān)蛋白結(jié)合（表4）。

表4 株單克隆抗體特異性檢測結(jié)果

2.5.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Western Blot方法分別檢測了2株單抗與重組毒素反應(yīng)（圖5），NC膜上的特異性條帶大約在66 kDa處，與重組蛋白的大小一致。所制得的單克隆抗體能特異性識別并結(jié)合重組毒素。

圖5 單克隆抗體的Western Blot分析

3 討論

羊黑疫又稱“傳染性壞死性肝炎”，是由B型諾維氏梭菌引起的綿羊、山羊的一種急性高度致死性毒血癥。臨床表現(xiàn)與羊快疫、羊腸毒血癥等疾病極為相似。病程短促，大多數(shù)發(fā)病羊只表現(xiàn)為突然死亡，臨床癥狀不明顯[3]。部分病例可拖延1～2 d，但沒有超過3 d的，病羊放牧?xí)r掉群，食欲廢絕，精神沉郁，反芻停止，呼吸急促，體溫41.5 ℃[4]，?；杷┡P，保持在這種狀態(tài)下毫無痛苦地突然死去。我國自1964年首次發(fā)現(xiàn)該病以來[5]，出現(xiàn)了幾次大流行，近幾年呈地方性零星散發(fā)，但都未得到有效的預(yù)防、診斷、治療，一直在對我國畜牧業(yè)造成損失。該病已經(jīng)出現(xiàn)了近半個世紀(jì)，但我國對其研究少之又少，針對諾維氏梭菌培養(yǎng)、鑒定以及快速檢測技術(shù)的研究幾乎是一片空白。由于諾維氏梭菌的培養(yǎng)困難，產(chǎn)毒情況不穩(wěn)定，本研究利用諾維氏梭菌α毒素N-末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行原核表達(dá)，獲取所需重組蛋白。諾維氏梭菌重組蛋白的制備可以打破現(xiàn)在產(chǎn)毒困難的技術(shù)難題，加快對諾維氏梭菌病及其相關(guān)技術(shù)的研究。

雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)過程中，因細(xì)胞具有密度依賴性的特性，細(xì)胞融合過程中需單獨(dú)加入飼養(yǎng)層細(xì)胞以提高雜交瘤細(xì)胞的存活率。在本實(shí)驗(yàn)選用的飼養(yǎng)層細(xì)胞是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞不僅可以為雜交瘤細(xì)胞提供生長因子、營養(yǎng)等物質(zhì)，還可以將已死亡的細(xì)胞吞噬掉，為細(xì)胞融合提供良好的生存環(huán)境。使用雌性BALB/c小鼠腹腔獲得腹水，因收集的腹水中含有少量的脂肪和無關(guān)蛋白等雜質(zhì)，故先離心除去部分雜質(zhì)，再采用正辛酸-硫酸銨方法對腹水進(jìn)行純化。本方法具有易操作，成本低，完整保留抗體活性等優(yōu)點(diǎn)，并且本身對免疫球蛋白IgG1的純化具有很好的效果，本研究所制備的2株雜交瘤細(xì)胞亞型均為IgG1、κ亞型，因此更適合使用本方法純化。

經(jīng)Western Blot驗(yàn)證，制備的單克隆抗體能與重組蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合，且單克隆抗體純度及效價較高，可以滿足進(jìn)一步制備諾維氏梭菌的快速檢測試劑盒的需求。該研究獲得的單克隆抗體在諾維氏梭菌的雙夾心ELISA試劑盒的開發(fā)以及膠體金試劑盒的開發(fā)中起重要作用，在后期諾維氏梭菌可以穩(wěn)定分泌毒素、可以獲得陽性臨床樣品的情況下，可以利用所制備的單克隆抗體進(jìn)行ELISA試劑盒及膠體金試劑條的組裝構(gòu)建等工作，為諾維氏梭菌的快速檢測方法的建立提供了有力的技術(shù)儲備。