宋遙遙，盧曉霆*，賈路遙

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），又稱(chēng)多烯脂肪酸，主要是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸，包括亞油酸（linoleic acid，LA）、γ-亞麻酸（gamma linolenic acid，GLA）、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）等[1-2]，PUFAs是生物膜系統(tǒng)的重要組成成分，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的功能，影響基因的表達(dá)。PUFAs在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[3]，也是生物活性的前體，如前列腺素、血栓素、白三烯等類(lèi)二十烷類(lèi)物質(zhì)，而這些活性物質(zhì)對(duì)于脂類(lèi)代謝、血液流變學(xué)、血管彈性、免疫活性等生理功能有重要的調(diào)節(jié)作用[4-6]。PUFAs可以保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)[7]、抗炎[8]、抗癌[9]、治療心血管疾病[10]，還可以增加動(dòng)物的產(chǎn)仔率和成活率以及促進(jìn)大腦發(fā)育[11]。

PUFAs主要來(lái)源于動(dòng)植物，但原料有限，且易受氣候、產(chǎn)地等各種因素的制約，市場(chǎng)出現(xiàn)了供不應(yīng)求的趨勢(shì)[12-13]。而微生物生產(chǎn)PUFAs具有生產(chǎn)周期較短、繁殖速度快、成本低、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、易規(guī)?；a(chǎn)、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、不受產(chǎn)地的限制等優(yōu)點(diǎn)，從而成為開(kāi)發(fā)生產(chǎn)PUFAs的研究熱點(diǎn)[14-15]。

目前，用于生產(chǎn)PUFAs的微生物主要集中在被孢霉屬（Mortierella）真菌[16]，但是野生菌株生產(chǎn)PUFAs的能力很低。因此，近年來(lái)人們一直在探索利用誘變育種等技術(shù)，對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)PUFAs菌株進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高PUFAs的含量[17-19]。本研究以深黃被孢霉（Mortierella isabellina）AS3.3410為出發(fā)菌株，利用紫外線(xiàn)及氯化鋰（LiCl）對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變，通過(guò)乙酰水楊酸、蘇丹黑B染色初篩，搖瓶復(fù)篩，選育出高產(chǎn)PUFAs的突變菌株，以期提高菌體生物量和油脂產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

深黃被孢霉（Mortierella isabellina）As3.3410：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所國(guó)家菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

玉米糖（濃度≥17%，葡萄糖當(dāng)量值（dextrose equivalen，DE）≥90%）：實(shí)驗(yàn)室自備；氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、磷酸二氫鉀（均為分析純）：北京化工廠(chǎng)；瓊脂（生化試劑）：北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸銨（分析純）：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；硫酸鎂（分析純）：天津市津北精細(xì)化工有限公司；檸檬酸鈉（分析純）、酵母膏（生化試劑）、無(wú)水氯化鋰（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；乙酰水楊酸（分析純）、蘇丹黑B（生物學(xué)染色）、二甲苯（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.5%番紅染色液（生物學(xué)染色）：常德比克曼生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基[20]：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基。去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。PDA液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

種子培養(yǎng)基[21]：葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.30 g/L，硫酸銨2 g/L，酵母膏2 g/L，pH 6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

產(chǎn)脂培養(yǎng)基[22-23]：玉米糖60 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，硫酸鎂0.50 g/L，酵母膏2 g/L，pH 6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YP10002電子天平：上海恒際科學(xué)儀器有限公司；ESJ120電子分析天平：天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；85-2控溫磁力攪拌器：江蘇金壇城東新瑞儀器廠(chǎng)；BSD-TX270恒溫振蕩器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；MTX-8013霉菌培養(yǎng)箱：天津市宏諾儀器有限公司；motic B SERIES顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；MLS-3750高壓滅菌鍋：日本三洋公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：北京科偉永興儀器有限公司；RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-25型pH計(jì)：上海晶磁儀器有限公司；BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；250mL索氏抽提器：天津玻璃儀器廠(chǎng)；7890B氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將深黃被孢霉（Mortierella isabellina）As3.3410接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，直至孢子大量形成轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑? ℃冰箱保存。

1.3.2 孢子懸浮液的制備

取25 mL 9 g/L的氯化鈉溶液加入菌株活化后的斜面培養(yǎng)基中，使用無(wú)菌接種環(huán)刮掉孢子，制成孢子菌懸液后，置于帶有玻璃珠的三角瓶中，30 ℃、200 r/min條件下振蕩打散孢子30 min，然后用無(wú)菌脫脂棉進(jìn)行過(guò)濾，制成103CFU/mL的單孢子懸浮液。

1.3.3 紫外誘變時(shí)間的選擇

調(diào)整培養(yǎng)皿與紫外燈的距離為28 cm，打開(kāi)紫外燈預(yù)熱30 min。取1 mL制備好的單孢子懸浮液分別置于恒溫磁力攪拌器上的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋紫外照射1 min，在黑暗條件下打開(kāi)皿蓋后，打開(kāi)紫外燈（波長(zhǎng)253.7 nm）邊照射邊攪拌，分別照射5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s。分別吸取0.20 mL上述條件下的孢子懸浮液涂布于PDA平板培養(yǎng)基，28 ℃避光培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)[24]并計(jì)算致死率，其計(jì)算公式如下：

1.3.4 氯化鋰質(zhì)量濃度的選擇

分別配制含0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L氯化鋰的PDA誘變培養(yǎng)基，取0.20 mL紫外照射后的單孢子懸液涂布于誘變培養(yǎng)基，28 ℃避光培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并計(jì)算致死率。

1.3.5 乙酰水楊酸質(zhì)量濃度的選擇

分別配制含0.40 g/L、0.45 g/L、0.50 g/L、0.55 g/L、0.60 g/L、0.65 g/L乙酰水楊酸的PDA篩選培養(yǎng)基。將經(jīng)紫外-氯化鋰復(fù)合誘變的菌種轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)5 h，再將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到PDA斜面上傳代2次。斜面加入15 mL 9 g/L的氯化鈉溶液，無(wú)菌接種環(huán)刮掉孢子，制成單孢子菌懸液后，用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，吸取0.20 mL單孢子懸液涂布于篩選培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并計(jì)算抑菌率，其計(jì)算公式如下：

1.3.6 蘇丹黑B染色[25-26]

從含最適質(zhì)量濃度乙酰水楊酸的PDA篩選培養(yǎng)基中選取生長(zhǎng)速度快的單菌落，在載玻片上加一滴無(wú)菌水，用接種環(huán)挑取少許菌體制成涂片，自然干燥后，用3 g/L的蘇丹黑B（蘇丹黑B 0.30 g、100 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇）染色10～15 min，水洗，自然干燥，滴加二甲苯脫色至涂片透明，干燥后滴加0.5%蕃紅染液復(fù)染30 s，水洗，自然干燥后顯微鏡觀(guān)察脂肪粒，挑取胞內(nèi)脂肪粒大、多且明顯的單菌落。

1.3.7 搖瓶復(fù)篩

將初篩得到的單菌落劃線(xiàn)接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。取15 mL無(wú)菌水置于成熟斜面中，使用無(wú)菌接種環(huán)刮掉孢子，制成單孢子菌懸液，倒入裝液量為200 mL/1 000 mL種子培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，作為種子液備用。按10%的接種量將種子液接種于裝液量為200 mL/1 000 mL產(chǎn)脂培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定菌體生物量和油脂產(chǎn)量，選擇菌體生物量、油脂含量高的菌株。

1.3.8 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為確保誘變菌株遺傳性狀的穩(wěn)定性，將獲得的高產(chǎn)菌株連續(xù)傳代5次，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，每代都要在相同的條件下接入產(chǎn)脂培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，并且每傳代1次都要進(jìn)行生物量和油脂產(chǎn)量的測(cè)定[27-28]。

1.3.9 分析檢測(cè)

生物量的測(cè)定[29]：將發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾，得到的菌絲體用蒸餾水水洗一次，置于室溫下干燥至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量，并計(jì)算生物量，其計(jì)算公式如下：

油脂的提取及測(cè)定[30]：采用索氏抽提法測(cè)定油脂含量，并計(jì)算出油率，其計(jì)算公式如下：

多不飽和脂肪酸的測(cè)定[31-32]：采用GC法測(cè)定發(fā)酵液中的多不飽和脂肪酸種類(lèi)及含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線(xiàn)照射時(shí)間的確定

紫外線(xiàn)是非電離輻射的物理誘變劑，任何誘變劑都同時(shí)具有致死和誘變的雙重效應(yīng)[33]，因此，需要測(cè)定深黃被孢霉As3.3410經(jīng)紫外照射后的致死率曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，紫外照射時(shí)間短時(shí)孢子的致死率低，但隨著紫外照射時(shí)間的逐漸增加，致死率逐漸升高?，F(xiàn)代育種理論認(rèn)為，當(dāng)紫外線(xiàn)誘變深黃被孢霉的致死率為75%～80%時(shí)產(chǎn)量性狀正突變率較高，有利于突變株的篩選[34]。因此，本研究采用79.60%的致死率對(duì)應(yīng)的照射時(shí)間20 s為最佳誘變時(shí)間。

圖1 不同紫外照射時(shí)間下深黃被孢霉As3.3410的致死率曲線(xiàn)Fig.1 Lethality rate curve of Mortierella isabellina As3.3410 under different ultraviolet irradiation time

2.2 氯化鋰質(zhì)量濃度的確定

氯化鋰是一種堿金屬鹵化物，其本身沒(méi)有誘變作用，但可以和其他的誘變因子產(chǎn)生協(xié)同作用，對(duì)菌種產(chǎn)生誘變作用[35]。因此，本研究采用紫外線(xiàn)與氯化鋰復(fù)合誘變的方法對(duì)深黃被孢霉As3.3410進(jìn)行處理，并考察深黃被孢霉As3.3410紫外照射20 s后經(jīng)不同質(zhì)量濃度氯化鋰處理后的致死率曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，經(jīng)紫外線(xiàn)照射20 s后，當(dāng)LiCl質(zhì)量濃度分別為0.8 g/L、1.0 g/L時(shí)，深黃被孢霉As3.3410的誘變致死率均為100%；當(dāng)LiCl質(zhì)量濃度為0.6 g/L時(shí)，深黃被孢霉As3.3410的致死率為75.10%，單菌落較多，并且致死率比較穩(wěn)定，所以選擇質(zhì)量濃度為0.6 g/L氯化鋰處理深黃被孢霉As3.3410。

圖2 不同質(zhì)量濃度氯化鋰下深黃被孢霉As3.3410的致死率曲線(xiàn)Fig. 2 Lethality rate curve of Mortierella isabellina As3.3410 under different mass concentrations of lithium chloride

2.3 乙酰水楊酸質(zhì)量濃度的確定

為獲得PUFAs高產(chǎn)菌株，進(jìn)行乙酰水楊酸初篩，為避免進(jìn)行盲目篩選，提高篩選效率，研究了不同質(zhì)量濃度的乙酰水楊酸對(duì)誘變后菌株生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。不同質(zhì)量濃度的乙酰水楊酸對(duì)誘變后菌株的抑菌率見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著乙酰水楊酸質(zhì)量濃度的逐漸增加，誘變后菌株的抑菌率也隨之增加，當(dāng)乙酰水楊酸質(zhì)量濃度為0.60 g/L時(shí)，抑菌率達(dá)100%。乙酰水楊酸的質(zhì)量濃度過(guò)低，起不到好的篩選抗性突變株的效果，會(huì)使篩選工作量增加，篩選效率降低；乙酰水楊酸的質(zhì)量濃度過(guò)高，又會(huì)漏篩一些高產(chǎn)菌株，所以篩選濃度一般都定為菌株的臨界致死濃度，因此，確定初篩培養(yǎng)基乙酰水楊酸質(zhì)量濃度為0.60 g/L。

圖3 不同質(zhì)量濃度乙酰水楊酸對(duì)誘變后菌株的抑菌率Fig. 3 Inhibition rate of different mass concentrations of acetylsalicylic acid on the strains after mutagenesis

2.4 高產(chǎn)多不飽和脂肪酸突變株的選育

從含0.60 g/L乙酰水楊酸的初篩培養(yǎng)基上挑選出現(xiàn)時(shí)間較早、菌落直徑較大、生長(zhǎng)旺盛的單菌落后，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，再進(jìn)行蘇丹黑B染色，篩選得到一株脂肪粒較大、分布密集的突變菌株，編號(hào)為SLZH-20，其與出發(fā)菌株AS3.3410的蘇丹黑B染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 出發(fā)菌株AS3.3410（A）與突變菌株SLZH-20（B）的蘇丹黑B染色鏡檢結(jié)果（10×40）Fig. 4 Microscopic examination results of the Sudan black B staining of starting strain AS3.3410 (A) and the mutant strain SLZH-20(B) (10×40)

由圖4可知，突變株SLZH-20菌絲體中油脂顆粒大且密集，而出發(fā)菌株AS3.3410菌絲體中油脂顆粒小且零散，說(shuō)明該突變株SLZH-20富含大量油脂，有一定的研究?jī)r(jià)值。

通過(guò)搖瓶發(fā)酵，測(cè)定突變株SLZH-20的生物量和油脂含量，結(jié)果表明，突變株SLZH-20的菌體生物量和油脂含量分別為22.76 g/L、52.30%，較原始菌株As3.3410分別增加34.60%、24.30%，說(shuō)明紫外線(xiàn)與氯化鋰復(fù)合誘變對(duì)深黃被孢霉AS3.3410是非常有效的，尤其是在產(chǎn)脂性能方面極為優(yōu)良。

2.5 高產(chǎn)多不飽和脂肪酸突變菌株SLZH-20的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將突變株SLZH-20連續(xù)傳接5代，測(cè)定生物量及油脂含量，考察突變株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，突變株SLZH-20連續(xù)移接5代后，遺傳性能穩(wěn)定，未發(fā)生原位回復(fù)突變等情況，菌體生物量和油脂含量分別為22.19～22.67 g/L、49.54%～51.21%，不同代數(shù)間差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明此菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 突變菌株SLZH-20的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of genetic stability of mutant strain SLZH-20

2.6 出發(fā)菌株AS3.3410與突變株SLZH-20脂肪酸組成成分的分析比較

突變株SLZH-20和出發(fā)菌株AS3.3410油脂的脂肪酸組成及含量見(jiàn)表2。由表2可知，從兩菌株的油脂中共檢測(cè)到9種脂肪酸，包括肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚一烯酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸。其中突變株SLZH-20中的不飽和脂肪酸的含量為81.41%，較出發(fā)菌株AS3.3410的不飽和脂肪酸含量增加5.72%。其中多不飽和脂肪酸含量達(dá)到16.24%，較出發(fā)菌株AS3.3410增加了2.18%，隨著多不飽和脂肪酸含量的增加，使得突變株SLZH-20有著更高的研究?jī)r(jià)值。

表2 出發(fā)菌株AS3.3410與突變菌株SLZH-20的脂肪酸組成比較Table 2 Comparison of fatty acid composition between the starting strain AS3.3410 and the mutant strain SLZH-20

3 結(jié)論

為獲得多不飽和脂肪酸高產(chǎn)菌株，本研究以深黃被孢霉（Mortierella isabellina）AS3.3410為出發(fā)菌株，利用紫外線(xiàn)及氯化鋰對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變，通過(guò)乙酰水楊酸初篩、蘇丹黑B染色，搖瓶復(fù)篩，篩選得到一株高產(chǎn)多不飽和脂肪酸的突變菌株，編號(hào)為SLZH-20，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，其搖瓶發(fā)酵5 d時(shí)，生物量和油脂含量分別為22.76 g/L、52.30%，比出發(fā)菌株分別提高34.60%和24.30%；該菌株所產(chǎn)油脂中不飽和脂肪酸包括棕櫚一烯酸、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸，含量為81.41%，其中多不飽和脂肪酸含量為16.24%，比出發(fā)菌株分別提高5.72%和2.18%。