周姝靜，孫全敏，遲乃玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

發(fā)酵蔬菜在我國(guó)有著悠久的歷史，以其獨(dú)具特色的風(fēng)味和保健功能在食品行業(yè)占據(jù)著重要地位，深受廣大群眾的喜愛。近期更有研究表明，食用發(fā)酵蔬菜在抵抗新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）上具有一定效果[1]。東北酸菜是一種以大白菜為原材料的發(fā)酵蔬菜，口味咸酸，有開胃健食、潤(rùn)腸通便、殺菌抗炎、促進(jìn)消化的效果，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[2]。因此，東北酸菜的相關(guān)研究已越來越受到廣大學(xué)者的關(guān)注。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，發(fā)酵食品中微生物多樣性及群落演替已開展了多方位的研究[3-6]。孫煒寧[7]在酸菜細(xì)菌區(qū)系中共注釋到4個(gè)細(xì)菌門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）以及放線菌門（Actinobacteria）；共注釋到38個(gè)細(xì)菌屬，其中包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳球菌屬（Lactococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）4種乳酸菌屬；楊希等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在酸菜發(fā)酵的整個(gè)過程中乳桿菌屬的相對(duì)豐度增加了81.34%，說明乳酸菌是酸菜發(fā)酵中的主要微生物；YANG X等[9]對(duì)來自3個(gè)不同家庭的酸菜進(jìn)行了微生物群落動(dòng)態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭狀芽胞菌屬（Clostridium）、腸桿菌屬（Enterobacter）是酸菜中菌群結(jié)構(gòu)的主要部分。雖然目前已有大量東北酸菜中菌群多樣性的相關(guān)研究，但通過高通量測(cè)序結(jié)合理化指標(biāo)及OD600nm值對(duì)東北酸菜發(fā)酵前后期進(jìn)行對(duì)比的研究尚少。

東北酸菜傳統(tǒng)發(fā)酵容器多為大型陶瓷缸或玻璃缸，傳統(tǒng)方法雖然腌制工藝簡(jiǎn)便但極易污染雜菌。故本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種東北酸菜小型發(fā)酵體系，使用無(wú)菌且統(tǒng)一規(guī)格的礦泉水瓶作為發(fā)酵容器，該發(fā)酵方式不僅極大的保證了取樣的安全性也為今后進(jìn)行相關(guān)東北酸菜產(chǎn)品開發(fā)提供了新思路。本研究以酸菜發(fā)酵過程中前、后期理化指標(biāo)及OD600nm值波動(dòng)較大的兩個(gè)樣本為研究對(duì)象，利用Illumina Novaseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，研究東北酸菜發(fā)酵前、后期的細(xì)菌多樣性及乳酸菌菌屬變化差異，旨在為東北酸菜產(chǎn)品的開發(fā)提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大白菜：遼寧省大連市金州區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；DP812土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；16S rRNA基因V3～V4區(qū)引物合成及建庫(kù)測(cè)序：由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3E型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CRY-2112恒溫?fù)u床：上海茸研儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Thermo Multiskan 1510酶標(biāo)儀：芬蘭Labsystems公司；AL204電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸菜的制作工藝流程及操作要點(diǎn)

挑選新鮮大白菜→清洗→燙漂→瀝水→切絲混勻→裝瓶→注鹽水→封蓋→恒溫發(fā)酵→酸菜成品

操作要點(diǎn)：

挑選新鮮大白菜清理好外層葉片，將白菜順著菜幫掰成若干片后，用清水清洗干凈，再放入85～90 ℃開水中漂燙0.5 min（菜幫先入水浸燙），取出后放入冷水中漂洗，瀝干表面水分后將白菜切成0.5～1 cm的均勻細(xì)絲。注意要將不同部位的白菜細(xì)絲混勻，選用555 mL的礦泉水瓶共30瓶，每瓶分裝350 g混勻的白菜絲，再注入1.5%的鹽水至滿瓶，擰緊瓶蓋，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵一定時(shí)間，得到酸菜成品。

1.3.2 酸菜理化指標(biāo)的測(cè)定

每瓶酸菜代表一個(gè)獨(dú)立的時(shí)間點(diǎn)，從0 h開始取樣測(cè)量，而后每隔12 h取樣一次。將瓶?jī)?nèi)酸菜與發(fā)酵液倒入燒杯中，將其全部研磨后制成勻漿，分別稱取10 g酸菜勻漿作為待測(cè)樣品，進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測(cè)[10-12]。pH值的測(cè)定：使用pH計(jì)；亞硝酸鹽含量的測(cè)定：參照GB 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中鹽酸萘乙二胺法；總酸含量的測(cè)定：參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法；OD600nm值的測(cè)定：使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值；所有試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.3.3 高通量測(cè)序

按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本DNA，以其為模板，采用引物對(duì)338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托北京百邁克生物科技有限公司完成建庫(kù)測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

首先利用Trimmomatic軟件和Cutadapt軟件對(duì)初始序列進(jìn)行質(zhì)量過濾；然后利用Usearch軟件和Uchime軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接和篩選，得到最終有效數(shù)據(jù)；用Usearch軟件對(duì)相似度為97.0%的有效序列進(jìn)行聚類，獲得操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[13]。使用QIIME2軟件進(jìn)行α多樣性分析，用MEGAN軟件繪制分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹，比較樣品中菌群的進(jìn)化關(guān)系及兩樣品在不同分類學(xué)分支上序列豐度的差異[14]。使用PICRUSt2軟件對(duì)發(fā)酵前、后期兩個(gè)酸菜樣本中的微生物進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)，并比較兩個(gè)樣本在不同功能之間存在的差異[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸菜樣本理化指標(biāo)及OD600nm值的檢測(cè)

pH值代表著酸菜的發(fā)酵進(jìn)程，總酸能體現(xiàn)出酸菜發(fā)酵后的酸香味，OD600nm值在一定程度上可以反映酸菜中的菌群濃度，亞硝酸鹽含量反映了發(fā)酵蔬菜的安全性[16]。發(fā)酵過程中酸菜的pH值、總酸含量、OD600nm值及亞硝酸鹽含量的變化見圖1。

圖1 酸菜發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及OD600nm值的變化Fig. 1 Changes of physical and chemical indexes and OD600nm value during sauerkraut fermentation process

由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵12 h時(shí)，pH值下降至4.62，亞硝酸鹽含量（9.43 mg/kg）達(dá)到峰值，OD600nm值（0.42）降至最低點(diǎn)，總酸含量（1.35 g/kg）處于均勻上升階段。當(dāng)發(fā)酵72 h時(shí)，pH值降至3.53，曲線趨于平穩(wěn)；亞硝酸鹽含量（2.67 mg/kg）也降至最低點(diǎn)，曲線趨于平穩(wěn)；總酸含量（3.60 g/kg）升至最高點(diǎn)，隨后保持不變。由此可知，發(fā)酵時(shí)間為12 h和72 h是整個(gè)發(fā)酵階段內(nèi)理化指標(biāo)變化明顯的時(shí)間點(diǎn)，將發(fā)酵12 h（發(fā)酵前期）對(duì)應(yīng)的樣本命名為SC1，發(fā)酵72 h（發(fā)酵后期）對(duì)應(yīng)的樣本命名為SC2。

2.2 酸菜樣本細(xì)菌微生物高通量測(cè)序結(jié)果及質(zhì)量評(píng)估

酸菜樣本細(xì)菌微生物的高通量測(cè)序結(jié)果見表1。由表1可知，從兩個(gè)酸菜樣本中共獲得160 457條原始序列，雙端序列質(zhì)控、拼接后共得到159 660條高質(zhì)量序列，最終將高質(zhì)量序列通過拼接、過濾和嵌合體后得到有效序列共158 188條，序列平均堿基長(zhǎng)度為414 bp，樣品平均鳥嘌呤（guanine，G）胞嘧啶（cytosine，C）含量為53.10%。此外，兩個(gè)酸菜樣本的測(cè)序質(zhì)量值Q20＞98%、Q30＞95%，有效序列占比＞98%，說明測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。

表1 酸菜樣本細(xì)菌微生物高通量測(cè)序結(jié)果Table 1 High-throughput sequencing results of bacterial microbe in sauerkraut sample

2.3 基于OTU的Venn圖分析

兩個(gè)酸菜樣本中OTU的Venn圖見圖2。由圖2可知，樣本SC1獨(dú)有的OTU數(shù)量為4，樣本SC2獨(dú)有的OTU數(shù)量為3；兩樣本共有的OTU數(shù)量為54，占OTU總數(shù)的88.52%；兩樣本特有的OTU數(shù)目占全部OTU總數(shù)的11.48%；說明樣本SC1和SC2中絕大部分的細(xì)菌種類相似。

圖2 兩個(gè)酸菜樣本中OTU的Venn圖Fig. 2 Venn diagram of OTU in two sauerkraut samples

2.4 酸菜樣本細(xì)菌菌群的等級(jí)豐度曲線

等級(jí)豐度曲線可反映兩樣品所含物種的均勻度和豐富度，橫軸方向上的曲線長(zhǎng)度反映了物種豐富度，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，說明物種的組成越豐富；縱軸方向上的曲線變化反映了物種均勻度，變化越平緩，說明物種組成的均勻程度越高[17]。兩個(gè)酸菜樣本細(xì)菌菌群的等級(jí)豐度曲線見圖3。由圖3可知，樣本SC1所含物種豐富度大于樣本SC2，樣本SC2的物種均勻度大于樣本SC1。

圖3 兩個(gè)酸菜樣本的等級(jí)豐度曲線Fig. 3 Grade abundance curve of two sauerkraut samples

2.5 酸菜樣本細(xì)菌菌群Alpha多樣性分析

Alpha多樣性主要的衡量指標(biāo)包括超1（Chao1）指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)、覆蓋率[3]。Chao1和ACE指數(shù)衡量物種的豐度，指數(shù)越大，豐度越高；Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)反映了物種多樣性，Simpson指數(shù)越小，Shannon指數(shù)越大，多樣性越高[18]。兩個(gè)酸菜樣本細(xì)菌菌群的Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表2。

表2 兩個(gè)酸菜樣本細(xì)菌菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of bacterial flora in two sauerkraut samples

由表2可知，樣本SC1的物種豐富度及多樣性均高于樣本SC2。兩樣本的覆蓋率均為1.00，表示測(cè)序覆蓋率達(dá)到了100%，樣本中物種全部被檢測(cè)出來。結(jié)合兩個(gè)樣本的理化指標(biāo)進(jìn)行推斷，樣本SC1達(dá)到了整個(gè)發(fā)酵周期菌群多樣性峰值，此時(shí)酸菜中細(xì)菌豐度最大；樣本SC2代表發(fā)酵后期，隨著發(fā)酵進(jìn)程的結(jié)束，發(fā)酵后期酸菜中細(xì)菌的多樣性及豐度值逐漸減少至平穩(wěn)。

2.6 酸菜樣本中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

兩個(gè)酸菜樣本中細(xì)菌菌群的各分類水平見表3。由表3可知，酸菜樣本SC1中的細(xì)菌菌群歸屬于7個(gè)門中的44個(gè)屬，酸菜樣本SC2中的細(xì)菌菌群歸屬于8個(gè)門中的42個(gè)屬，在各分類水平的數(shù)量上相差不大。

表3 兩個(gè)酸菜樣本細(xì)菌菌群的各分類水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Statistical results of each classification level of bacterial flora of two sauerkraut samples

2.6.1 基于門水平酸菜樣本細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的分析

兩個(gè)酸菜樣本中細(xì)菌微生物在門水平上的菌群結(jié)構(gòu)見圖4。由圖4可知，樣本SC1和SC2在門分類水平上共注釋到9個(gè)物種，共有細(xì)菌門為6個(gè)，包括藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）。其中，Proteobacteria相對(duì)豐度變化最大，其發(fā)酵前期的相對(duì)豐度為5.86%，發(fā)酵后期的相對(duì)豐度為10.49%，增加了4.63%。發(fā)酵前期獨(dú)有的細(xì)菌門為髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）（0.01%），發(fā)酵后期獨(dú)有的細(xì)菌門為綠彎菌門（Chloroflexi）（0.04%）和酸桿菌門（Acidobacteria）（0.01%）。

圖4 基于門水平酸菜樣本細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig. 4 Analysis results of bacterial flora structure of sauerkraut samples based on phylum level

2.6.2 基于屬水平酸菜樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的分析

兩個(gè)酸菜樣本中細(xì)菌微生物在屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)見圖5。由圖5可知，樣本SC1共含44個(gè)細(xì)菌屬，SC2共含42個(gè)細(xì)菌屬，樣本SC1和SC2均含有4種乳酸菌屬，分別為魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）。與樣本SC1相比，樣本SC2中4種乳酸菌屬的相對(duì)豐度均有小幅度的下降。其中含量最豐富的乳酸菌屬為Weissella，相對(duì)豐度由發(fā)酵前期的26.23%降至發(fā)酵后期的25.47%；Leuconostoc的相對(duì)豐度由發(fā)酵前期的1.46%降至發(fā)酵后期的0.27%；Lactococcus的相對(duì)豐度由發(fā)酵前期的0.60%降至0.41%；Lactobacillus的相對(duì)豐度由發(fā)酵前期的0.26%降至0.14%。此外，兩樣本中均檢測(cè)到一些功能細(xì)菌，其中真桿菌屬（[Eubacterium]_coprostanoligenes_group）在樣本SC1及SC2中的相對(duì)豐度分別為0.003%和0.008%，阿克曼菌屬（Akkermansia）在兩樣本中的相對(duì)豐度分別為0.014%和0.005%。研究表明真桿菌屬對(duì)調(diào)節(jié)血脂異常具有一定作用，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和部分臨床實(shí)驗(yàn)證明了阿克曼菌屬有作為益生菌劑的巨大潛力[19-20]。綜上所述，采用本實(shí)驗(yàn)工藝制成的酸菜在食品功能方面具有一定優(yōu)勢(shì)。

圖5 基于屬水平酸菜樣本細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig. 5 Analysis results of bacterial flora structure of sauerkraut samples based on genus level

3 討論

周藝萍[18]在研究鹽分對(duì)新平酸腌菜主發(fā)酵期細(xì)菌多樣性的影響中檢測(cè)到未分類的藍(lán)細(xì)菌屬（unidentifiedCyanobacteria）含量高達(dá)30.02%；劉長(zhǎng)根[21]在進(jìn)行傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的菌群結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌門，未知葉綠體（unidentified Chloroplast）為優(yōu)勢(shì)菌屬。本實(shí)驗(yàn)在SC1和SC2兩樣本中均檢測(cè)到藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria），相對(duì)豐度高達(dá)60%以上，該結(jié)果與劉長(zhǎng)根[21]的研究結(jié)果相似。

乳酸菌作為發(fā)酵蔬菜中的主要益生菌，在酸菜的整個(gè)發(fā)酵階段占據(jù)著重要地位。由酸菜發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)可知，發(fā)酵后期（72 h）酸菜的pH值為3.53，亞硝酸鹽含量降至2.67 mg/kg且趨于平穩(wěn)，分析原因?yàn)槿樗峋鷮?duì)大腸桿菌等致病菌有拮抗作用，污染菌在酸性環(huán)境下不耐受導(dǎo)致死亡。張慶芳等[22]研究發(fā)現(xiàn)，pH＜4.0時(shí)，乳酸菌降解亞硝酸鹽進(jìn)行酸降解階段。因此推斷在發(fā)酵后期（72 h）積累的乳酸菌加速了亞硝酸鹽的降解，導(dǎo)致亞硝酸鹽降至最低。本實(shí)驗(yàn)中酸菜發(fā)酵前期（SC1）和后期（SC2）共存在4種乳酸菌屬，分別為魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）。魏斯氏菌屬作為發(fā)酵前期和后期含量最多的乳酸菌屬，不僅能賦予發(fā)酵食品特殊的酸香風(fēng)味，還能適應(yīng)高濃度的鹽或酸性環(huán)境，對(duì)延長(zhǎng)發(fā)酵食品的保質(zhì)期有重要的研究意義[23]。近期研究發(fā)現(xiàn)，從食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）獲得的多糖合成基因簇可以提高植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的益生特性[24]。明串珠菌屬（Leuconostoc）也是眾多發(fā)酵食品中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌群，具有產(chǎn)酸、產(chǎn)甘露醇、產(chǎn)胞外多糖、抑菌等多種特性[25]。ZHANG Q等[26]從四川泡菜中分離出一株腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM187，具有良好的耐酸、耐膽鹽和降膽固醇等特性。CIRRINCIONE S等[27]研究發(fā)現(xiàn)一株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和一株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）具有增強(qiáng)發(fā)酵驢乳抗氧化活性的功能。

大腸桿菌志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、Erysipelatoclostridium、腸桿菌屬（Enterobacter）等部分致病菌在酸菜發(fā)酵前期（SC1）和后期（SC2）中也被檢測(cè)，相對(duì)豐度為0.01%左右，推測(cè)為初始腌制環(huán)境或白菜本身所攜帶。大腸桿菌富含硝酸還原酶，而白菜本身含有硝酸鹽，所以在發(fā)酵初期（0～12 h），大腸桿菌等小部分雜菌促進(jìn)了亞硝酸鹽的積累，使12 h達(dá)到亞硝酸鹽峰值；12 h的OD600nm值降至最低值，分析可能為大量亞硝酸鹽的抑菌作用導(dǎo)致此時(shí)細(xì)菌總數(shù)降至最低。

此外，通過觀察發(fā)酵前后期各物種及豐度變化情況，發(fā)現(xiàn)門和屬水平上相差不大。分析原因可能為本工藝在密閉發(fā)酵環(huán)境下進(jìn)行，和傳統(tǒng)開放式發(fā)酵環(huán)境不同，本工藝屬于封閉系統(tǒng)，與外界沒有物質(zhì)交換，發(fā)酵前期菌群來自于環(huán)境、水及蔬菜自身所攜帶，導(dǎo)致發(fā)酵前后期各物種及豐度變化不大。

4 結(jié)論

本研究采用一種新工藝發(fā)酵制備東北酸菜，其發(fā)酵12 h（前期）和72 h（后期）時(shí)，理化指標(biāo)（pH、亞硝酸鹽、總酸）及OD600nm值變化明顯，發(fā)酵前期酸菜樣本的物種豐富度及多樣性均高于發(fā)酵后期，兩個(gè)樣本在門和屬分類學(xué)水平上的菌群差異不大，發(fā)酵前期樣本共含7個(gè)門的44個(gè)菌屬，發(fā)酵后期樣本共含8個(gè)門的42個(gè)菌屬。兩樣本均含有4種乳酸菌屬，分別為魏斯氏屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus），其中魏斯氏屬（Weissella）相對(duì)豐度均最高，達(dá)25%以上，且在發(fā)酵后期4種乳酸菌的相對(duì)豐度略有下降。本研究發(fā)酵體系可以極大程度縮短?hào)|北酸菜的發(fā)酵周期且亞硝酸鹽含量低、乳酸菌含量豐富，對(duì)今后相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)具有一定的意義。