呂惠萍，馬心英，陳美鳳，朱 琪，曾會(huì)青

(菏澤學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,菏澤 274015)

腎上腺素(EP)是由腎上腺髓質(zhì)分泌的一種激素[1-2],在醫(yī)學(xué)上可作為擬腎上腺素藥,用來(lái)緩解心跳微弱、血壓下降、呼吸困難等癥狀,還可用于增加腎血流量、改善休克時(shí)重要器官的血液供應(yīng)[3],是拯救瀕死狀態(tài)下人和動(dòng)物的必備藥品[4-5]。過(guò)量或過(guò)少使用EP 均會(huì)影響機(jī)體的多項(xiàng)生理功能,導(dǎo)致人或動(dòng)物代謝紊亂,產(chǎn)生疾病,甚至危及生命[6]。因此,EP含量的測(cè)定在發(fā)展神經(jīng)生理學(xué)、診斷和控制醫(yī)學(xué)中具有重要作用[7]。

目前,常用的EP 測(cè)定方法有高效液相色譜法(HPLC)[8-11]、光化學(xué)法[12-13]、熒光法[14]等,但是這些方法需要昂貴的分析儀器、較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間和較多的樣品。電化學(xué)法[15-16]具有檢測(cè)成本低、靈敏度高、檢出限低、方法穩(wěn)定快速等特點(diǎn),在藥物分析中應(yīng)用廣泛[17-21]。EP 化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基,具有一定的電化學(xué)活性。聚鳥(niǎo)氨酸(POrn)具有穩(wěn)定性好和環(huán)境污染小的特點(diǎn),以POrn修飾的電極具有較好的選擇性、穩(wěn)定性和靈敏度,但目前還未見(jiàn)該修飾電極在EP檢測(cè)中的報(bào)道。

鑒于此,本工作制備了具有電催化活性的聚鳥(niǎo)氨酸修飾的玻碳電極(POrn/GCE),并用于鹽酸腎上腺素注射液中EP 含量的測(cè)定,方法具有較高的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性,可用于實(shí)際樣品中EP含量的測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI-660D 型電化學(xué)工作站;KQ-100型超聲波清洗器;MT 型紅外燈;78 HW-1型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器;SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器。

磷酸鹽緩沖溶液(PBS):pH 8.0,由適量0.1 mol·L－1磷酸氫二鈉溶液和0.1 mol·L－1檸檬酸溶液混合配制而成。

EP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:取0.045 5 g EP標(biāo)準(zhǔn)品,用PBS稀釋至50 mL,配置成5.0×10－3mol·L－1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

EP標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取一定量EP 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用PBS逐級(jí)稀釋,配制成2.0,3.0,4.0,5.0,10,20,30,40,50,100μmol·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

鳥(niǎo)氨酸(Orn)純度為98%;EP 標(biāo)準(zhǔn)品純度為98%;鹽酸腎上腺素注射液(1 mL∶1 mg)。

所用試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器工作條件

以GCE 或POrn/GCE 為工作電極,Ag/AgCl電極為參比電極,鉑絲電極為對(duì)電極;電解液為PBS(pH 8.0);電化學(xué)方法為循環(huán)伏安法(CV);掃描電位為－0.4～1.0 V;掃描速率為0.08 V·s－1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 POrn/GCE的制備

GCE經(jīng)滴在麂皮上的三氧化二鋁(粒徑為35～45μm)懸浮液拋光后,依次用50%(體積分?jǐn)?shù))硝酸溶液、無(wú)水乙醇、水各超聲清洗30 s,每次清洗后均用水沖洗干凈,紅外燈下干燥5 s。放入含1.0×10－4mol·L－1Orn的PBS(pH 8.0)中,用1.2節(jié)所述的三電極體系(工作電極為GCE),以10 m V·s－1掃描速率在－1.8～2.3 V 內(nèi)循環(huán)掃描12段,取出電極,用水清洗,紅外燈下干燥,即得POrn/GCE。

1.3.2 樣品的測(cè)定

取鹽酸腎上腺素注射液0.72 mL,用pH 8.0的PBS定容至50 mL 容量瓶中,分取10 mL 置于25 mL的小燒杯中,攪拌130 s,按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 EP的電化學(xué)行為

按照儀器工作條件測(cè)定空白溶液(PBS)和5.0μmol·L－1EP標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中曲線1和曲線3分別為空白溶液和EP 標(biāo)準(zhǔn)溶液在POrn/GCE 上的CV曲線,曲線2為EP標(biāo)準(zhǔn)溶液在GCE 上 的CV 曲線。

由圖1可知:EP在GCE上氧化峰電流(以絕對(duì)值計(jì),記為|ipa|)和還原峰電流(ipc)分別為15.3,1.66μA,氧化峰電位(Epa)和還原峰電位(Epc)分別為0.35,－0.07 V;EP 在POrn/GCE 上 的Epa、Epc和在GCE 上的基本一致,|ipa|、ipc分別為39.9,15.6μA,比在GCE上的均相對(duì)增大,說(shuō)明修飾電極對(duì)EP 的測(cè)定具有一定的催化作用,而空白溶液在POrn/GCE上幾乎無(wú)響應(yīng),說(shuō)明空白溶液對(duì)EP 測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 空白溶液和EP標(biāo)準(zhǔn)溶液的CV 曲線Fig.1 CV curves of blank solution and EP standard solution

2.2 POrn/GCE制備條件的選擇

電解液的酸度、掃描段數(shù)、掃描速率和掃描范圍(低、高掃描電位)對(duì)電極性能均有影響。采用單一變量法,按照1.3.1節(jié)試驗(yàn)方法測(cè)定,分別考察了電解液酸度分別為pH 2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,掃描段數(shù)分別為2,4,6,8,10,12,14,掃描速率分別為10,20,40,60,80,100,120 m V·s－1,低掃描電位分別為－2.0,－1.9,－1.8,－1.7,－1.6 V(固定高掃描電位為2.3 V),高掃描電位分別為1.9,2.1,2.3,2.4 V(固定低掃描電位為－1.8 V)時(shí)對(duì)EP 在POrn/GCE上|ipa|的影響,所得結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知,在電解液的酸度不小于pH 8.0,掃描段數(shù)為10～12,掃描速率為10 m V·s－1,高、低掃描電位分別為2.3,－1.8 V 時(shí),EP 在POrn/GCE上的|ipa|較大。為了使Orn盡可能地聚合在GCE上,試驗(yàn)選擇的電解液酸度為pH 8.0,掃描段數(shù)為12,掃描速率為10 m V·s－1,掃描范圍為－1.8～2.3 V。

圖2 電解液酸度、掃描段數(shù)、掃描速率、高掃描電位和低掃描電位對(duì)EP在POrn/GCE上的|ipa|的影響Fig.2 Effect of eletrolyte acidity,electropolymerization cycle,scanning rate,high scanning potential and low scanning potential on|ipa|of EP on POrn/GCE

在最優(yōu)制備條件下,所得聚合CV 曲線見(jiàn)圖3。

由圖3 可知,在0.4 V 處出現(xiàn)氧化峰,－0.5,－0.7 V 處出現(xiàn)還原峰,說(shuō)明電極表面發(fā)生了氧化還原反應(yīng)。掃描12段后,取出電極,觀察到其表面形成了深藍(lán)色的膜層。

圖3 聚合CV 曲線Fig.3 CV curves for polymerization

2.3 儀器工作條件的選擇

2.3.1 酸 度

酸度對(duì)電極反應(yīng)中EP峰電流及峰電位均有一定影響,因此試驗(yàn)考察了電解液酸度分別為pH 2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0 時(shí) 對(duì)EP 在POrn/GCE 上電化學(xué)響應(yīng)的影響,所得CV 變化曲線見(jiàn)圖4(a)(其中曲線1～7 對(duì)應(yīng)酸度分別為pH 2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0)。以Epa為縱 坐標(biāo),酸度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合,所得結(jié)果見(jiàn)圖4(b)。

由圖4可知:在酸度為pH 8.0時(shí),EP在POrn/GCE上的|ipa|較大,因此試驗(yàn)選擇的酸度為p H8.0;Epa隨著pH 的增加而降低,二者呈線性關(guān)系,線性回歸方程為Epa＝0.881 3－0.058 70 p H,相關(guān)系數(shù)為0.992 7,斜率的絕對(duì)值(0.058 7)接近0.059[22],表明EP氧化還原反應(yīng)是一個(gè)有質(zhì)子參與的過(guò)程,且參與反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)和電子數(shù)相同。

圖4 不同酸度下CV 曲線和Epa隨酸度變化的曲線Fig.4 CV curves with different acidities of eletrolyte and curve showing changes of Epa with acidity of eletrolyte

2.3.2 掃描速率

試驗(yàn)考察了掃描速率分別為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20 V·s－1時(shí) 對(duì)EP在POrn/GCE 上電化學(xué)響應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5(a)。以|ipa|為縱坐標(biāo),掃描速率為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合,所得結(jié)果見(jiàn)圖5(b)。

圖5 不同掃描速率下的CV 曲線和|ipa|隨掃描速率變化的曲線Fig.5 CV curves with different scanning rates and curve showing changes of|ipa|with scanning rate

由圖5 可知:|ipa|隨著掃描速率的增加而增加,考慮到電極靈敏度會(huì)隨掃描速率的增加而下降,而掃描速率為0.08 V·s－1時(shí)的峰形較好,因此試驗(yàn)選擇的掃描速率為0.08 V·s－1;|ipa|與掃描速率呈線性關(guān)系,線性回歸方程為|ipa|＝8.960×10－5＋8.330×10－4v,相關(guān)系數(shù)為0.995 4,說(shuō)明EP 在POrn/GCE上的反應(yīng)為吸附控制過(guò)程。

2.3.3 高、低掃描電位和攪拌時(shí)間

高、低掃描電位以及攪拌時(shí)間對(duì)EP 在POrn/GCE上的|ipa|有一定影響。因此,試驗(yàn)考察了高掃描電位分別為0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 V(固定低掃描電位為－0.4 V),低掃描電位分別為－0.8,－0.6,－0.4,－0.2,0 V(固定高掃描電位為1.0 V),攪拌時(shí)間分別為10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150 s時(shí) 對(duì)EP 在POrn/GCE 上|ipa|的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)高、低掃描電位分別為1.0,－0.4 V,攪拌時(shí)間為130 s時(shí),EP 在POrn/GCE上的|ipa|達(dá)到最大。因此,試驗(yàn)選擇的電位掃描范圍為－0.4～1.0 V,攪拌時(shí)間為130 s。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件分析EP 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以EP的濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的|ipa|為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為2.0～100μmol·L－1,線性回歸方程為y＝2.190x＋1.977×10－5,相關(guān)系數(shù)為0.991 5。

以出現(xiàn)可見(jiàn)|ipa|對(duì)應(yīng)濃度作為檢出限,結(jié)果為0.13μmol·L－1。

2.5 干擾試驗(yàn)

色氨酸、甘氨酸、賴氨酸、尿素以及Cd2＋、Ca2＋、Al3＋、Fe3＋可能共存于體液中,干擾測(cè)試結(jié)果。因此,試驗(yàn)在50μmol·L－1EP標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入不同濃度的上述干擾物質(zhì),考察了這幾種物質(zhì)對(duì)EP 測(cè)定的干擾程度。結(jié)果顯示,在相對(duì)誤差的絕對(duì)值不大于5.0%時(shí),100倍的尿素、色氨酸、甘氨酸和賴氨酸,50倍的Cd2＋和Ca2＋,10倍的Al3＋和Fe3＋都不干擾EP的測(cè)定。

2.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照儀器工作條件重復(fù)測(cè)定5.0μmol·L－1EP標(biāo)準(zhǔn)溶液6 次,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),所得結(jié)果為3.9%,說(shuō)明POrn/GCE 有良好的重復(fù)性。

將POrn/GCE 避光恒溫保存7 d 后,再測(cè)量|ipa|,其較初始值減少了不到3.0%,說(shuō)明修飾電極有較好的穩(wěn)定性。

2.7 回收試驗(yàn)

按照1.3.2節(jié)試驗(yàn)方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算回收率,所得結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知:測(cè)定值與標(biāo)簽值基本相近,回收率為97.6%～102%,說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度較好。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of test for recovery

本工作制備了POrn/GCE,研究了EP 在該修飾電極上的電化學(xué)行為,電極的重復(fù)性和準(zhǔn)確度均較好,可用于EP實(shí)際樣品的測(cè)定,具有一定的應(yīng)用前景。