錢 映，李艷茹，馮月梅，王松梅，鐘讀波，殷建忠，3*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 營養(yǎng)與食品科學(xué)系,昆明 650500; 2.云南云測質(zhì)量檢驗(yàn)有限公司,昆明 650000;3.保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,保山 678000)

隨著經(jīng)濟(jì)全球化推進(jìn),人類飲食方式發(fā)生快速轉(zhuǎn)變,不健康的飲食行為已成為肥胖、Ⅱ型糖尿病等慢性病的主要發(fā)病及死亡因素[1]。膳食脂肪酸(FA)是人體必需的營養(yǎng)成分,其不僅參與生物膜組成[2],還參與調(diào)節(jié)機(jī)體酶活性與炎癥過程,在機(jī)體能量代謝中發(fā)揮重要作用[3]。當(dāng)攝入過量FA 及FA比例失衡時(shí),可引發(fā)機(jī)體代謝紊亂,導(dǎo)致肥胖、Ⅱ型糖尿病等疾病[4],且不同構(gòu)型FA 對機(jī)體健康影響也不同[5]。隨著營養(yǎng)基因組學(xué)日益發(fā)展,研究人員還發(fā)現(xiàn)FA 會改變機(jī)體表觀遺傳,調(diào)節(jié)基因表達(dá)與代謝反應(yīng),進(jìn)而影響人類某些慢性非傳染性疾病(NCD)的易感性[6-7]。為進(jìn)一步指導(dǎo)流行病學(xué)研究[8]及改善人類日常飲食行為,有必要評估個(gè)體FA 攝入水平。而現(xiàn)階段使用的膳食營養(yǎng)調(diào)查法存在諸多缺陷,如測量誤差較大、難以精準(zhǔn)定量等。因此,有必要開發(fā)可準(zhǔn)確、可靠地反映組織或血液中FA 水平的方法。

目前,總脂肪酸(包括游離脂肪酸和結(jié)合脂肪酸)測定方法有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、附火焰離子化檢測器的氣相色譜法(FID-GC)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)。其中,LC-MS溶劑消耗量大、選擇性低[9],FID-GC則不能使用穩(wěn)定同位素反映FA的合成、代謝等過程[10],而GC-MS操作快速、結(jié)果穩(wěn)健[11]。人血漿中單個(gè)游離脂肪酸的定性或定量分析方法主要為GC-MS 或LC-MS,其中GC-MS為檢測FA 的標(biāo)準(zhǔn)方法,檢測效率、準(zhǔn)確度及靈敏度均較高[12-13],選擇性較好[14],可捕獲更多FA 結(jié)構(gòu)信息[11-13,15],且目前已有較健全的FA 鑒定數(shù)據(jù)庫。然而,由于FA 結(jié)構(gòu)的多樣性,需要開發(fā)精確、有效、檢出率高且可全面評估生物樣本中FA 種類及含量的方法[16]。但是,在用GC-MS檢測實(shí)際樣品時(shí),其精確度會受諸多條件制約,如提取方法、衍生方法、色譜柱以及內(nèi)標(biāo)物等,優(yōu)化過程冗長復(fù)雜。鑒于此,本工作在硫酸催化條件下,依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.168－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》,確定37種FA 為研究對象,利用甲醇衍生化人血漿中FA,并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件,GC-MS測定各FA 含量,該方法簡單、快速、可檢測FA 種類多、檢出限低,具有一定實(shí)踐意義。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2010 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,配FID;DN-12A 型氮?dú)獯蹈蓛x;CT14DII型低速大容量多管架離心機(jī);H1850型臺式高速離心機(jī);HCD-1820-1型純水儀;AR1140/C 型電子天平;HH-3A型數(shù)顯恒溫水浴鍋;MVS-1 型渦旋混合儀;SK3300 H 型超聲波清洗儀。

37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:50 mg·L－1,編號為M20-D。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用正己烷逐級稀釋,配制成0.1,0.5,1,5,10,25,50 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

含0.4 mol·L－1氫氧化鉀的甲醇溶液:取0.672 g氫氧化鉀,用30 mL甲醇溶解,混勻備用。

含7%(體積分?jǐn)?shù),下同)硫酸的甲醇溶液:取700μL硫酸,加入10 mL甲醇,混勻備用。

氫氧化鉀、硫酸為分析純;甲醇、正己烷、乙腈為色譜純;氮?dú)獾募兌炔恍∮?9.999%;試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 進(jìn)樣條件

溶劑沖洗次數(shù)(進(jìn)樣后)2 次;樣品沖洗次數(shù)2次;高柱塞速率模式,流量10 mL·min－1;黏度補(bǔ)償時(shí)間0.2 s;柱塞進(jìn)樣壓力100 kPa;進(jìn)樣速率為高模式。

1.2.2 色譜條件

Rt-2560色譜柱(100 m×0.25 mm,0.2μm);載氣為氦氣,純度為99.999%;柱溫60℃;進(jìn)樣口溫度240 ℃;初始壓力500～900 kPa;流量控制方式為壓力,壓力228.9 kPa,總流量17.3 mL·min－1;柱流量1.3 mL·min－1;線速率22.8 cm·s－1;吹掃流量3 mL·min－1。柱升溫程序:初始溫度60 ℃,保持5 min;以5 ℃·min－1速率升溫至165 ℃,保持1 min;以2 ℃·min－1速率升溫至225 ℃,保持27 min,總時(shí)間84 min。進(jìn)樣量1μL;分流進(jìn)樣,分流比為10∶1。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子(EI)源;離子源溫度230℃,接口溫度250 ℃;溶劑延遲時(shí)間3 min;采集方式為選擇離子監(jiān)測。

其他質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

表1(續(xù))

1.3 試驗(yàn)方法

在文獻(xiàn)[17-19]的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)。從－80 ℃冰箱中取出人血漿樣品,在4 ℃冰箱中融化。分取100μL,加入500μL含0.4 mol·L－1氫氧化鉀的甲醇溶液,渦旋30 s,室溫放置10 min。加入2 mL正己烷,以5 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至離心管中,加入含7%硫酸(催化劑)的甲醇溶液1 mL,吹氮至干,加入200μL水,于65℃水浴鍋中反應(yīng)20 min。冷卻至室溫,加入2 mL正己烷,分取上層清液約1 mL,按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化催化反應(yīng)條件

以血漿樣品中C14:0、C16:0、C16:1 n－7、C18:0、C18:1 n－9t、C18:2 n－6c、C18:3 n－3等7種最具代表性FA 為待測對象,考察和FA 甲酯化有關(guān)的3種因素[催化劑(硫酸)體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度]對7種FA 含量的影響。

2.1.1 硫酸體積分?jǐn)?shù)

適當(dāng)濃度水平的催化劑可縮短反應(yīng)時(shí)間,提高反應(yīng)效率。試驗(yàn)比較了硫酸體積分?jǐn)?shù)分別為1%,4%,7%,10%,13%時(shí)的檢測結(jié)果,如圖1所示。

由圖1可知:各FA 含量隨硫酸體積分?jǐn)?shù)的增大先增大后減小;當(dāng)硫酸體積分?jǐn)?shù)為7%時(shí),血漿中各FA 含量較大。因此,試驗(yàn)選擇硫酸的體積分?jǐn)?shù)為7%。

圖1 硫酸體積分?jǐn)?shù)對血漿樣品中7種FA 含量的影響Fig.1 Effect of volume fraction of sulfuric acid on the content of the 7 FAs in plasma sample

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間的選擇很重要,時(shí)間過長或過短均會影響血漿中FA 甲酯化的程度。試驗(yàn)比較了反應(yīng)時(shí)間分別為20,30,60,90 min時(shí)的檢測結(jié)果,如圖2所示。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對血漿樣品中7種FA 含量的影響Fig.2 Effect of reaction time on the content of the 7 FAs in plasma sample

由圖2可知:各FA 含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長先增加后降低,最后趨于平緩;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí),各FA 含量較大。因此,試驗(yàn)選擇的反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2.1.3 反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度會影響血漿樣品中FA 甲酯化的反應(yīng)速率、反應(yīng)時(shí)間以及FA 轉(zhuǎn)化率。試驗(yàn)比較了反應(yīng)溫度分別為40,50,60,70,80 ℃時(shí)的檢測結(jié)果,如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對血漿樣品中7種FA 含量的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the content of the 7 FAs in plasma sample

由圖3可知:隨反應(yīng)溫度的升高,各FA 含量先降低或變化不大;當(dāng)反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí),各FA 含量較大;反應(yīng)溫度繼續(xù)升高,各FA 含量逐漸降低。因此,試驗(yàn)選擇的反應(yīng)溫度為70 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化催化反應(yīng)條件

為進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件,設(shè)計(jì)硫酸體積分?jǐn)?shù)(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)、空白(D)四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)因素水平如表2所示,以上述7種FA 的總含量評價(jià)結(jié)果,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Design and results of orthogonal experiment

表3(續(xù))

結(jié)合R值可知,對FA 總含量影響程度從大到小的因素分別為反應(yīng)溫度、硫酸體積分?jǐn)?shù)和反應(yīng)時(shí)間;結(jié)合K值可知,A2B1C1為正交試驗(yàn)最佳條件的組合,即硫酸體積分?jǐn)?shù)為7%、反應(yīng)時(shí)間為20 min、反應(yīng)溫度為65 ℃。用此條件進(jìn)行試驗(yàn),所得7種FA總質(zhì)量濃度為119.859 mg·L－1,高于表3中的最大值(118.941 mg·L－1),說明所選條件較優(yōu)。

用方差分析進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的有效性,當(dāng)自由度為2、置信度為95%時(shí),因素A、B、C所得F值為12.665,2.735,25.966,影響程度排序和正交試驗(yàn)的一致,其中因素C 的F值大于臨界值(19.000),說明該因素具有顯著性影響。

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖4所示。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.4 Chromatogram of the mixed standard solution

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件對37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定,以各FA 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各FA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為0.1～50 mg·L－1,其他線性參數(shù)如表4所示。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),所得結(jié)果如表4所示。

表4 線性參數(shù)和檢出限Tab.4 Linearity parameters and detection limits

表4(續(xù))

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

將質(zhì)控樣品(FA 檢出種類見表5)在1 d內(nèi)重復(fù)測定5次,確定該方法的日內(nèi)精密度;連續(xù)測定5 d,確定該方法的日間精密度,計(jì)算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果如表5所示。

由表5可知,FA測定值的RSD 為0.27%～6.2%(日內(nèi))和0.91%～8.7%(日間),均低于10%,說明該方法精密度較好。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.5 Results of test for precision(n=5)

依據(jù)實(shí)際血漿樣品FA 的質(zhì)量濃度范圍(1～10 mg·L－1),按照試驗(yàn)方法對血漿質(zhì)控樣品進(jìn)行3個(gè)具代表性濃度水平(1,5,10 mg·L－1)的加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算回收率,結(jié)果如表6所示。

表6 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of test for recovery

由表6可知,質(zhì)控樣品中共檢測出17種FA,FA 回收率為80.0%～118%,說明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.5 樣品分析

按照試驗(yàn)方法測定云南4個(gè)特有少數(shù)民族哈尼族、納西族、布朗族和佤族共1 913個(gè)血漿樣品(包括正常組和肥胖組)中各FA 含量,用于探討這些少數(shù)民族人群肥胖發(fā)生與血漿中FA 的關(guān)系。結(jié)果顯示:4個(gè)特有少數(shù)民族肥胖組血漿中FA 含量水平均高于正常組;FA 種類及含量在不同民族間的分布存在差異,其中納西族血漿中FA 總含量最高,而哈尼族血漿中的最低,C16:0、C20:3 n－6可能分別是哈尼族、佤族人群肥胖發(fā)生的危險(xiǎn)因素,而C18:0可能是納西族人群肥胖防控的保護(hù)因素[20]。

本工作通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了GCMS測定人血漿中FA 含量時(shí)前處理過程中的催化條件,并確定最優(yōu)催化條件:催化劑硫酸體積分?jǐn)?shù)為7%,反應(yīng)溫度為65 ℃,反應(yīng)時(shí)間為20 min。以此條件可完成37種FA 的分離和測定,并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析。該方法分離度高、精密度和準(zhǔn)確度好,可為GC-MS檢測人體血漿中FA提供方法參考。