李竹君 陸 娜 于 洋 劉 穎△

（1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院放射科 上海 200040）

膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是星形細胞膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的腦腫瘤。大部分患者的預(yù)后不佳，中位生存期一般低于1 年［1］。侵襲力在膠質(zhì)瘤進展及其惡性程度評價中發(fā)揮著重要作用［2］，且已成為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的重要靶向［3-5］，因而評價膠質(zhì)瘤的侵襲力在臨床上有較高的應(yīng)用價值。

評價膠質(zhì)瘤侵襲力的金標(biāo)準(zhǔn)是免疫組織化學(xué)染色，主要有基質(zhì)金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、缺 氧 誘 導(dǎo) 因 子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。MMP2 可以降解Ⅳ型膠原，即降解基膜可反映腫瘤侵襲力［6-7］；HIF1α 反映組織中的氧穩(wěn)態(tài)，在膠質(zhì)瘤的微血管生成中擔(dān)任重要角色［8-9］；VEGF在腫瘤組織血管生成中發(fā)揮核心作用，指征膠質(zhì)瘤侵襲力［10］。但免疫組化所用的組織標(biāo)本一般通過手術(shù)、穿刺、活檢等有創(chuàng)方式獲取且周期較長，因此探尋一種無創(chuàng)活體評價膠質(zhì)瘤侵襲力的方法有助于簡化診療過程，減少患者負擔(dān)。

乙酰唑胺是臨床上常用來擴張血管的藥物，在正常情況下會使腦阻力血管擴張進而引發(fā)腦血流量上升［11］。乙酰唑胺負荷常被用來檢測腦血管異常區(qū)域，有用于診斷慢性腦供血不足、頸動脈狹窄等疾病的潛力［12-13］，但尚未應(yīng)用到腫瘤診斷層面，而神經(jīng)膠質(zhì)瘤也無法耐受乙酰唑胺的舒血管作用。因此，通過乙酰唑胺負荷前后腦部CT 灌注生物標(biāo)志物的變化可以了解膠質(zhì)瘤的生長狀況。本研究旨在尋找可以無創(chuàng)評價膠質(zhì)瘤侵襲力的CT 灌注生物標(biāo)志物。

材料和方法

大鼠膠質(zhì)瘤模型建立20 只雄性清潔級SD（Sprgue-Dawley）大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），重約250~300 g，隨機分成4 組，每組5 只，分別為膠質(zhì)瘤原位植入10、14、18 天組以及對照組。接種前，每只大鼠用2%異氟烷麻醉，再將其固定于立體定位儀上，沿頭皮中縫行縱線切口。在顱骨上鉆1 mm 直徑圓孔，孔洞位置在前囟前方1 mm，偏右3 mm。用微量進樣針緩慢推入10 μL 的C6 膠質(zhì)瘤PBS 混懸液，注射速度約為1 μL/min，深度在顱骨下方5 mm，留置5 min 后慢速抽出，用少量骨蠟輕擦孔洞，再縫合頭皮。約10 天后大鼠C6 膠質(zhì)瘤動物模型可建成。

SD 大鼠飼養(yǎng)均在清潔標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，12 h/12 h光暗周期。實驗操作符合復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院動物實驗倫理要求（2020 華山醫(yī)院JS-057）。

負荷試驗與CT 灌注成像CT 掃描在256 層CT 機型（Philips Brilliance iCT 256，美國Cleveland公司）上開展，試驗前大鼠先用2%異氟烷麻醉，將靜脈留置針插入大鼠陰莖背靜脈中以進行對比劑給藥。首次掃描時確保整個鼠腦處于可掃描范圍之內(nèi)。用高壓注射器以1mL/s 的流速注射對比劑歐 乃 派 克（2 mL/kg，Omnipaque?300，美 國GE 公司）。CT 灌注成像流程見本團隊文獻［14］。

CT 數(shù)據(jù)處理采用Philips 自帶軟件，流入動脈為大腦中動脈，基于去卷積運算，生成偽彩圖。在每張彩圖上劃定3 個感興趣區(qū)（region of interest，ROIs），取平均值。在乙酰唑胺負荷前后記錄腦血流量（cerebral blood flow，CBF）、腦血容量（cerebral blood volume，CBV）、表 面通透性（surfacepermeability，PS），并計算百分比變化率。

免疫組織化學(xué)染色每組大鼠于對應(yīng)天數(shù)進行CO2吸入型安樂死，然后用4%多聚甲醛進行灌注固定。所有大鼠腦組織石蠟切片均經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化流程進行脫臘，抗原修復(fù)以及封閉后敷一抗。所用一抗為HIF1α（A16873，中國愛博泰克公司）、MMP2（NB200-193，美國Novus Biologicals 公司）和VEGF（9698，美國CST 公司）。使用DAKO En Vision 系統(tǒng)（peroxidase/DAB+，兔/鼠）在標(biāo)準(zhǔn)方案下檢測抗體結(jié)合情況，蘇木精襯染。

染好的組織切片由兩名病理醫(yī)師分析，一致性達100%。采用半定量方法，每張切片挑選3~5 個視野，在光學(xué)顯微鏡下拍照（Stemi 305，德國Carl Zeiss 公司），使用I-solution 軟件（I-Solution，加拿大IMT 公司）計算陽性率。

統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism（version 8.0）統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。獨立樣本配對t檢驗統(tǒng)計乙酰唑胺負荷前后影像學(xué)生物標(biāo)志物之間的關(guān)系。ANOVA 檢驗不同腫瘤種植組間的差異。灌注生物標(biāo)志物與HIF1α、MMP2、VEGF 之間的關(guān)系用Pearson 相關(guān)系數(shù)進行分析。經(jīng)Bonferroni 校正后，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

負荷試驗前后組內(nèi)灌注成像生物標(biāo)志物對比與對照組相比，乙酰唑胺負荷前生物標(biāo)志物CBF、CBV、PS 值均隨種植天數(shù)的增加而上升（P<0.01）。施加負荷之后，CBF、CBV、PS 數(shù)值全部大于負荷之前的生物標(biāo)志物值（P<0.01，表1）。14 天組別大鼠乙酰唑胺負荷前后CT 灌注彩圖見圖1。

表1 乙酰唑胺負荷前后CBF，CBV 和PS 水平Tab 1 Levels of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

表1 乙酰唑胺負荷前后CBF，CBV 和PS 水平Tab 1 Levels of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

（1）vs.pre-challenge，（2）vs.control，（3）vs.day 10，（4）vs.day 14 ，P<0.01.

Group Control Day10 Day14 Day18 n 555 5 CBFpre-challenge（mL·100 g-1·min-1）53.7±4.7 63.1±2.0（2）77.4±14.0（2）（3）95.0±1.4（2）（3）（4）CBF post-challenge（mL·100 g-1·min-1）118.4±18.3（1）163.5±3.0（1）154.7±6.9（1）146.9±2.5（1）CBV pre-challenge（mL/100 g）8.6±0.8 38.2±0.9（2）46.0±1.2（2）50.1±1.2（2）（3）CBV post-challenge（mL/100 g）19.3±1.5（1）57.3±1.3（1）57.3±7.7（1）62.3±2.3（1）PS pre-challenge（mL·100 g-1·min-1）1.2±0.1 10.9±0.8（2）15.5±0.6（2）（3）18.2±0.3（2）（3）（4）PS post-challenge（mL·100 g-1·min-1）11.2±0.8（1）31.0±0.8（1）27.0±0.2（1）19.0±0.2（1）

圖1 大鼠C6 膠質(zhì)瘤乙酰唑胺負荷前后CT 灌注彩圖Fig 1 CT perfusion color maps in a rat with C6 gliomas pre and post acetazolamide challenge

負荷后不同組間灌注成像生物標(biāo)志物對比與對照組相比，18 天組CBF 百分比變化率顯著降低（P<0.01），10 天組、14 天組與對照組之間無明顯差異。相對于對照組，10 天組、14 天組、18 天組CBV及PS 百分比變化率顯著降低，且隨著腫瘤種植天數(shù)的增加，CBV 及PS 百分比變化率隨之降低（P<0.01，表2）。

表2 乙酰唑胺負荷前后CBF，CBV，PS 百分比變化率Tab 2 Percentage changes of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

表2 乙酰唑胺負荷前后CBF，CBV，PS 百分比變化率Tab 2 Percentage changes of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

（1）vs.Control，（2）vs.day 10，（3）vs.day 14，P<0.01.

Group Control Day 10 Day 14 Day 18 n 5 5 5 5 CBF percentage change（%）119.5±21.2 127.5±5.2 105.0±36.2 54.6±2.0（1）CBV percentage change（%）125.6±9.0 50.2±5.8（1）24.6±15.1（1）（2）24.5±4.3（1）（2）PS percentage change（%）816.2±116.4 185.5±19.8（1）74.6±6.0（1）（2）4.5±0.8（1）（2）（3）

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析14 天組和18 天組 的VEGF、MMP2 和HIF1α 高 于10 天 組（P<0.01）。18 天 組 的VEGF、MMP2 和HIF1α 高 于14天組（P<0.01）。10 天、14 天和18 天組中所有免疫組化病理學(xué)標(biāo)志物陽性率見表3。10 天、14 天和18天組的鏡下免疫組化結(jié)果見圖2。

圖2 大鼠C6 膠質(zhì)瘤HIF1α、MMP2、VEGF 免疫組織化學(xué)染色圖Fig 2 Histologic images of HIF1α，MMP2 and VEGF staining in rats with C6 gliomas

表3 大鼠C6 膠質(zhì)瘤HIF1α、MMP2 和VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Tab 3 Histopathological values of HIF1α，MMP2，VEGF in rats with C6 gliomas （±s）

表3 大鼠C6 膠質(zhì)瘤HIF1α、MMP2 和VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Tab 3 Histopathological values of HIF1α，MMP2，VEGF in rats with C6 gliomas （±s）

（1）vs.day 10；（2）vs.day 14，P<0.01.

Group Day 10 Day 14 Day 18 n 5 5 5 HIF1α 2.82±0.9 5.7±0.7（1）9.2±1.1（1）（2）MMP2 1.8±0.5 3.9±0.8（1）7.2±1.1（1）（2）VEGF 3.9±0.3 7.5±1.7（1）12.4±1.3（1）（2）

灌注生物標(biāo)志物與HIF1α，MMP2，VEGF 之間相關(guān)性分析HIF1α、MMP2、VEGF 與負荷前CBF、CBV、PS 呈正相關(guān)。HIF1α、MMP2、VEGF和CBF、CBV、PS 百分比變化率之間呈負相關(guān)（P<0.01，表4 和圖3）。

圖3 大鼠C6 膠質(zhì)瘤HIF1α、MMP2、VEGF 與CT 灌注生物標(biāo)志物之間Pearson 相關(guān)性分析圖Fig 3 Pearson correlation diagrams between HIF1α，MMP2，VEGF and PCT with challenge parameters in rats with C6 glioma

表4 大鼠C6 膠質(zhì)瘤HIF1α，MMP2，VEGF 與CT 灌注生物標(biāo)志物之間Pearson 相關(guān)性分析Tab 4 Pearson correlation of PCT with challenge parameters and histopathological values in rats with C6 gliomas

討 論

CT 灌注成像在腦腫瘤診斷中應(yīng)用廣泛，檢查速度快、結(jié)果直觀準(zhǔn)確，可無創(chuàng)地評價微循環(huán)血流動力學(xué)變化。研究顯示256 層CT 灌注成像生物標(biāo)志物CBV、CBF 和PS 能有效反映人腦膠質(zhì)瘤的血管生成狀況，證明CT 灌注成像在評估腫瘤生長上有很大潛力［15］。評價腫瘤進展必須考慮多個因素，已有研究指出抗血管生成治療會誘發(fā)腫瘤侵襲力增強進而導(dǎo)致其惡性進展［16］，因此，多維度評價膠質(zhì)瘤進展至關(guān)重要。

HIF1α、MMP2 和VEGF 作為常 見的組織病理學(xué)生物標(biāo)記物在膠質(zhì)瘤評價中有重要意義。膠質(zhì)瘤內(nèi)部通常是缺氧環(huán)境，腫瘤細胞為了降低氧消耗會抑制HIF-1 降解，進一步活化HIF1α 亞基信號通路，刺激其下游因子如VEGF、MMP2 的表達，促進腫瘤血管生成，調(diào)節(jié)細胞代謝，增強腫瘤的生長與侵襲［17］。另一方面，研究指出VEGF/VEGF2 信號通路能增強血管通透性，幫助腫瘤細胞滲出和轉(zhuǎn)移，VEGF 本身也可以降低腫瘤細胞免疫應(yīng)答，促進腫瘤細胞的浸潤，且VEGF 與MMP2 通常在腫瘤中 的 表 達 水 平 成 正 相 關(guān)［18-19］。由 此 可 見，HIF1α、MMP2 和VEGF 3 種因子的免疫組化染色結(jié)果能為評價大鼠C6 膠質(zhì)瘤的侵襲能力提供有力證據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)CBF 百分比變化率、CBV 百分比變化率和PS 百分比變化率與標(biāo)記腫瘤侵襲力的組織病理學(xué)生物標(biāo)志物間呈現(xiàn)負相關(guān)，即HIF1α、MMP2、VEGF 免疫組化陽性率越高，腫瘤的侵襲能力越強，病變血管對乙酰唑胺的反應(yīng)也越微弱，表現(xiàn)在CBF、CBV 和PS 的百分比變化率越小。本研究注意到PS 百分比變化率相關(guān)性尤其顯著，這一發(fā)現(xiàn)與先前研究結(jié)果吻合，即血腦屏障（blood brain barrier，BBB）完整性的破壞與膠質(zhì)瘤的侵襲能力之間聯(lián)系緊密，而血腦屏障完整性一般是用CT 灌注成像技術(shù)計算對比劑從血管內(nèi)到血管外組織間隙的單向傳輸速率進而獲得表面通透性（PS）的定量數(shù)據(jù)來表示［20-21］。

與磁共振（MRI）灌注成像相比，CT 灌注成像成本更低，檢測方便，獲得的是完全定量的數(shù)據(jù)，且CT 灌注成像不容易受鈣化、出血、金屬等影響，因此目前應(yīng)用更加廣泛［22］。本研究通過對比標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)診斷標(biāo)記物，進一步明確CT 灌注生物標(biāo)志物與腫瘤侵襲力的相關(guān)性，可能為臨床醫(yī)師提供更直觀可靠的影像學(xué)依據(jù)。

本研究的局限性在于缺乏直接的臨床試驗證據(jù)，人與大鼠之間確實存在諸多差異?？紤]到試驗中輻射劑量隨采集次數(shù)線性增加，確實不宜招募志愿患者在臨床實踐中進行該試驗。但無論如何，本研究希望其結(jié)果可以為膠質(zhì)母細胞瘤的臨床影像學(xué)檢測提供更多的解讀思路。

綜上所述，本研究證實CT 灌注成像影像學(xué)生物標(biāo)志物CBF 百分比變化率、CBV 百分比變化率和PS 百分比變化率作為膠質(zhì)瘤侵襲力預(yù)測指標(biāo)有一定意義，乙酰唑胺負荷CT 灌注成像在無創(chuàng)評價膠質(zhì)瘤侵襲力的過程中具有潛在的應(yīng)用價值。

作者貢獻聲明李竹君 動物和細胞實驗，文章撰寫。陸娜 CT 影像學(xué)部分實驗。于洋 影像學(xué)實驗數(shù)據(jù)分析。劉穎 免疫組織化學(xué)結(jié)果分析。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。