王亞濤 程 妍 徐靜遠(yuǎn) 史海濤 王 凱 魯曉嵐，△

（1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科 西安 710004；2復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院消化科 上海 201399）

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率不斷上升［1-2］，有成為我國第一大肝病的趨勢(shì)［3-4］，其危害不容忽視。NAFLD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)接受NAFLD 腸道菌群移植的小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪含量增加及胰島素抵抗［5］，提示腸道菌群在NAFLD 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-likepeptide1，GLP-1）是L 細(xì)胞分泌的一種十分重要的腸促胰島素，其受體分布廣泛，具有改善糖脂代謝紊亂等作用［6］。NAFLD 患者存在血清GLP-1 水平下降［7］，但尚不清楚是否因?yàn)長 細(xì)胞合成分泌減少還是酶降解增加所造成。分泌GLP-1 的L 細(xì)胞主要存在于結(jié)腸［8］，而結(jié)腸的細(xì)菌數(shù)量最多。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與腸促胰素存在密切關(guān)系，雙歧桿菌可影響小鼠L細(xì)胞數(shù)量和GLP-1 分泌［9］，降低小鼠腸促胰素效應(yīng)，但NAFLD 腸道菌群改變能否直接影響腸促胰素效應(yīng)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過糞菌移植方式探討NAFLD 大鼠腸道菌群對(duì)結(jié)腸L 細(xì)胞和GLP-1/GLP-1R 的影響，從腸促胰素效應(yīng)角度研究NAFLD腸道菌群在NAFLD 發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料和方法

主要試劑40 只6 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，購自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；StoolGen DNA kit試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）購自TAKARA寶生物工程有限公司；大鼠GLP-1 和GLP-1R 酶聯(lián)免 疫 測(cè) 定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自南京森貝伽有限公司；PCR 引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；雙歧桿菌、大腸埃希菌、腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，乳桿菌購自廣東省微生物菌種保藏中心。

動(dòng)物造模及飼養(yǎng)本研究經(jīng)西安交通大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)起訖時(shí)間為2019 年5 月—2020 年5 月。20 只大鼠隨機(jī)分為2 組，每組10 只，一組喂以高脂飼料（high-fat diet，HFD 組），一組喂以普通飼料（normal diet，ND 組），飼養(yǎng)16 周。另取20只大鼠，喂以混合口服非吸收性抗生素飲用水（慶大霉素100 μg/mL、磺卞青霉素2 500 μg/mL、頭孢硫脒2 500 μg/mL、兩性霉素B 30 μg/mL）2 周，建立偽腸道無菌大鼠模型，需氧和厭氧培養(yǎng)瓶糞便培養(yǎng)3 天和7 天驗(yàn)證模型是否成功，并隨機(jī)分為兩組，每組10 只。從第15 周末開始每天分別收集HFD 組和ND 組大鼠糞便，0.9%生理鹽水（1 g∶5 mL）稀釋過濾制備成糞菌液，并在30 min 內(nèi)采用灌胃法分別移植到偽腸道無菌大鼠體內(nèi)（2 mL/只），1 天/次，持續(xù)1 周，形成移植HFD 腸菌組（Trans HFD 組）和移植ND 腸菌組（Trans ND 組）。移植前3 天停用抗生素，移植前1 天腹腔注射奧美拉唑（9 mg/kg）。移植后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8 周后，將大鼠隔夜禁食，10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔麻醉，收集空腹血標(biāo)本，然后50%葡萄糖溶液灌胃（5 mL/只），收集餐后1 h 門脈血、糞便、肝臟、結(jié)腸和胰腺組織標(biāo)本。大鼠飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SPF 級(jí)），12 h/12 h光暗循環(huán)，溫度22 ℃~23 ℃，濕度40%~60%，自由飲水進(jìn)食。自制高脂飼料：普通飼料50%，豬油10%，蔗糖7.5%，奶粉5%，蛋黃粉2.5%，豆粉15%，高溫高壓消毒。普通飼料由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一提供。

肝指數(shù)測(cè)定測(cè)量大鼠體質(zhì)量和肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)=肝質(zhì)量（g）／體質(zhì)量（g）×100%。

血生化指標(biāo)測(cè)定空腹血3 000 r/min、4 ℃離心15 min（離心半徑8.6 cm）后分離血清，日本島津全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、甘油三酯（triglyceride，TG）、膽固醇（total cholesterol，TC）水平，免疫放射法測(cè)空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平，計(jì)算胰島素抵抗指 數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）：FPG（mmol/L）×FIN（mIU/L）/22.5。

GLP-1/GLP-1R 測(cè) 定ELISA 檢 測(cè) 餐 后1 h 門脈血和結(jié)腸組織勻漿GLP-1 水平、肝臟和胰腺組織勻漿GLP-1R 水平。按照ELISA 試劑盒說明說進(jìn)行操作。

肝臟組織病理學(xué)觀察取相同部位拇指大小肝組織。HE 染色：10%甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色。油紅染色：OCT 包埋后冰凍切片，10%中性甲醛固定，油紅O 染色，60%異丙醇分色，蘇木精復(fù)染，明膠封片。光鏡下觀察肝臟脂變程度，并從脂變范圍、有無炎癥病灶、有無氣球樣變及有無纖維化4 個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行肝臟活動(dòng)性（NAFLD activity score，NAS）評(píng)分。病理組織評(píng)分由一位對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情的病理學(xué)醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估。

結(jié)腸L 細(xì)胞觀察免疫組化計(jì)數(shù)L 細(xì)胞。距回盲瓣1 cm 處結(jié)腸取1 cm，10%甲醛液固定、包埋、切片、脫蠟、水化、消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性、封閉后，加入兔抗GLP-1 多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，再依次滴加生物素化抗兔IgG 抗體、ABC 液，最后二氨基聯(lián)苯氨顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。光鏡下40 倍鏡隨機(jī)選取10 個(gè)不重疊視野計(jì)數(shù)平均每個(gè)視野L 細(xì)胞數(shù)量。

腸道細(xì)菌測(cè)定雙歧桿菌（Bifidobacterium longumCGMCC1.2186），MRS 培養(yǎng)基+0.05%半胱氨酸鹽酸鹽，37 ℃厭氧培養(yǎng)，引物序列F：5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’、R：5’-TAAGCGATGGACTTTCACACC-3’；乳桿菌（Lactobacillus salivariusGDMCC1.986），MRS 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)，引物序列F：5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’、R：5’-CACCGCTACACATGGAG-3’；大腸埃希菌（Escherichia coliCGMCC1.90），LB 培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)，引物序列F：5’-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3’、R：5’-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’；腸球菌（Enterococcus faecalisCGMCC1.125），M17 培養(yǎng)基+1% 葡萄糖，37 ℃培養(yǎng)，引物序列F：5’-CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT-3’、R：5’-ACTCGTTGTACTTCCCATTGT-3’。收集培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌，使用DNA 提取試劑盒提取DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值（D260）并計(jì)算DNA 濃度，并根據(jù)每種腸菌基因組大小計(jì)算模板數(shù)。將標(biāo)準(zhǔn)菌DNA 以無菌TE 稀釋10倍，制成標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，制作以Ct 值為縱坐標(biāo)、以不同稀釋模板數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。糞便基因組提取試劑盒提取大鼠糞便DNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定糞便中雙歧桿菌、乳桿菌、大腸埃希菌、腸球菌的Ct 值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糞便中各腸菌拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。Takara 熒光定量檢測(cè)儀檢驗(yàn)，Bio-rad IQ5System 分析軟件分析數(shù)據(jù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 處理，計(jì)量資料采用±s表示。方差齊時(shí)，樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若方差不齊時(shí)，樣本均數(shù)比較采用t’檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism 6.0 軟件制作柱狀圖，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

高脂飲食促進(jìn)NAFLD 大鼠模型形成，腸道菌群發(fā)生改變不同飼料飼養(yǎng)16 周后，HFD 組大鼠體質(zhì)量明顯高于ND 組（P=0.008），肝指數(shù)更高（P<0.001），TG、TC、FPG、FINS 水平及HOMAIR 也 明 顯 更 高（P=0.002；P=0.002；P=0.004；P<0.001；P=0.002），出現(xiàn)糖脂代謝紊亂（表1）。在光鏡下，HFD 組大鼠肝臟可見明顯脂肪變性，肝細(xì)胞的體積增大，充滿大小不一的脂肪空泡，而ND 組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞大小形態(tài)菌正常，未見脂肪空泡，無炎癥浸潤（圖1A）。提示NAFLD 造模成功。

表1 HFD 組和ND 組大鼠代謝指標(biāo)Tab 1 Metabolic indexes of rats in HFD group and ND group （±s）

表1 HFD 組和ND 組大鼠代謝指標(biāo)Tab 1 Metabolic indexes of rats in HFD group and ND group （±s）

TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；FPG：Fasting plasma glucose；FINS：Fasting insulin；HOMA-IR：Homeostasis model assessment of insulin resistance.

Group HFD ND t or t’P Body weight（g）633.79±27.38 582.00±24.05 4.494<0.001 Liver index×100 3.60±0.32 3.25±0.21 2.848 0.011 TC（mmol/L）2.59±0.67 1.56±0.60 3.594 0.002 TG（mmol/L）1.65±0.75 0.63±0.40 3.751 0.002 FPG（mmol/L）7.28±1.29 5.58±0.96 3.341 0.004 FINS（mIU/L）15.11±3.31 10.02±1.82 4.265<0.001 HOMA-IR 5.04±1.88 2.55±0.89 3.796 0.002

利用標(biāo)準(zhǔn)菌構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)糞便中4 種腸菌的Ct 值，計(jì)算出每克糞便中該腸菌拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。結(jié)果顯示，和ND 組相比，HFD 組大鼠糞便雙歧桿菌、乳桿菌含量減少（6.57±0.31vs.7.12±0.23，t=-4.575，P<0.001；7.07±0.32vs. 7.75±0.38，t=-4.302，P<0.001），腸球菌、大腸埃希菌含量增加（7.28±0.36vs. 6.50±0.47，t=4.109，P<0.001；7.77±0.33vs.7.15±0.38，t=3.932，P<0.001），腸道菌群發(fā)生了改變（圖1B）。

圖1 HFD 組和ND 組大鼠肝臟病理及腸菌變化Fig 1 Histopathology of liver and variations of gut microbiotaof rats in HFD group and ND group

移植HFD 組腸道菌群的大鼠脂肪肝更嚴(yán)重，腸促胰素效應(yīng)減低

體質(zhì)量、肝指數(shù)、血生化指標(biāo) 和Trans ND 組相比，Trans HFD 組大鼠體質(zhì)量增加更多（P=0.006），肝 指 數(shù) 更 高（P=0.048），TG、TC、FPG、FINS 水 平 及HOMA-IR 都 更 高（P=0.046，P=0.002，P=0.048，P=0.007，P=0.011），表現(xiàn)出更為明顯的糖脂代謝紊亂（表2）。

表2 Trans HFD 組和Trans ND 組大鼠代謝相關(guān)指標(biāo)Tab 2 Metabolic indexes of rats in Trans HFD group and Trans ND group （±s）

表2 Trans HFD 組和Trans ND 組大鼠代謝相關(guān)指標(biāo)Tab 2 Metabolic indexes of rats in Trans HFD group and Trans ND group （±s）

TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；FPG：Fasting plasma glucose；FINS：Fasting insulin；HOMA-IR：Homeostasis model assessment of insulin resistance.

Group Trans HFD Trans ND t or t’P Body weight（g）558.61±54.61 491.42±41.10 3.109 0.006 Liver index×100 3.54±0.13 3.41±0.14 2.120 0.048 TC（mmol/L）2.21±0.38 1.86±0.35 2.146 0.046 TG（mmol/L）1.28±0.21 0.96±0.18 3.558 0.002 FPG（mmol/L）6.94±0.52 6.48±0.46 2.117 0.048 FINS（mIU/L）13.68±1.90 11.54±0.92 3.197 0.007 HOMA-IR 4.25±0.90 3.34±0.50?2.827 0.011

肝臟組織病理學(xué) 光鏡下，Trans HFD 組大鼠肝細(xì)胞體積增大，排列明顯紊亂，可見明顯脂肪變性，充滿大小不一的脂肪空泡，炎癥細(xì)胞浸潤明顯；Trans ND 組肝細(xì)胞排列稍紊亂，可見少量大小不一的脂肪空泡及炎癥細(xì)胞浸潤（圖2）。NAS 評(píng)分顯示Trans HFD 組 大 鼠 為3.8±1.68，比Trans ND 組 的2.5±0.97 得分更高（t=2.112，P=0.049）。

圖2 Trans HFD 組和Trans ND 組大鼠肝臟HE 染色（400 倍鏡）和油紅染色（200 倍鏡）Fig 2 Histopathology in liver of rats by H&E staining（400×）and oil red O staining（200×）in Trans HFD group and Trans ND group

腸促胰素效應(yīng) 在40 倍鏡下平均每視野里Trans HFD 組大鼠結(jié)腸L 細(xì)胞數(shù)量較Trans ND 組明顯減少（P=0.037）（圖3）。和Trans ND 組相比，Trans HFD 組大鼠門脈血和結(jié)腸GLP-1 含量更低（P<0.001，P<0.001），提 示Trans HFD 組 大 鼠GLP-1 合成和分泌都減少；同時(shí)Trans HFD 組大鼠肝臟和胰腺GLP-1R 含量也較Trans ND 組更低（P<0.001；P<0.001），提 示Trans HFD 組 大 鼠GLP-1 作用于靶器官的能力更低（表3）。

圖3 Trans HFD 組和Trans ND 組大鼠結(jié)腸L 細(xì)胞（200 倍鏡）Fig 3 Colonic L cells of rats in Trans HFD group and Trans ND group（200×）

表3 Trans HFD 組和Trans ND 組大鼠腸促胰素效應(yīng)相關(guān)指標(biāo)Tab 3 The related indexes of incretin effect of rats in Trans HFD group and Trans ND group （±s）

表3 Trans HFD 組和Trans ND 組大鼠腸促胰素效應(yīng)相關(guān)指標(biāo)Tab 3 The related indexes of incretin effect of rats in Trans HFD group and Trans ND group （±s）

GLP-1/GLP-1R：Glucagon-like peptide 1 and its’receptor.

Group Trans HFD Trans ND t or t’P Colonic L cells（per 40× microscope）39.08±7.56 48.16±10.30-2.247 0.037 GLP-1 in portal blood（pmol/L）4.63±0.63 5.72±0.52-4.192 0.001 GLP-1 in colonic homogenate（pmol/L）60.65±12.99 89.36±16.28-4.360<0.001 GLP-1R in hepatic homogenate（mg/L）7.36±0.38 8.00±0.30-4.145<0.001 GLP-1R in pancreatic homogenate（mg/L）8.21±0.60 9.24±0.49-4.192 0.001

腸道菌群差異 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和糞便中4 種腸菌的Ct 值，計(jì)算出每克糞便中該菌拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。結(jié)果顯示，和Trans ND 組相比，Trans HFD 組大鼠糞便雙歧桿菌、乳桿菌含量更低（6.33±0.25vs.6.69±0.30，t=-2.852，P=0.011；6.90±0.17vs.7.39±0.38，t=-3.742，P=0.001），腸球菌、大腸埃希菌含量則更高（7.46±0.10vs.7.04±0.36，t=3.473，P=0.006；7.96±0.20vs.7.58±0.37，t=2.858，P=0.013）（圖4），且與HFD 組和ND 組大鼠的差異保持一致。

圖4 Trans HFD 組和Trans ND 組大鼠糞便腸菌變化Fig 4 Variations of gut microbiota of rats in the Trans HFD group and the Trans ND group

討 論

NAFLD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，越來越多的證據(jù)支持腸道菌群在NAFLD 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，而腸促胰素效應(yīng)的減低可能是腸道菌群影響NAFLD 重要機(jī)制之一。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到，高脂飲食可以誘導(dǎo)NAFLD 和腸菌改變，分別移植高脂飲食大鼠和正常飲食大鼠的腸菌給兩組普通大鼠后，繼續(xù)給予高脂飲食干預(yù)，移植高脂飲食腸菌的大鼠更容易產(chǎn)生肥胖、糖脂代謝紊亂和肝臟脂肪沉積，說明這種代謝的改變可以通過腸道菌群傳遞，高脂飲食誘導(dǎo)的腸菌改變促進(jìn)NAFLD 的發(fā)生發(fā)展。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)的腸菌改變不僅降低了GLP-1 的合成分泌水平，同時(shí)還降低了其作用于靶器官的能力，且GLP-1 合成分泌的減少是由L 細(xì)胞數(shù)量減少引起的。分泌GLP-1 的L 細(xì)胞位于結(jié)腸，與大量腸菌共存，深受腸道菌群的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，高脂飲食誘導(dǎo)大鼠糞便雙歧桿菌和乳桿菌降低，大腸埃希菌和腸球菌增加，且在移植后這種腸菌差異依然存在，提示這些腸菌的改變可能是影響腸促胰素效應(yīng)和NAFLD 的重要因素。

雙歧桿菌可以通過影響膽汁酸循環(huán)及抑制肝臟脂肪合成酶的活性降低血脂，將碳水化合物酵解成短鏈脂肪酸，促進(jìn)L 細(xì)胞生成及GLP-1 分泌等［9］。乳桿菌可產(chǎn)乳酸鹽，增加糞便丁酸含量，并增加腸上皮細(xì)胞對(duì)丁酸的攝取，促進(jìn)GLP-1 分泌［10］，同時(shí)還能促進(jìn)雙歧桿菌生長。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給小鼠喂食乳桿菌能夠降低高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪沉積［11-12］。大腸埃希菌過度生長可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo) 胰 島 素 抵 抗 和NAFLD 形 成［13-14］。腸 球 菌 和NAFLD 的關(guān)系說法不一，有研究發(fā)現(xiàn)和高脂飲食的普通小鼠相比，胃酸缺乏小鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的肝臟脂肪變性和糞便腸球菌過度生長［15］，提示腸球菌可能參與促進(jìn)NAFLD 形成，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論一致，盡管在另一些研究中NAFLD 和腸球菌并不存在顯著關(guān)聯(lián)［16］。

我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高脂飲食可以誘導(dǎo)腸道菌群發(fā)生改變，進(jìn)而通過減少L 細(xì)胞數(shù)量，降低GLP-1合成分泌水平和作用于靶器官的能力，導(dǎo)致腸促胰素效應(yīng)減低，從而促進(jìn)胰島素抵抗和NAFLD 的發(fā)生發(fā)展。研究明確了腸道菌群在NAFLD 發(fā)病中的作用和部分機(jī)制，為從腸道菌群角度治療NAFLD提供了一定依據(jù)。外源性的益生菌攝入能夠修復(fù)失調(diào)的腸道微生態(tài)［17-18］，攝入一定量的雙歧桿菌和乳桿菌或許能夠改善腸促胰素效應(yīng)和胰島素抵抗，從而對(duì)NAFLD 的治療有一定的幫助作用。

本研究仍有不足之處：（1）考慮到飲食因素對(duì)NAFLD 影響較大，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 可在停止高脂飲食后明顯緩解［19］，我們并未在糞菌移植后設(shè)立普通飲食對(duì)照組，糞菌移植的實(shí)驗(yàn)結(jié)論是在繼續(xù)高脂飲食條件下得到的。（2）本實(shí)驗(yàn)和臨床期待的干預(yù)腸菌后改善NAFLD 的目標(biāo)相反，主要從促進(jìn)NAFLD 發(fā)病的腸道菌群角度開展，希望通過對(duì)發(fā)病機(jī)制的研究為NAFLD 治療提供更多思路。

今后我們將進(jìn)一步在屬水平研究關(guān)鍵菌對(duì)NAFLD 的治療作用，以找到更多的關(guān)鍵菌。

作者貢獻(xiàn)聲明王亞濤 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究，論文撰寫。程妍 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果分析。徐靜遠(yuǎn)，史海濤，王凱 實(shí)驗(yàn)資料分析。魯曉嵐 實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，論文修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。