嚴悅梅 楊蕎榕 梁 健 楊春欣 沈 雄 秦萬章 王 強△

（1復旦大學附屬中山醫(yī)院皮膚科，2藥劑科 上海 200032）

硬皮病，又稱系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc），是以皮膚和內(nèi)臟器官結(jié)締組織的纖維化或硬化、萎縮為特點的系統(tǒng)性自身免疫病，與炎癥、血管病變和免疫失調(diào)有關［1］。目前硬皮病的治療仍以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為主，毒副作用和并發(fā)癥比較嚴重［2-3］；生物制劑如Rituximab（利妥昔單抗）［4］、Tocilizumab（托珠單抗）［5］等，雖有一定的近期療效，但遠期療效和不良反應尚不明確。丹歸活血合劑（滬藥制字：Z05170927）是復旦大學附屬中山醫(yī)院院內(nèi)制劑，由丹參、黃芪、雞血藤、牡丹皮、當歸和赤芍等六味天然中藥經(jīng)過水煎法提取而得。在我院已有40 余年的臨床應用，對改善硬皮病療效確切，未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用［6-7］。然而，其不足之處在于儲存時間短、含糖、不易攜帶，因此有必要對其進行劑型改造。我們建立了博來霉素誘導的硬皮病小鼠模型，采用3 種不同工藝提取的制劑治療硬皮病小鼠，通過觀察皮膚和肺組織的炎癥和纖維化變化，優(yōu)選出 “丹歸活血制劑” 藥材的最佳提取方法。

材料和方法

實驗藥物和實驗動物制備工藝1：丹參、黃芪、雞血藤、牡丹皮、當歸和赤芍水煎酒沉法；制備工藝2：丹參、黃芪和雞血藤水煎酒沉，牡丹皮、當歸和赤芍乙醇回流法；制備工藝3：丹參、黃芪、雞血藤、牡丹皮、當歸和赤芍乙醇回流法。由我院藥學研究室完成制備，提取物加入蒸餾水制成混懸液。三七通舒膠囊水混懸液由三七通舒膠囊（國藥準字Z20030109，成都泰合健康科技集團股份有限公司）溶解于生理鹽水配置而成。注射用鹽酸博來霉素（15 mg/瓶，日本化藥株式會社）溶于0.01 mol/L PBS（pH=7.2），制成濃度為1 mg/mL 緩沖液，過濾除菌后分裝于EP 管中，4 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

SPF 級BALB/c 小 鼠，6 周 齡，雌 性，體 質(zhì) 量 約20 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。小鼠分籠飼養(yǎng)于我院動物實驗中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2016-0006。

動 物 建 模、分 組 與 給 藥參 照 文 獻［8］，64 只BALB/c 小鼠背部中央?yún)^(qū)相同部位剃除被毛（約2.0 cm×2.0 cm），各組均注射濃度為1 mg/mL 的鹽酸博來霉素緩沖液，0.1 mL/次，1 次/天，連續(xù)注射28 天。造模完成后隨機分為8 組，每組8 只；另設正常對照（F）組8 只，皮下注射0.01 mol/L PBS（pH=7.2）。根據(jù)小鼠與人折算系數(shù)表和醫(yī)用動物實驗學藥物干預的高、低劑量設計要求，高劑量設定為低劑量的3.3 倍［9］。計算出丹歸活血制劑的使用劑量：工藝1 高劑量（AH）組為0.921 g/d，低劑量（AL）組為0.279 g/d；工藝2 高劑量（BH）組為1.164 g/d，低劑量（BL）組為0.353 g/d；工藝3 高劑量（CH）組為1.105 g/d，低劑量（CL）組為0.308 g/d。模型陽性（D）組三七通舒膠囊劑量為2.48 mg/d。灌胃前，將丹歸活血制劑浸膏研磨，加水混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；將三七通舒膠囊溶于蒸餾水制成濃度為12.4 mg/mL 的混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。中藥各高劑量組給予溶液0.66 mL/d 灌胃，其余各組給予溶液0.2 mL/d 灌胃；模型陰性（E）組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥12 周，實驗結(jié)束時獲取皮膚和肺組織。本次實驗獲得復旦大學附屬中山醫(yī)院動物倫理批準（2020-126）。

觀察和檢測指標

動物一般情況觀察 干預過程中觀察各組小鼠活動度、皮膚、毛發(fā)、體質(zhì)量、死亡等情況。

組織病理學觀察 皮膚和肺部組織用4%多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，切片厚約3 μm。

皮膚厚度檢測 HE 染色后，每張切片隨機取5個部位，測量表皮與皮下組織之間的真皮垂直距離，取5 個隨機部位的測量均值進行統(tǒng)計分析。

炎癥評分 HE 染色后，選取皮膚病理切片5 個點進行炎癥等級評分（半定量分析）［10］：0 級，正常皮膚組織無炎癥；1 級，皮膚組織少量炎癥細胞浸潤；2 級，皮膚組織輕度炎癥細胞浸潤；3 級，皮膚組織中度炎癥細胞浸潤；4 級，皮膚組織重度炎癥細胞浸潤。

HE 染色后，選取肺組織病理切片5 個點進行炎癥等級評分（半定量分析）［11］：0 級，正常肺組織無炎癥；1 級，少量肺泡炎癥（+），炎癥細胞滲出致肺泡壁增寬，炎癥浸潤面積<20%；2 級，中度肺泡炎癥（++），炎癥浸潤面積占20%~50%；3 級，嚴重肺泡炎癥（+++），炎癥浸潤面積>50%。

纖維化評分 對皮膚和肺組織切片進行Masson 三色染色。采取Image J 計算膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF），每張切片隨機取3處視野（×200），以膠原纖維呈藍色為陽性，膠原面積百分比=膠原面積/組織總面積×100%。

膠原蛋白含量測定 采用羥脯氨酸試劑盒檢測（南京建成生物工程研究所）皮膚和肺組織的膠原蛋白含量。

統(tǒng)計學分析采用R Studio（版本：3.6）和GraphPad Prism 9 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以α=0.10為方差齊性的檢驗水準。組間比較滿足正態(tài)分布和方差齊性的定量資料采用t檢驗，不滿足則采用非參數(shù)檢驗Wilcoxon 秩和檢驗，多重比較采用Bonferroni法進行校正。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一般情況觀察模型組小鼠精神差，反應遲鈍，明顯消瘦，皮膚外觀硬化增厚、被毛脫失；藥物干預過程中，相比于D 組，丹歸活血制劑組小鼠整體狀態(tài)均不活躍，以CH 組、BH 組明顯，推測可能與小鼠胃腸道負擔過重有關；F 組小鼠一般狀態(tài)良好，反應靈敏，未見消瘦。E 組死亡2 只，AH 組死亡2只，BH 組 死 亡1 只，CH 組 死 亡1 只，其 余 各 組 無死亡。

皮膚的改變

皮膚病理學觀察 E 組小鼠HE 染色結(jié)果顯示，真皮層顯著增厚，膠原纖維束數(shù)量增多，形狀增粗，排列緊密，向深部擴展至部分替代皮下脂肪組織；Masson 染色結(jié)果顯示，在真皮深部可見典型的血管壁增厚、纖維化（圖1）。F 組小鼠皮膚組織無明顯病理改變。丹歸活血制劑干預硬皮病模型小鼠12 周后，皮膚出現(xiàn)明顯改善，表現(xiàn)為皮膚炎癥減輕、真皮厚度減小及膠原蛋白含量降低（圖2）。

圖1 硬皮病模型陽性（D）組、模型陰性（E）組和正常對照（F）組小鼠皮膚病理學圖片（×200）Fig 1 Pathological images of skin in the mice of positive（D），negative（E）and normal control（F）group（×200）

圖2 硬皮病模型小鼠經(jīng)丹歸活血制劑干預12 周后的皮膚病理學圖片（×200）Fig 2 Pathological images of skin in SSc mouse model after 12-week administration of Dangui Huoxue preparations（×200）

皮膚炎癥與纖維化指標觀察 E 組皮膚炎癥（1.33±0.47）較F 組（0.44±0.39）明 顯 嚴 重（P=0.006），提示造模成功。丹歸活血制劑干預12 周后，AH 組、AL 組和CL 組的皮膚組織炎癥較E 組均明顯減輕（P=0.001、0.004 和0.039）；各組的皮膚組織膠原纖維均有不同程度減輕，但與E 組相比差異均無統(tǒng)計學意義。E 組皮膚組織膠原蛋白含量［（4 453.26±1 099.18）μg/g］較F 組［（2 810.11±458.45）μg/g］明顯增加（P=0.019）；干預后AL 組、BH 組和CL 組的皮膚膠原蛋白含量較E 組均明顯減少（P=0.034、0.046 和0.030）；干預后AL 和AH 組的皮膚厚度較E 組均明顯減?。≒<0.001，P=0.006）（表1）。

表1 各組小鼠的皮膚改變Tab 1 Skin changes in the mice of different groups （±s）

表1 各組小鼠的皮膚改變Tab 1 Skin changes in the mice of different groups （±s）

AH：Process 1 high-dose group；AL：Process 1 low-dose group；BH：Process 2 high-dose group；BL：Process 2 low-dose group；CH：Process 3 high-dose group；CL：Process 3 low-dose group；D：Sanqi Tongshu capsule group；E：SSc wild-type group；F：Nnormal control group. vs. F group，aP<0.05；vs.E group，bP<0.05，cP<0.01，dP<0.001.

Group AH AL BH BL CH CL DEF Inflammation score 0.17 ± 0.24b 0.38 ± 0.33b 0.93 ± 0.90 0.63 ± 0.74 1.07 ± 0.73 0.75 ± 0.25b 0.75 ± 0.43 1.33 ± 0.47a 0.44 ± 0.39 Collagen volume fraction 0.31 ± 0.11 0.35 ± 0.17 0.46 ± 0.17 0.30 ± 0.17 0.47 ± 0.12 0.33 ± 0.13 0.27 ± 0.19 0.49 ± 0.21 0.30 ± 0.11 Collagen content of skin tissue（μg/g）3340.27 ± 583.23 3024.68± 654.15b 2948.35± 101.89b 3691.93 ± 379.43 3260.77 ± 303.70 2992.37± 560.21b 3459.45 ± 604.30 4453.26± 099.18a 2810.11 ± 458.45 Dermal thickness（μm）199.98 ± 18.02c 188.59 ± 16.46d 222.51 ± 32.17 209.11 ± 31.77 220.59 ± 41.55 227.06 ± 19.26 205.50 ± 43.77 235.68 ± 13.30 233.11 ± 35.51

肺組織的改變

肺組織病理學觀察 E 組小鼠HE 染色結(jié)果顯示，肺泡間隔增寬伴炎癥細胞淋巴細胞滲出及浸潤，肺泡結(jié)構破壞，可見肺組織血管增生、擴張；Masson 染色可見典型的血管壁增厚、肺間質(zhì)纖維化；F 組小鼠肺泡結(jié)構正常；丹歸活血制劑干預硬皮病模型小鼠12 周后，肺組織出現(xiàn)明顯改善，表現(xiàn)為炎癥減輕及膠原蛋白含量降低（圖3、圖4）。

圖3 硬皮病模型小鼠經(jīng)丹歸活血制劑干預12 周后的肺組織病理學圖片（×200）Fig 3 Pathological images of lung tissue in SSc mouse model after 12-week administration of Dangui Huoxue preparations（×200）

圖4 硬皮病模型陽性（D）組、模型陰性（E）組和正常對照（F）組小鼠肺組織病理學圖片（×200）Fig 4 Pathological images of lung tissues in the mice of positive（D），negative（E）and normal control（F）group（×200）

肺部炎癥和纖維化指標觀察 E 組小鼠肺部炎癥（1.33±0.47）較F 組（0.69±0.35）更 嚴 重（P=0.030），提示造模成功。丹歸活血制劑干預12 周后，僅AH 組肺部炎癥較E 組有所減輕（P=0.006），其余各組肺部纖維化均有不同程度減輕，但與E 組相比，差異均無統(tǒng)計學意義；E 組肺部膠原蛋白含量［（349.22±49.65）μg/g］較F 組［（229.30±65.93）μg/g］明顯增加（P=0.004）；BH 組、CH 組、CL 組肺部膠原蛋白含量較E 組均明顯減少（P=0.002、0.016和0.044）（表2）。

表2 各組小鼠肺組織炎癥與纖維化的比較Tab 2 Comparison of lung inflammation and fibrosis in the mice of different groups （±s，n=6-8）

表2 各組小鼠肺組織炎癥與纖維化的比較Tab 2 Comparison of lung inflammation and fibrosis in the mice of different groups （±s，n=6-8）

Refer to Tab 1.vs.F group，aP<0.05，bP<0.01；vs.E group，cP<0.05；dP<0.01.

Group（n=6-8）AH AL BH BL CH CL DEF Inflammation score 0.42±0.34d 0.75±0.43 1.21±0.92 0.81±0.61 1.21±0.70 1.06±0.46 1.00±0.66 1.33±0.47a 0.69±0.35 Collagen volume fraction 0.32±0.09 0.31±0.09 0.41±0.14 0.31±0.13 0.33±0.11 0.38±0.15 0.33±0.15 0.45±0.20 0.28±0.07 Collagen content of lung tissue（μg/g）253.92±114.11 301.24±82.20 212.86±61.24d 285.13±63.54 229.05±86.33c 284.23±46.23c 315.12±81.21 349.22±49.65b 229.30±65.93

討 論

硬皮病的病因和發(fā)病機制不明，臨床防治手段有限。根據(jù)歐洲硬皮病試驗和研究（EUSTAR）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，35%的硬皮病患者因為肺纖維化而死亡，約占總死亡率的20%，是硬皮病最為常見的并發(fā)癥和首要的死亡原因［12］。因此，對于硬皮病的早期干預顯得尤為重要；硬皮病的治療目標主要是控制癥狀，保護皮膚和肺功能，減少疾病的復發(fā)和進展，預防治療相關的并發(fā)癥，并最終減少其死亡率；因此尋求降低西藥不良反應、提高臨床療效、改善患者生存質(zhì)量的治療方法和藥物，是系統(tǒng)性硬化癥研究的重點，中醫(yī)藥占有一定地位。

硬皮病屬中醫(yī) “痹癥” 范疇，中醫(yī)學認為，本病多由寒凝血瘀，痰瘀痹阻于皮膚肌肉，皮肉失養(yǎng)所致［13］。因此，符合中醫(yī)應用 “活血化瘀” 治則的指征，我們科根據(jù)硬皮病的 “血瘀發(fā)病論” ，曾研制了丹參的各類復方制劑治療各型硬皮病，對335 例各型硬皮病患者采用 “益氣活血、理氣活血、活血化瘀” 等治則進行分組治療，效果滿意，療效均在94.2%以上［7］。

丹歸活血制劑由丹參、黃芪、雞血藤、牡丹皮、當歸及赤芍六味中藥組方。君藥丹參，入心肝兩經(jīng)，具有活血化瘀、鎮(zhèn)靜安神的作用。古人有 “丹參一味，功同四物” 之說，歷來被視為活血、養(yǎng)血的要藥。現(xiàn)代藥理研究表明丹參的化學成分具有廣泛的藥理活性：能顯著抑制硬皮病患者的皮膚成纖維細胞的增殖和膠原合成［14］；抑制皮膚和內(nèi)臟器官成纖維細胞增生，防止組織硬化［15］；抑制炎癥細胞浸潤和炎癥細胞因子的表達，消除創(chuàng)傷皮膚中過量的活 性 氧 簇，改 善 微 循 環(huán)［16］等。丹 參、黃 芪［17］、赤芍［18］、當歸［19］、雞血藤［20］具有雙向調(diào)節(jié)機體細胞及體液免疫功能的作用；當歸、赤芍和牡丹皮［21］具有抗炎、抗憂郁及鎮(zhèn)靜、解熱、解痙等中樞鎮(zhèn)靜作用；黃芪、當歸、雞血藤、赤芍和牡丹皮還具有抗氧化、抗腫瘤、抗肺纖維化、清除自由基等作用，為臨床治療硬皮病提供藥理依據(jù)。

丹歸活血合劑是水煎劑，制劑中含有一定的糖類物質(zhì)，儲存時間短，不易攜帶。因此有必要對其劑型進行改造、探討和研究。本研究利用鹽酸博來霉素誘導BALB/c 小鼠構建硬皮病模型，對3 種工藝提取的丹歸活血制劑對其皮膚和肺組織的炎癥與纖維化改變進行觀察。結(jié)果顯示造模組皮膚和肺組織炎癥改變較正常對照組明顯更嚴重，提示造模成功，也為進一步的藥物觀察提供了實驗基礎。給予不同工藝和劑量的丹歸活血制劑干預，并選擇三七通舒膠囊作為陽性對照藥物。三七通舒膠囊的主要成分三七具有活血化瘀、抗血小板聚集、抗炎等功效［22］，還被證實具有抗纖維化的作用。結(jié)果顯示，丹歸活血制劑組、三七通舒膠囊組的皮膚和肺組織炎癥細胞浸潤程度均較模型組減輕，膠原纖維含量減少、真皮厚度、羥脯氨酸含量均降低，丹歸活血制劑組上述指標改善情況均優(yōu)于三七通舒膠囊組。

本研究首次證實丹歸活血制劑可改善硬皮病小鼠肺和皮膚的炎癥與纖維化，且效果優(yōu)于三七通舒膠囊，對于皮膚的炎癥與纖維化的改善優(yōu)于肺組織；其中以水煎酒沉法（工藝1）的效果最佳，而低劑量組稍好些，與臨床上治療硬皮病患者的劑量相當；這可能與丹參中水溶性成分（如丹參素、原兒茶醛）起到主要的抗炎以及抗纖維化作用有關。

本研究首次嘗試以博來霉素誘導小鼠構建硬皮病模型觀察丹歸活血制劑的療效，尚存不足：首先，根據(jù)給藥組的各指標平均數(shù)，提示有改善作用，但有些組未達到統(tǒng)計學意義，應增加每組小鼠數(shù)量再進一步觀察；其次，藥物改善硬皮病模型小鼠皮膚和肺組織炎癥和纖維化的具體作用機制仍需要探索，找到其作用的靶點；再次，三七脈通膠囊組對硬皮病的改善作用并不顯著，可能因為三七脈通膠囊為腸溶型藥物，灌胃后胃酸會影響其藥效發(fā)揮，可從給藥劑量和方式等方面調(diào)整。后續(xù)研究將探索水煎酒沉法的最佳劑量以及是否具有劑量依賴性，以期為批量生產(chǎn)提供依據(jù)。

作者貢獻聲明嚴悅梅，楊蕎榕 論文構思和撰寫，數(shù)據(jù)整理，制圖，動物模型觀察。梁健，楊春欣，沈雄 中藥鑒定和制備。秦萬章 研究指導。王強 論文構思、指導、修改和審核。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。