王海波，占今舜，谷志勇,3，劉宇航，霍俊宏 ，趙生國

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；3.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

0 引言

【研究意義】反芻動物精巧的胃腸發(fā)酵系統(tǒng)（瘤胃或瘤-網(wǎng)胃）能夠維持胃腸功能，并發(fā)酵、轉化植物性飼料，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、甲烷氣體等[1-2]。研究蘆丁對湖羊瘤胃細菌菌群多樣性及組成的調控，對促進反芻動物對植物性飼料的利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】體外發(fā)酵試驗表明，沙棘黃酮可以提高微生物對氮代謝、糖代謝的能力，降低產(chǎn)甲烷菌、瘤胃球菌、原蟲的數(shù)量[3]。而且，黃酮類化合物能增強抗氧化能力，改善動物生長性能[4-6]，并能通過影響DNA 和RNA 的合成抑制微生物繁殖，降低瘤胃微生物的數(shù)量[7-8]；還可直接作用瘤胃產(chǎn)甲烷菌，抑制CH4產(chǎn)生，提高能量利用率[9]。蘆?。ㄊ|香苷、維生素P）作為一種廣泛存在于植物根、莖、葉、花、果實和種子中的黃酮類提取物，不僅可當作治療藥物，還能作為保健品，在呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、免疫保護等方面發(fā)揮功能[6]，具有改善動物生產(chǎn)性能、提高瘤胃代謝和消化能力的作用[10]。蘆丁經(jīng)胃腸道轉運或微生物降解生成槲皮素等代謝產(chǎn)物，發(fā)揮抗氧化、抗菌、抗病毒和保護腎、肝臟及胃腸道黏，促進免疫器官發(fā)育，增強機體免疫力[11-12]的功能。研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠抑制對綠膿桿菌、變形桿菌等的生長[6]，并通過瘤胃代謝影響微生物的定植[13]。【本研究切入點】本課題組成員占今舜等[14]在日糧中添加蘆丁對湖羊生長性能、血清生化指標、激素水平及瘤胃發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠改善湖羊生長性能，調控纖維素、蛋白質降解效率，影響瘤胃發(fā)酵。然而有關日糧中添加蘆丁對湖羊瘤胃細菌菌群多樣性及其組成的影響有待深入探討?！緮M解決的關鍵問題】通過高通量測序探究在日糧添加蘆丁對湖羊瘤胃細菌菌群多樣性及組成的影響，為后續(xù)研究蘆丁在湖羊中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蘆丁購自寧波玉健醫(yī)藥有限公司（浙江，寧波），提取自槐米（Sophora japonicaL.），純度≥95%。

1.2 試驗設計

選擇3 月齡左右、健康且體重相近的湖羊36 只，隨機分為3 個處理，每個處理12 只湖羊（公母各半，分欄飼養(yǎng)）。對照組（CON 組）飼喂基礎日糧，試驗組R50 和R100 分別在基礎日糧中按照湖羊體重分別添加50 和100 mg·kg-1的蘆丁，試驗期為70 d（預試期14 d，正試期56 d）。

1.3 試驗動物及管理

試驗于2019 年8～10 月在江西省贛州市綠林灣農(nóng)牧有限公司湖羊養(yǎng)殖場進行。飼養(yǎng)管理按照養(yǎng)殖場的規(guī)定執(zhí)行，每天飼喂2 次，分別在8：30 和17：30 進行飼喂，羊只自由采食，飲水，隔天早上稱取余料。

1.4 基礎日糧

參考我國《肉羊飼養(yǎng)標準》（NY/T 816—2004）配制基礎日糧。其中精料組成及營養(yǎng)水平在前期占今舜等[14]的研究中進行了詳細的描述（消化能為13.39 MJ·kg-1、粗蛋白為20.06%、中性洗滌纖維為23.24%、酸性洗滌纖維為13.78%、鈣為0.66%、磷為0.45%）。日糧中精料和粗料按照質量比6∶4 先后分開飼喂。粗料為鍘碎的紫象草（干物質中含10.98%的粗蛋白質、2.90%的粗脂肪、14.07%的粗灰分、61.23%的中性洗滌纖維為和34.67%的酸性洗滌纖維）。

1.5 樣品采集與指標測定

1.5.1 瘤胃液采集 試驗結束后，選擇各處理組中平均體重接近[對照組、R50 和R100 的平均體重分別 為（29.63±0.63）kg、（30.80±0.84）kg 和（29.93±0.89）kg]的湖羊（公羊）4 只快速屠宰取出瘤胃，并將瘤胃內(nèi)容物經(jīng)4 層紗布過濾，分裝于5 mL 凍存管放入液氮速凍后-80 ℃保存，用于細菌總DNA 提取。

1.5.2 瘤胃液微生物 DNA 的提取、測序以及分析湖羊瘤胃液中總DNA 提取送至蘇州金唯智生物科技有限公司，參照試劑盒說明進行細菌總DNA 提取，并使用Qubit?dsDNA HS Assay Kit 檢測DNA 濃度。以20～30 ng 的DNA 為模板，使用設計PCR 引物（F：CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT，R：GG ACTACNVGGGTWTCTAATCC）擴增原核生物16S rRNA 基因V3～V4 的2 個高度可變區(qū)。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按Illumina MiSeq（Illumina,San Diego,CA,USA）儀器使用說明書進行雙端測序，對測序結果原始圖像數(shù)據(jù)利用軟件Bcl2fastq（v2.17.1.14）進行圖像堿基識別，質量分析，得到原始測序數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)通過Qiime 1.9.1軟件進行拼接，使用Cutadapt 1.9.1 和Vsearch 1.9.6軟件去除低質量序列和嵌合體進行優(yōu)化得到有效數(shù)據(jù)。使用Vsearch 1.9.6 在相似性97%的水平上進行聚類成為OTUs（Operational taxonomic units），以Silva_132 16S rRNA database（http://www.arb-silva.de/）為參考，利用RDP classifier 2.2（Ribosomal Database Program）貝葉斯算法對OTU 的代表性序列進行物種分類學分析。通過軟件 Qiime 1.9.1 對檢測樣品a多樣性指數(shù)進行評估。經(jīng)Qiime 1.9.1 和R 語言作圖，基于Brary-Curtis 距離矩陣，進行PCoA 作圖分析；基于beta 多樣性距離矩陣，用R 語言進行NMDS 作圖，并采用UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）聚類方法進行樣本聚類。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013 初步整理后，采用SPSS 26.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan氏法進行多重比較，試驗結果均以平均值±標準差（M±SD）表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 OTU 分析和物種注釋

本試驗中12 個樣品平均每個樣品測得 103 929條原始PE reads，經(jīng)過質量優(yōu)化平均獲得90 653 條有效序列，其平均長度為453 bp，有效序列獲取率為87.39%。以97%的一致性對瘤胃微生物進行OTUs 聚類繪制Venn 圖（圖1）可知，共得到446 個OTU。其中，3 個處理組共享396 個OTU，占總OTU 數(shù)的88.79%。同時，CON 組和R50 組共享416 個OTU，CON組和R100組共享404個OTU，R50 組 和R100 組共享402 個OTU。且CON 和R50 組分別特有15 個、1 個OTU。其中，CON 組主要以擬桿菌門的3 個菌屬，分別為uncultured_rumen_bacterium（OTU83、OTU48、OTU213、OTU396、OTU397 和OTU417）、普雷沃菌屬_1（OTU438、OTU84、OTU422和OTU425）及理研菌科_RC9_gut_group（OTU51）為主。通過以Silva 132 為參考數(shù)據(jù)庫，利用 RDP classifier 貝葉斯算法對OTU 的代表性序列進行物種分類學注釋，所有樣品共注釋了14 個門（Phylum）、18 個綱（Class）、21 個目（Order）、34 個科（Family）和99 個屬（Genus）。通過對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU 的數(shù)目構建稀釋曲線（圖2）可知，隨著測序深度的增加，OTU 的數(shù)量先增加最后趨向平坦，持續(xù)抽樣新物種出現(xiàn)的速率降低，檢測到的OTU 數(shù)目不再增加，測序數(shù)據(jù)量較為合理。

圖1 OTUs 分布維恩圖Fig. 1 Venn diagrams of OTU distribution

圖2 OTUs 的稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of OTUs

2.2 Alpha 多樣性分析

日糧中添加蘆丁對瘤胃液微生物Alpha 多樣性的影響見表1。由表可知1，日糧中添加蘆丁顯著影響瘤胃液微生物Alpha 多樣性。相比較CON 組和R50 組，R100 組ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。R100 組Chao1 指數(shù)與CON 組相比顯著降低（P＜0.05），與R50 組無顯著差異。同時，CON組和R50 組Alpha 多樣性均無顯著差異（P＞0.05）。

表1 瘤胃液細菌群Alpha 多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis on microbial community in rumen fluid

2.3 Beta 多樣性分析

基于Brary-Curtis 距離矩陣的PCoA 作圖分析（圖3）可知，PC1 和PC2 對樣本差異的貢獻率分別為21.48%和20.00%，且樣本點的距離越近，相似度越高。NMDS 分析可知，不同樣本間的差異程度通過點間的距離體現(xiàn)，由圖4 可知，Stress＜0.097，表明NMDS 可以準確反映樣本間的差異程度。由PCoA分析（圖3）、NMDS 分析（圖4）和UPGMA 聚類方法（圖5）可知，R100 組與CON 和R50 組在微生物群落結構上存在差異，而CON 和R50 組群落組成相似。Anosim 分析結果見圖6。圖6 中a（R=0.156，P=0.223）、b（R=0.417，P=0.064）和c（R=0.469，P=0.035）中的R值逐漸增大，表明日糧中添加蘆丁能夠影響微生物結構分布，且R50 與R100 兩組之間存在顯著差異（P＜0.05），CON 組和R50 組之間、CON和R100 組之間無顯著差異。

圖3 主坐標分析Fig. 3 Principal coordinate analysis

圖4 非度量多維標定法Fig. 4 Non-metric multi-dimensional scaling

圖5 湖羊瘤胃微生物UPGMA 聚類方法Fig. 5 UPGMA on microbes in rumen of Hu sheep

圖6 湖羊瘤胃微生物群落結構Anosim 分析Fig. 6 Anosim analysis on microbial community structure in rumen of Hu sheep

2.4 湖羊瘤胃液中微生物群落組成

日糧中添加蘆丁對湖羊瘤胃液中微生物在門和屬水平的分布見表2～3。在門水平，由表2 可知：擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）兩大優(yōu)勢菌門的相對豐度超過88.31%，在CON 組分別占52.84%和35.47%，在R50 組分別占59.18%和31.56%，在R100 組分別占62.76%和29.67%。日糧中添加蘆丁在門水平顯著影響迷蹤菌門（Elusimicrobia）和髕骨細菌門（Patescibacteria）的相對豐度（P＜0.05）。相比CON 組，R100 組顯著提高Patescibacteria的相對豐度，降低Elusimicrobia 的相對豐度（P＜0.05），同時R50 組Elusimicrobia 的相對豐度顯著高于CON 組和R100 組（P＜0.05），其他各處理組之間在門水平均無顯著差異（P＞0.05）。在屬水平上，由表3 可知，CON 組、R50 組和R100 組優(yōu)勢菌屬均為普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）和理研菌科_RC9_gut_group（Rikenellaceae_RC9_gut_group），在CON 組分別占20.28%和12.16%，在R50 組分別占26.34%和11.05%，在R100 組分別占26.79%和18.60%。在已鑒定豐度排名前30 的菌屬中，日糧中添加蘆丁能顯著影響新月形單胞菌屬_1（Selenomonas_1）、琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、f__Bacteroidales_RF16_group_Unclassified和f__Lachnospiraceae_Unclassified的相對豐度。其中，與CON組相比，R100 組中Selenomonas_1、f__Bacteroidales_RF16 _group_Unclassified、Succiniclasticum的相對豐度顯著降低（P＜0.05），但與R50 組差異不顯著（P＞0.05）。同時，R100 組中f__Lachnospiraceae_Unclassified極顯著低于R50 組（P＜0.01）。其他各處理組之間在屬水平均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 蘆丁對湖羊瘤胃微生物相對豐度的影響（門水平）Table 2 Effect of rutin on microbial relative abundance in rumen of Hu sheep (at phylum level)（單位：%）

表3 蘆丁對湖羊瘤胃微生物相對豐度的影響（屬水平）Table 3 Effect of rutin on microbial relative abundance in rumen of Hu sheep (at genus level) （單位：%）

3 討論

瘤胃微生物主要由真菌、細菌和原蟲組成，通過高通量測序技術可以快速高效地了解群落的種類和結構[15]，可通過α 和β 多樣性對微生物群落的多樣性進行評估[16]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，對照組的OTU 數(shù)目大于添加蘆丁的試驗組，添加蘆丁導致微生物多樣性降低。這可能是因為蘆丁作為黃酮類化合物，可引起DNA 和RNA 的合成，抑制微生物繁殖，降低瘤胃微生物的數(shù)量，并能改善瘤胃消化代謝及碳水化合物的發(fā)酵影響微生物群落的多樣性[7,8,13,15,17]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加50 mg·kg-1的蘆丁對瘤胃菌群的豐度及多樣性均無顯著性影響，但添加100 mg·kg-1的蘆丁顯著降低α 多樣性的ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)。通過PCoA、NMDS 和UPGMA 聚類方法對β 多樣性分析可知，添加100 mg·kg-1的蘆丁對瘤胃微生物群落有顯著的影響。日糧中添加50、100 mg·kg-1蘆丁不能改變瘤胃優(yōu)勢菌群，這與前期研究發(fā)現(xiàn)瘤胃優(yōu)勢菌群相一致[18-19]。其中，對照組、50 mg·kg-1蘆丁組和100 mg·kg-1蘆丁組中Bacteroidetes 和Firmicutes 占比與牦牛[20]、水牛[21]、蒙古羊[22]、湖羊[23]等反芻動物瘤胃優(yōu)勢菌為Bacteroidetes 和Firmicutes 的結果相似。擬桿菌門是一類革蘭氏陰性菌，在核酸、脂質、蛋白質等有機物的轉換和非纖維類碳水化合物的降解中發(fā)揮重要功能[15,24-25]。厚壁菌門中含有大量纖維素分解菌屬，主要促進纖維的分解[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加50、100 mg·kg-1蘆丁能使瘤胃中的Firmicutes與Bacteroidetes 的比值較對照組分別降低20.56%和37.23%。變形菌門在腸道富集，容易引起炎癥或外源性病原體的入侵，造成微生物群落失衡[18,26]。同時，蘆丁對綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等的生長具有抑制作用[6]。日糧中添加50 和100 mg·kg-1蘆丁能使變形菌門的相對豐度較對照組分別降低71.55%，81.38%，有利于維持菌群的平衡，增強機體抵抗外源性病原體的入侵[18]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)添加100 mg·kg-1的蘆丁顯著提高Patescibacteria 豐度，降低Elusimicrobia 的相對豐度。但Elusimicrobia在胃腸中占比較低，其功能作用研究也鮮有報道，需進一步探討。

日糧中添加50 和100 mg·kg-1蘆丁不會影響育肥湖羊瘤胃優(yōu)勢菌屬Prevotella_1和Rikenellaceae_RC9_gut_group分布，這一結果與孫美杰等[23]研究結果中育肥湖羊瘤胃優(yōu)勢菌屬的結果一致。Prevotella和Rikenellaceae_RC9_gut_group能夠促進養(yǎng)分利用[20,27-28]。Prevotella_1 是Prevotella中主要的類群[29]，參與木聚糖發(fā)酵、半纖維素和果膠的降解以及蛋白質和多肽的代謝及丙酸的生成[2,30]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，各處理組中Prevotella-1 占比最高，這與之前報道的瘤胃液中優(yōu)勢菌為普氏菌屬[20,31]的結果相一致，但添加50 和100 mg·kg-1BW 的蘆丁組Prevotella-1分別較對照組分別提高了29.39%和32.10%，這有利于促進瘤胃發(fā)酵[2]。體外試驗表明，蘆丁能夠提高飼料的降解率，降低CH4產(chǎn)量[32]。進一步通過體內(nèi)試驗證明蘆丁能提高瘤胃碳水化合物發(fā)酵效率和瘤胃細菌合成蛋白質的能力，增加乙酸、丙酸和MCP 濃度[10]。以上結果表明，日糧中添加蘆丁有利于提高瘤胃優(yōu)勢菌屬Prevotella_1 的相對豐度，促進瘤胃氮代謝及對相關代謝產(chǎn)物的吸收利用[2]。

4 結論

在本研究條件下，添加日糧中添加蘆丁能提高瘤胃液中擬桿菌門的相對豐度，降低瘤胃中厚壁菌門和變形菌門的相對豐度。添加100 mg·kg-1的蘆丁能影響瘤胃微生物的α 多樣性和β 多樣性，并顯著降低月形單胞菌屬和琥珀酸屬的相對豐度。