麻俊淵，王進(jìn)娥，李 洋，胡凇茗，陳 舟，李書元，楊妍梅，扎西英派，霍生東

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

0 引言

【研究意義】牦牛是高原地區(qū)主要畜種，其繁殖性能較低，通常為兩年一胎或三年兩胎[1,2]。極少數(shù)牦牛在分娩后一定時(shí)間內(nèi)機(jī)體恢復(fù)順利進(jìn)入下一個(gè)發(fā)情周期，而大多數(shù)會進(jìn)入產(chǎn)后乏情期，呈不發(fā)情表現(xiàn)。造成哺乳動物產(chǎn)后乏情的外部原因有飼喂?fàn)顩r、溫度氣候、品種年齡和疾病等[3]。但造成牦牛產(chǎn)后乏情的關(guān)鍵生物因子及影響機(jī)制并不明確。本研究利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，更好地分析理解牦牛妊娠分娩后易乏情的生理變化規(guī)律，對于深入研究妊娠期和產(chǎn)后乏情期卵巢的生理特性和揭示產(chǎn)后乏情機(jī)理具有一定參考價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是探究生物體蛋白質(zhì)組的組成及變化規(guī)律的科學(xué)[4]，該技術(shù)最初為闡明蛋白質(zhì)的種類，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于精準(zhǔn)確定特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的研究[5]。蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者和執(zhí)行者，對蛋白質(zhì)整體進(jìn)行動態(tài)分析，能更深入揭示生命活動的真諦[6]。海超[7]對冷凍前后精子進(jìn)行同步蛋白質(zhì)組學(xué)分析探討精子冷凍損傷的分子機(jī)制；趙國順[8]建立了牦牛不同直徑卵泡液蛋白表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)了不同時(shí)期卵泡液對卵母細(xì)胞發(fā)育影響的關(guān)鍵蛋白及作用機(jī)制。阮崇美[9]通過構(gòu)建不同發(fā)育期白牦牛睪丸蛋白質(zhì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)白牦牛性機(jī)能旺盛期睪丸支持細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制。Pei 等[10]通過分析不同直徑牦牛卵泡差異表達(dá)蛋白，尋找到了卵泡成熟的標(biāo)志蛋白。趙興緒[11]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出天祝白牦牛發(fā)情期與妊娠期卵巢差異表達(dá)蛋白?；羯鷸|等[12]通過轉(zhuǎn)錄組與定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析相結(jié)合，篩選出卵巢周期停滯相關(guān)基因和蛋白質(zhì)。【本研究切入點(diǎn)】牦牛在妊娠期和產(chǎn)后乏情期，卵巢上卵泡發(fā)育均處于靜止?fàn)顟B(tài)[13]，但不同時(shí)期機(jī)體生殖生理活動卻完全不同；且蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在牦牛妊娠與分娩后卵巢周期停滯方面的應(yīng)用尚未見有關(guān)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析牦牛妊娠期和產(chǎn)后乏情期卵巢差異表達(dá)蛋白，整理發(fā)掘牦牛妊娠分娩后因卵巢停滯而導(dǎo)致乏情的關(guān)鍵生物因子，為開展牦牛乏情期與妊娠期相關(guān)蛋白研究與分子調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

在青海省海晏縣牧民自然放牧牦牛群挑選6 歲左右、臨床觀察確定處于妊娠期和產(chǎn)后乏情期的母牦牛。

1.2 樣品采集與處理

臨床檢查無可見疾病，挑選處于妊娠期和產(chǎn)后乏情期牦牛各3 頭，屠宰后立即采集卵巢，修剪附屬組織，預(yù)溫生理鹽水洗凈卵巢表面的血跡污物，迅速放入液氮內(nèi)保存運(yùn)輸。凍存樣品送北京百邁客生物科技有限公司（Biomarker technologies）進(jìn)行TMT（Tandem mass tags）定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析檢測。

1.3 基于TMT 定量蛋白組學(xué)分析

1.3.1 卵巢蛋白質(zhì)提取及含量測定 參照已有研究方法提取卵巢蛋白質(zhì)[14]。適量的蛋白質(zhì)裂解液（8 mol·L-1尿素、1%SDS），冰上超聲2 min 后裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，取蛋白質(zhì)上清。使用Thermo Scientific Pierce BCA 試劑盒（Thermo，USA）進(jìn)行蛋白定量。

1.3.2 酶解烷基化以及TMT 標(biāo)記 取蛋白樣品100 μg，用裂解液補(bǔ)充體積到100 μL。加入終濃度10 mmol·L-1TCEP 還原劑，在37 ℃下反應(yīng)60 min。加入終濃度40 mmol·L-1碘乙酰胺，室溫下避光反應(yīng)40 min。每管加入預(yù)冷丙酮[V（丙酮）∶V（樣品）=6∶1]，-20 ℃沉淀4 h，10 000 r·min-1離心20 min，棄上清。用50 mmol·L-1TEAB充分溶解樣品，按照質(zhì)量比1∶50（酶∶蛋白）加入Trypsin 在37 ℃ 酶解過夜。TMT 試劑（Thermo，USA）加入乙腈解凍重組，并加入多肽溶液進(jìn)行標(biāo)記，室溫孵育2 h；加入羥胺，室溫反應(yīng)15 min，將等量標(biāo)記產(chǎn)物混合于管中，真空濃縮儀抽干[14-15]。

1.3.3 LC-MS/MS 檢測 采用納升級液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（Easy-nLC 1200 結(jié)合Q Exactive 質(zhì)譜儀）進(jìn)行分析[15]。肽段用質(zhì)譜上樣緩沖液溶解，蛋白上樣后經(jīng)C18 色譜柱（75 μm×25 cm，Thermo，USA）分離120 min，體積流量為300 μL·min-1。EASY-nLC 液相梯度洗脫，流動A 相2%乙腈（加0.1%甲酸），B 相80%乙腈（加0.1%甲酸）。按照以下程序進(jìn)行梯度洗脫：0～1 min、0～5% B 相，1～63 min、5%～23% B 相，63～88 min、23%～48% B 相，88～89 min、48%～100% B 相，89～95 min、100% B 相。MS 和MS/MS 采集之間自動切換，質(zhì)譜分辨率分別是70 K和35 K。MS 掃描范圍為（m/z）350～1 300，選擇top20的母離子進(jìn)行二級碎裂，動態(tài)排除時(shí)間為18 s。用軟件Thermo Xcalibur 4.0（Thermo，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.3.4 蛋白質(zhì)比對及差異表達(dá)蛋白篩選 利用數(shù)據(jù)庫檢索得到原始數(shù)據(jù)后，按照Score Sequest HT＞0且unique peptide≥1，并去除空白值的標(biāo)準(zhǔn)篩選可信蛋白。計(jì)算組間蛋白質(zhì)表達(dá)差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C），以1.5 倍差異表達(dá)，即|Log2FC|＞1.5 且P＜0.05作為差異表達(dá)蛋白（Differentially expressed proteins，DEPs）的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 生物信息學(xué)分析 將鑒定到的蛋白質(zhì)序列與GO、COG、KEGG 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得蛋白在各數(shù)據(jù)庫的注釋信息。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 25 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。生物量結(jié)果采用SPSS 25 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），應(yīng)用多重比較Tukey 檢測對數(shù)據(jù)之間的差異性進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05、|Log2FC|＞1.5 時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）評價(jià)同時(shí)期卵巢蛋白質(zhì)相似性。利用Origin 構(gòu)建了不同時(shí)期卵巢組差異表達(dá)蛋白熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果

試驗(yàn)共鑒定到4 457 個(gè)蛋白質(zhì)，都具有定量表達(dá)信息。兩組樣本間有57 個(gè)差異表達(dá)蛋白，且與妊娠期組相比，產(chǎn)后乏情卵巢組織中表達(dá)上調(diào)蛋白38 個(gè)，表達(dá)下調(diào)蛋白19 個(gè)，差異表達(dá)蛋白信息見表1。

表1 差異表達(dá)蛋白信息統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical information on DEPs

續(xù)上表

2.2 總蛋白主成分分析

利用妊娠期組的3 個(gè)樣本和產(chǎn)后乏情期組的3 個(gè)樣本中定量蛋白強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，如圖1所示。結(jié)果表明，2 組樣本分布在二維空間不同的區(qū)域，區(qū)分明顯，顯示妊娠期組和產(chǎn)后乏情期卵巢蛋白之間的分離趨勢。

圖1 總蛋白主成分分析Fig. 1 Principal component analysis on all proteins

2.3 差異表達(dá)蛋白熱圖分析

為了進(jìn)一步顯示妊娠期組和產(chǎn)后乏情期組之間的差異，將57 個(gè)差異表達(dá)蛋白利用層次聚類分析繪制了熱圖，如圖2 所示。圖中紅色表示蛋白表達(dá)量高，綠色表示蛋白表達(dá)量低。系統(tǒng)聚類分析表明，2 組樣本差異蛋白區(qū)分明顯，表達(dá)模式存在差異，組內(nèi)重復(fù)性良好，且聚類模式與主成分分析結(jié)果一致。

圖2 差異表達(dá)蛋白熱圖Fig. 2 Heat map of DEPs

2.4 差異表達(dá)蛋白COG 分析

差異表達(dá)蛋白COG（Clusters of orthologous groups）分析結(jié)果（圖3）顯示，下調(diào)差異表達(dá)蛋白功能集中于核苷酸運(yùn)輸與代謝。上調(diào)差異表達(dá)蛋白功能集中于細(xì)胞周期、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、輔酶的運(yùn)輸和代謝、翻譯與核糖體結(jié)構(gòu)、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝和防衛(wèi)機(jī)制等方面。差異表達(dá)蛋白在能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)運(yùn)輸與代謝、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、次生代謝物合成轉(zhuǎn)運(yùn)代謝等功能中均存在上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)蛋白，且以上調(diào)表達(dá)為主。

圖3 差異表達(dá)蛋白COG 分析Fig. 3 COG analysis on DEPs

2.5 差異表達(dá)蛋白GO 分析

差異表達(dá)蛋白GO（Gene ontology）分析結(jié)果（圖4）顯示，各有221 個(gè)蛋白注釋到生物學(xué)過程，主要集中在代謝、繁殖、生殖等生物過程；242 個(gè)蛋白注釋到亞細(xì)胞組分，主要涉及細(xì)胞器成分、高分子復(fù)合物、膜部件等細(xì)胞組分；77 個(gè)蛋白注釋到分子功能，主要參與轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能。

圖4 差異表達(dá)蛋白GO 分析Fig. 4 GO analysis on DEPs

2.6 差異表達(dá)蛋白KEGG 分析

差異表達(dá)蛋白KEGG（Kyoto encyclo-pedia of genes and genomes）分析結(jié)果（圖5）顯示，妊娠組與產(chǎn)后乏情組卵巢組織57 個(gè)差異表達(dá)蛋白共參與到27 條KEGG 信號通路。其中與繁殖激素分泌調(diào)控有關(guān)的信號通路有卵巢類固醇生成和甾類激素生物合成；與能量代謝有關(guān)的信號通路有氨基酸的生物合成、碳代謝和谷胱甘肽的合成；與卵泡發(fā)育有關(guān)的信號通路有PI3K-Akt 信號通路。差異表達(dá)蛋白KEGG 分析結(jié)果提示牦牛產(chǎn)后乏情與生殖激素異常分泌調(diào)控、能量代謝失衡狀態(tài)和卵泡不正常閉鎖有著密切的關(guān)系。

圖5 差異表達(dá)蛋白KEGG 分析Fig. 5 KEGG analysis on DEPs

3 討論

3.1 牦牛生殖激素分泌的調(diào)節(jié)

產(chǎn)后乏情期膽固醇側(cè)鏈裂解酶（Cytochrome P450 side chain cleavage enzyme，P450scc）、腎上腺素（Adrenaline）、線粒體（Mitochondrion）較妊娠期表達(dá)上調(diào)，通過KEGG 差異蛋白代謝通路分析發(fā)現(xiàn)P450scc 通過參與卵巢類固醇生成、甾類激素生物合成和細(xì)胞色素P450 生物代謝過程。膽固醇是體內(nèi)合成的所有類固醇激素的初始底物[16]，牦牛性類固醇激素合成的第一步是腎上腺線粒體P450scc 催化膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮[17,18]，生成的孕烯醇酮可作為底物，通過下游酶形成孕激素、雄激素和雌激素[19]。牦牛乏情期P450scc、Adrenaline 和mitochondrion 表達(dá)上調(diào)，加強(qiáng)了孕烯醇酮合成分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，母牛產(chǎn)后乏情期雌二醇（Estradiol，E2）含量較妊娠期變化不大且處于較低水平，但孕酮（Progesterone，P4）含量升高[20]，因此推斷孕烯醇酮作為激素原主要用于P4的合成。P4是調(diào)節(jié)卵巢機(jī)能的重要激素[21]，其調(diào)節(jié)作用具有濃度依賴性，低濃度能夠促進(jìn)卵泡發(fā)育，高濃度時(shí)反而對卵泡的發(fā)育有抑制作用[22]。促黃體素（Luteinizing hormone，LH）脈沖頻率增加能夠加強(qiáng)E2的分泌進(jìn)而誘導(dǎo)LH 峰出現(xiàn)和排卵發(fā)生[23]，但P4則能抑制LH 的脈沖頻率[24]。因此，產(chǎn)后乏情期，高濃度P4足以將LH 脈沖頻率降低到一定程度，從而抑制卵泡波的出現(xiàn)，使得牦牛卵泡處于靜止時(shí)期，卵泡波不能正常發(fā)育和排卵，進(jìn)而誘發(fā)乏情的產(chǎn)生。

同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)緩激肽（Bradykinin，BK）和緩激肽B2（Bradykinin B2 receptor，BKB2）受體在發(fā)情期前高表達(dá)，在發(fā)情期間急劇下降，并且推測變化與LH 的釋放有關(guān)，證明BK 和BKB2 的水平與發(fā)情周期正相關(guān)[25]。本試驗(yàn)中，產(chǎn)后乏情期BK 較妊娠期表達(dá)下調(diào)，表明BK 在牦牛產(chǎn)后乏情病理過程中也發(fā)揮了一定的作用。

3.2 牦牛生殖周期的能量平衡

產(chǎn)后乏情期谷胱甘肽過氧化物酶1（Glutathione peroxidase 1，GSH-P1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A2（Glutathione S-transferase A2，GSTA2）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate amino transferase，AST）較妊娠期表達(dá)上調(diào)，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione transferase，GST）較妊娠期表達(dá)下調(diào)。通過KEGG 差異蛋白代謝通路分析發(fā)現(xiàn)GSH-P1、GSTA2、GST 參與GSH代謝。草食動物小腸內(nèi)食源性外源氨基酸的生物吸收是依靠GSH 合成與分解時(shí)利用γ-谷氨酰基循環(huán)實(shí)現(xiàn)的，其吸收方式為主動轉(zhuǎn)運(yùn)[26,27]。GST 可催化GSH 形成含GSH 的結(jié)合物，結(jié)合物經(jīng)消化道排出體外，產(chǎn)后乏情期GST 表達(dá)下調(diào)可通過減少GSH 的排出以加強(qiáng)γ-谷氨?；h(huán)，提高牦牛對飼草中外源氨基酸的吸收能力，繼而減緩代謝的負(fù)平衡狀態(tài)。AST 參與氨基酸的分解供能的開始階段，其在產(chǎn)后乏情期表達(dá)上調(diào)，表明牦牛在產(chǎn)后糖代謝供能不足的情況下，更多的氨基酸通過轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)而參與三羧酸循環(huán)來彌補(bǔ)機(jī)體糖儲量不足造成的能量負(fù)平衡。能量負(fù)平衡狀態(tài)下機(jī)體優(yōu)先從繁殖中轉(zhuǎn)移營養(yǎng)能量[28]，并開始通過脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝提供所需能量，這一狀態(tài)容易誘發(fā)以卵巢靜止為主的乏情過程[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，牦牛在能量負(fù)平衡的狀態(tài)下其生殖激素分泌模式會發(fā)生一定改變[30]，機(jī)體以降低自身代謝和增大存活幾率為目的，生殖激素分泌減少，最終也會導(dǎo)致牦牛較長時(shí)間不發(fā)情。

3.3 牦牛卵巢原始卵泡激活

產(chǎn)后乏情期磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）較妊娠期表達(dá)下調(diào)，并且通過KEGG 差異蛋白代謝通路分析發(fā)現(xiàn)PI3K 參與PI3K/AKT（Protein kinase B）信號通路。PI3K/AKT 細(xì)胞凋亡信號通路是體內(nèi)的基礎(chǔ)信號通路[31]，對卵巢休眠[32]、初始卵泡激活[33]有重要意義，卵泡激活便是基于PI3K-AKT 信號通路實(shí)現(xiàn)的[34]。原始卵泡是雌性哺乳動物繁殖的基本功能單位[35]。進(jìn)入卵泡池中的原始卵泡則有助于內(nèi)分泌和排卵，并促進(jìn)雌性生育[36]。因此，原始卵泡的休眠、死亡和激活之間的平衡對于維持適當(dāng)?shù)纳硥勖黐37]和調(diào)控生殖進(jìn)程極其重要[38]。PI3K-AKT 信號通路中，AKT 的激活導(dǎo)致通路下游分子磷酸化，使得卵泡激活[39]。本研究中，乏情期差異蛋白PI3K 表達(dá)下降，造成PI3K/AKT 信號通路負(fù)調(diào)控，其對于牦牛產(chǎn)后原始卵泡閉鎖、退化以致乏情的產(chǎn)生具有一定的因果關(guān)系。

在本研究中還發(fā)現(xiàn)乏情期較妊娠期之間的其他差異表達(dá)蛋白還廣泛存在于不同功能通路中，如次生代謝物的生物合成運(yùn)輸與分解、一般功能預(yù)測、碳代謝、復(fù)制重組和修復(fù)以及細(xì)胞吞噬等過程中，表明牦牛的產(chǎn)后乏情在分子層面上也可能與之相關(guān)，但具體如何影響，需要后期更深入的研究。

4 結(jié)論

本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選分析牦牛妊娠期和產(chǎn)后乏情期卵巢組織間的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)牦牛產(chǎn)后乏情的出現(xiàn)與差異表達(dá)蛋白BK、P450scc 參與卵巢類固醇激素生成；GSH-P1、GSTA2、GST 和AST參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與蛋白質(zhì)代謝；PI3K 參與PI3K-Akt細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究有助于更好地分析理解牦牛妊娠分娩后易乏情的生理變化規(guī)律，對于深入研究牦牛妊娠期和產(chǎn)后乏情期卵巢的生理特性和揭示產(chǎn)后乏情期關(guān)鍵生物因子具有一定參考價(jià)值。