張家莉，令狐遠(yuǎn)鳳，段世宇，潘 永，楊 琦,4

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550025；4.貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025）

0 引言

【研究意義】鼠傷寒沙門菌是一種常見的人畜共患病原菌，對我國的畜禽產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控是調(diào)節(jié)細(xì)菌基因表達(dá)的重要方式，sRNA 通過分子內(nèi)堿基配對與靶mRNA 相互作用，通常通過隔離靶mRNA 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）來調(diào)節(jié)翻譯起始[1]。揭示sRNA 與靶基因的調(diào)控理論，找到沙門氏菌防控新方式，對保障人與畜牧業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】sRNA SdsR 以兩種形式存在，一種是全長 100 nt sRNA，另一種是經(jīng)過加工的 70 nt 分子[2]。作為一種基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，SdsR 影響細(xì)菌對壓力條件的適應(yīng)、毒力及生物膜形成[3]。SdsR 是固定相 sigma 因子 (σS) 調(diào)節(jié)子的成員，通過有限且不完美的堿基互補(bǔ)配對與靶mRNA 結(jié)合[4]，結(jié)合區(qū)域常為相鄰的6～8 個堿基[5]。Fr?hlich 等[6]確定并驗證了ompDmRNA為SdsR 的直接目標(biāo)。之后通過SdsR 脈沖表達(dá)與全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了 20 個以前未知的 SdsR候選靶標(biāo)，其中有18 個靶標(biāo)受SdsR 的依賴性調(diào)節(jié)[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】sdsR基因幾乎存在于所有腸桿菌基因組中，說明sRNA 一定存在額外的、保守的靶基因。TargetRNA2 是建立在TargetRNA[8]、IntaRNA[9]、RNApredator[10]之上的用于識別細(xì)菌中被sRNA 調(diào)控的mRNA 靶標(biāo)，其特點(diǎn)是既準(zhǔn)確又有效[11]。然而有關(guān)鼠傷寒沙門菌sRNA SdsR 靶基因的預(yù)測及驗證的研究還有待深入進(jìn)行?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用TargetRNA2 軟件預(yù)測sRNA SdsR 的潛在靶標(biāo)，結(jié)合前期對sRNA SdsR 敲除后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將預(yù)測到的部分基因注釋到GO、KEGG 以及eggNOG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析，并利用RT-qPCR 對部分預(yù)測靶基因進(jìn)行驗證，篩選出可能受sRNA SdsR 直接調(diào)控的靶基因，為進(jìn)一步明確鼠傷寒沙門菌sRNA SdsR的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 野生型鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株3409由法國國家科學(xué)研究中心（CNRS）分子遺傳學(xué)Bossi實(shí)驗室惠贈；SdsR 敲除株（基因型為△sdsR::cat）由本實(shí)驗室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑及儀器 試劑：RNA 提取試劑盒購自貴州卓一生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒[Recombinant NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）]及熒光染料AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 均購自宏達(dá)爾生物科技有限公司，試劑均為分析純。

儀器：熒光定量PCR 儀（CFX Connect optics Module），美國Bio-RAD 公司；微量核酸測定儀（Nano Photometer NP80），德國Implen 公司。

1.2 TargetRNA2 預(yù)測SdsR 靶標(biāo)

進(jìn)入TargetRNA2 靶基因預(yù)測網(wǎng)站（http://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2/），輸入sRNA SdsR序列，分析對象為沙門氏菌腸道亞種，鼠傷寒沙腸桿菌血清型LT2 染色體。勾選sRNA conservation and accessibilty。目標(biāo)參數(shù)為從上游80 NTs 到mRNA 翻譯起始位點(diǎn)下游的20 NTs，sRNA 窗口大小為13，雜交種子數(shù)為7，P值閾值為0.05，過濾器尺寸為400。點(diǎn)擊search，將預(yù)測到的結(jié)果導(dǎo)出并選擇雜交能量最高的5 個基因進(jìn)行后續(xù)的試驗。

1.3 預(yù)測基因的生物學(xué)信息分析

本實(shí)驗室前期已經(jīng)將鼠傷寒沙門菌sRNA SdsR基因敲除后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果已注釋到GO、KEGG 以及eggNOG 數(shù)據(jù)庫中。將預(yù)測到的靶標(biāo)定位在測序結(jié)果中，分析其涉及的信號通路、所行使的生物學(xué)功能、蛋白質(zhì)功能及其分類。

1.4 預(yù)測基因的RT-qPCR 驗證

選擇雜交能量較高的5 個預(yù)測到的靶基因hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC，對其進(jìn)行RT-qPCR驗證。根據(jù)GenBank 提供的基因序列設(shè)計相應(yīng)的RT-qPCR 引物（表1），送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。以SdsR 敲除株為試驗組、3409 標(biāo)準(zhǔn)株為對照組，提取總RNA 樣本，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行RT-qPCR 試驗，反應(yīng)體系為：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.8 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃ 0.5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 0.5 min，39 個循環(huán)，每個樣本重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行處理。將得到的結(jié)果結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 sRNA SdsR 靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果

Target RNA2 軟件預(yù)測到29 個靶標(biāo)（表2），其中hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC的雜交能量較高。hemA編碼谷氨酰-tRNA 還原酶（GlutamyltRNA reductase），STM0951編碼細(xì)胞質(zhì)蛋白（Cytoplasmic protein），mreC編碼桿狀決定蛋白MreC（Rod shape-determining protein MreC），STM1252 編碼細(xì)胞質(zhì)蛋白（Cytoplasmic protein），dcoC編碼草酰乙酸脫羧酶亞基γ（Oxaloacetate decarboxylase subunit gamma）。

表2 TargetRNA2 軟件預(yù)測結(jié)果Table 2 Prediction by TargetRNA2

雜交能量較高的5 個基因的靶位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果（表3）顯示：STM0951 與dcoC在5′UTR 區(qū)域與sRNA SdsR 形成了4 個連續(xù)的堿基互補(bǔ)配對，而hemA、mreC、STM1252 則是在CDS 區(qū)域與sRNA SdsR 發(fā)生大于7 個堿基的連續(xù)或不連續(xù)的互補(bǔ)配對。該結(jié)果說明所選擇的5 個基因均能與sRNA SdsR 形成連續(xù)的堿基互補(bǔ)配對，且可能存在其他有待發(fā)現(xiàn)的作用機(jī)制。

表3 靶位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果Table 3 Predicted target sites

2.2 預(yù)測靶基因GO、KEGG 和eggNOG 數(shù)據(jù)庫注釋

將篩選到的5 個潛在靶基因注釋到GO、KEGG和eggNOG 數(shù)據(jù)庫中（表4）。GO 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，在生物過程方面，hemA主要參與原卟啉原IX 生物合成過程、氧化還原過程，STM0951 只參與氧化還原過程，mreC影響細(xì)胞形狀的調(diào)節(jié)，dcoC參與脂質(zhì)代謝過程；在細(xì)胞成分方面，merC和dcoC同時與膜的組成部分質(zhì)膜相關(guān)；在分子功能方面，hemA和STM0951 同時涉及槲皮素 2,3-雙加氧酶活性，而dcoC涉及鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、草酰乙酸脫羧酶活性、水解酶活性。STM1252 的生物學(xué)功能未被富集到。KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示hemA與dcoC分別富集到卟啉和葉綠素代謝途徑與丙酮酸代謝途徑。eggNOG 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，篩選出的5 個基因均可注釋到eggNOG 數(shù)據(jù)庫中的直系同源蛋白功能分類。其中hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC分別注釋到輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、僅一般功能預(yù)測、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、碳水化合物運(yùn)輸和代謝以及能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化幾個分類中。表明上述基因可能參與細(xì)菌的新陳代謝以及基本的生命活動。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，sRNA SdsR 敲除后hemA、mreC分別下 調(diào)0.23 和0.39 倍；STM0951、STM1 252、dcoC分別上調(diào)0.51、0.35 和1.86 倍。由此可見，dcoC基因表達(dá)差異倍數(shù)最大，但表達(dá)倍數(shù)小于2 且未達(dá)到差異閾值，其差異性需要進(jìn)一步驗證。

表4 預(yù)測靶基因GO、KEGG 和eggNOG 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果Table 4 Annotation of predicted target genes by GO,KEGG,and eggNOG databases

2.3 預(yù)測靶基因的RT-qPCR 驗證

對預(yù)測到的雜交能量較高的5 個潛在靶基因進(jìn)行RT-qPCR 驗證，結(jié)果（圖1）顯示，hemA、mreC、STM0951、STM1 252、dcoC與野生型沙門菌LT2 相比轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)0.70 倍、下調(diào)0.59 倍、上調(diào)1.34 倍、上調(diào)0.47 倍和上調(diào)2.46 倍。以上結(jié)果表明，hemA、mreC、STM0951、STM1252、dcoC是本研究篩選被sRNA SdsR 調(diào)控的靶基因。

圖1 RT-qPCR 驗證結(jié)果Fig. 1 Results of RT-qPCR verification

3 討論

sRNA SdsR 是伴侶蛋白Hfq 依賴性sRNA 中的一員，它在腸桿菌的保守性以及經(jīng)過驗證的靶標(biāo)的生物學(xué)作用使得 SdsR 成為sRNA 研究領(lǐng)域中深入研究的主題。Choi 等[12]對sRNA SdsR 進(jìn)行RNA-seq 來尋找SdsR 驅(qū)動的細(xì)胞死亡的靶基因。雖然此方法能篩選到大量的潛在靶基因，但由于篩選到的基因總數(shù)太大，驗證sRNA 直接調(diào)控的靶基因有著很大程度上的不確定性，導(dǎo)致直接調(diào)控靶基因的確定較困難。TargetRNA2 在sRNA 目標(biāo)預(yù)測系統(tǒng)中具有獨(dú)特的能力，可以整合RNA-seq 數(shù)據(jù)以提高預(yù)測結(jié)果。本研究采用TargetRNA2 預(yù)測到29 個靶基因，選擇其中的5 個基因進(jìn)行RT-qPCR 驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-qPCR與DESeq 的上下調(diào)趨勢均相符，但差異倍數(shù)不完全符合，這可能與驗證方法不同及儀器靈敏度差異有關(guān)，且RT-qPCR 檢測結(jié)果整體高于DESeq 檢測結(jié)果，說明熒光定量PCR 的敏感性高于DESeq 測序方法。以上結(jié)果表明這些基因可能受SdsR 直接調(diào)控。很明顯，這種針對研究對象特性并結(jié)合軟件預(yù)測的研究方法具有較高的篩選效率，同時結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)能極大提高靶基因的篩選效率。

SdsR 是Hfq 依賴性sRNA，Hfq 相關(guān)sRNA 通常通過反式編碼調(diào)節(jié)靶mRNA，導(dǎo)致在翻譯、RNA 穩(wěn)定性或兩者水平上抑制或激活靶標(biāo)[13]。反式編碼調(diào)控小RNA 對靶mRNA 的調(diào)控作用以負(fù)調(diào)節(jié)作用最為常見[14]。在本次研究中，篩選出的5 個靶基因中hemA、merC的表達(dá)量下調(diào)，說明在沙門菌中，SdsR 對某些靶基因的表達(dá)有促進(jìn)作用，其調(diào)控機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。SdsR 與靶mRNA 互補(bǔ)配對的位置通常位于其5′UTR 靠近翻譯的起始位點(diǎn)的區(qū)域，而預(yù)測結(jié)果顯示SdsR 與hemA、mreC、STM1252 的結(jié)合位點(diǎn)為起始密碼子的CDS 區(qū)，這種結(jié)合方式并不常見。Verena Pfeiffer[15]驗證了與Hfq 相關(guān)的sRNA MicC 通過CDS（密碼子23-26）中的r12-bp RNA 雙鏈體沉默鼠傷寒沙門氏菌ompDmRNA，此外，ArcZ-TPX[16]、RybB-fdaL[17]、SgrS-manX[18]等都屬于sRNA 與靶基因的CDS 區(qū)域相互作用。此機(jī)制已被證明是一種比以前認(rèn)為的更為常見的機(jī)制。這些研究支撐了hemA、mreC、STM1 252 作為SdsR 靶標(biāo)的可能性。

TargetRNA2 預(yù)測到的5 個基因中，hemA編碼谷氨酰-tRNA 還原酶[19]，該酶是催化血紅素生物合成途徑中的第一個關(guān)鍵步驟。血紅素可作為一種主要的鐵來源，鐵是大多數(shù)生物包括細(xì)菌生命的必需營養(yǎng)元素[20]。STM0951 基因GO 富集到氧化還原過程，鼠傷寒沙門菌作為需氧及兼性厭氧型細(xì)菌，細(xì)菌的許多生命活動都會進(jìn)行著復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)，如呼吸作用、固氮作用及生物體內(nèi)許多代謝活動。merC與膜的組成部分質(zhì)膜相關(guān)，STM1 252 編碼細(xì)胞質(zhì)蛋白。dcoC編碼草酰乙酸脫羧酶亞基γ，草酰乙酸脫羧酶還有α、β 另外兩個亞基，其具備鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能；另外，研究還發(fā)現(xiàn)草酰乙酸脫羧酶對細(xì)菌的致病性及毒力起重要作用，如在軍團(tuán)菌中草酰乙酸脫羧酶突變導(dǎo)致其在宿主體內(nèi)的增殖能力減弱[21]。沙門菌作為重要的人畜共患病原菌，掌握其sRNA與靶基因的互作方式及了解其靶基因的組織結(jié)構(gòu)、生理功能等有利于人們應(yīng)對沙門氏菌的威脅，保證人類和動物的健康。