侯 博，王晨燕，陳秋勇，吳學(xué)敏，劉玉濤，王隆柏，周倫江

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】偽狂犬?。≒seudorabies，PR），又稱奧耶斯基氏?。ˋujeszky’s disease，AD），是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、α-皰疹病毒亞科（Subfamily Alphaherpesvirinae）、水痘皰疹病毒屬（Varicellovirus），能夠感染豬、牛、羊、小鼠、家兔、貓、犬等多種動物，豬是PRV 感染后可以存活的唯一物種，因此也是該病毒的貯存宿主。歐守杼等分別在20 世紀(jì)50-60 年代報(bào)道我國仔豬中發(fā)生豬偽狂犬病[1]，而PR 在我國第一次大規(guī)模暴發(fā)發(fā)生在20 世紀(jì)90 年代，表現(xiàn)為經(jīng)典PR 癥狀，母豬流產(chǎn)及仔豬神經(jīng)癥狀；PR 在我國第二次暴發(fā)發(fā)生于21 世紀(jì)初，呈現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)，表現(xiàn)為“流產(chǎn)風(fēng)暴”，但20世紀(jì)90 年代以來，規(guī)?；i場普遍使用Barthak-61 疫苗株，該病得到很好控制；2011 年10 月以來，PR在我國呈現(xiàn)第三次暴發(fā)，以高密度PRV 免疫豬場野毒陽性率高并伴有成年種豬及育肥豬的突然死亡[2]，并且席卷全國、快速傳播，對中國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的影響，經(jīng)我國多個研究團(tuán)隊(duì)的病原學(xué)研究證明為新發(fā)變異PRV 導(dǎo)致。因此迫切需要以新型變異PRV 毒株開發(fā)新的疫苗以防控該病的持續(xù)性發(fā)生?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】gE是PRV重要的毒力基因之一，缺少gE的PRV對神經(jīng)系統(tǒng)的侵入能力下降，并且gE是PRV 在檢測中首選的標(biāo)志性基因，針對gE 抗體的血清學(xué)檢測方法已經(jīng)非常成熟，是經(jīng)典的鑒別區(qū)分野毒感染或疫苗免疫的血清學(xué)方法。部分歐美國家對該病投入巨大的人力、物力及財(cái)力，通過gEELISA 鑒別診斷技術(shù)已經(jīng)在家豬中凈化和消滅了該病[3]。多年來，我國普遍采用gE 缺失的弱毒活苗免疫接種、野毒監(jiān)測和凈化等技術(shù)，該病得到有效控制，其發(fā)病和流行情況趨于穩(wěn)定[4]。但是從2011 年10 月開始，我國大部分地區(qū)先后在Bartha-K61 免疫的規(guī)?；i場再次暴發(fā)偽狂犬病，分離的變異PRV對于85 日齡的育肥豬也具有致死性，其主要特點(diǎn)為：（1）免疫過Bartha-K61 疫苗的懷孕母豬發(fā)生高流產(chǎn)率；（2）生長豬出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂并且高死亡率；（3）血清高gE陽性率[2,5-6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2011 年以后分離的所有新發(fā)變異超強(qiáng)PRV毒株，與歐洲和美洲毒株或2000 年以前分離的中國傳統(tǒng)株相比，在基因組序列上具有明顯的變異[7]。近年來從我國不同地區(qū)分離了大量的新發(fā)PRV 毒株，包括HNX、ZJ01、HeN1、SMX、TJ、JS、HNB、HN1201、FJ-2012 等，而現(xiàn)有疫苗對新發(fā)變異毒株不能提供很好的保護(hù)，亟需以新發(fā)變異的PRV超強(qiáng)毒株開發(fā)新的PR 疫苗，以更好地控制和預(yù)防PR?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以偽狂犬病毒新發(fā)變異FJ-2012 株的gE/gI基因缺失株作為疫苗種子毒，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)以甲醛滅活后與不同佐劑制成滅活疫苗免疫綿羊，免疫28 d 后經(jīng)親本強(qiáng)毒株FJ-2012 株攻擊，對不同佐劑制備的滅活疫苗進(jìn)行免疫效力比較，為制備有效的滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PRV 新發(fā)變異強(qiáng)毒FJ-2012 株及其gE/gI基因缺失株（FJ-2012ΔgE/gI株，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:V202025）由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；BHK-21 細(xì)胞[生長液為10%胎牛血清（FBS）的DMEM，維持液為1% FBS 的DMEM]、pEGFP-N1 質(zhì)粒、pBelo BAC II 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。pCR?-Blunt II-TOPO?質(zhì)粒和pUC19 質(zhì)粒分別購自Thermo 公司和大連寶生物公司；FBS 購自Thermo 公司；佐劑ISA 206VG 和GEL02 購自賽彼科公司；白油、吐溫80、司盤80 購自上海邁弘生物科技有限公司；體重15～20 kg 的健康、偽狂犬gB 抗體為陰性的綿羊購自福建某規(guī)?；B(yǎng)殖場；PRVgB和gE抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司。

高保真聚合酶AccuPrimeTMpfxDNA Polymerase、DMEM 培養(yǎng)基、低熔點(diǎn)瓊脂糖、opti-MEM 培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine?2000、DMSO 均購自Thermo公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SacⅠ、HindIII、PstⅠ、PacⅠ、SphI 和堿性磷酸酶（CIP）均購自NEB 公司；2×PCR preMIX 購自廣州東盛生物公司；病毒DNA 提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen 公司；DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。試驗(yàn)所使用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 同源重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 的構(gòu)建

通過分子生物學(xué)技術(shù)將FJ2012 株gE/I基因的上下游同源片段依次插入到質(zhì)粒pUC19 構(gòu)建pUC19:H1:H2，再插入EGFP 表達(dá)盒和BAC 序列，構(gòu)建用于同源重組的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2。以FJ2012基因組DNA 為模板，按照文獻(xiàn)[8]中的引物序列和方法構(gòu)建pUC19:H1:H2 質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶HindIII 和PstⅠ對pUC19:H1:H2 雙酶切鑒定，酶切后預(yù)期片段大小約為4 000 bp 和1 100 bp；將鑒定正確的質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

按照文獻(xiàn)[8]中的引物EGFP-F 和EGFP-R 使用AccuPrimeTMpfxDNA Polymerase 以pEGFP-N1 為 模板擴(kuò)增EGFP 表達(dá)盒，參照文獻(xiàn)[8]依次將EGFP 表達(dá)盒和pBelo BAC II 質(zhì)粒采用合適的限制性內(nèi)切酶酶切后插入到pUC19:H1:H2，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUC19:H1:EGFP:BAC:H2，并保存?zhèn)溆?。將鑒定構(gòu)建正確的質(zhì)粒參照文獻(xiàn)[8]的方法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，驗(yàn)證質(zhì)粒是否正確并產(chǎn)生熒光以及轉(zhuǎn)染效率。

1.3 構(gòu)建gE/gI 缺失的重組病毒FJ2012ΔgE/gI

參照文獻(xiàn)[8]的方法，提取FJ2012 毒株的基因組感染性DNA，與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 共轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，篩選并進(jìn)行噬斑純化，選取具有穩(wěn)定的熒光斑病毒，命名為rPRV FJ2012 ΔgE/gI:EGFP+:BAC+。提取重組病毒基因組DNA 為模板，以文獻(xiàn)[8]中的PRV-gE-632-F 和PRV-gE-632-R 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對噬斑純化后的重組病毒是否含有野毒進(jìn)行鑒定。

提取重組病毒rPRV FJ2012ΔgE/gI:EGFP+:BAC+的感染性基因組與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19:H1:H2 共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過噬斑純化篩選到gE/gI基因缺失、不含有EGFP 和BAC 序列的無痕重組病毒，命名為FJ2012ΔgE/gI株。對FJ2012ΔgE/gI重組病毒進(jìn)行穩(wěn)定性傳代測定，連續(xù)傳代20 代，觀察每個代次之間的細(xì)胞病變，并且對P1、P5、P10、P20 代的病毒進(jìn)行滴度TCID50測定，評價FJ2012ΔgE/gI重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。

1.4 疫苗制備所用病毒液的增殖與滅活

采用靜置培養(yǎng)的方式，對FJ-2012ΔgE/gI株按照常規(guī)病毒培養(yǎng)方式進(jìn)行病毒大量增殖，增殖后凍融3 次，15 000 r·min-14 ℃下高速離心30 min 除去細(xì)胞碎片，收集上清作為滅活前抗原備用，并按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法測定TCID50。在上述備用抗原病毒液中緩慢加入適量的10%甲醛，使甲醛終濃度為0.1%，搖勻后全部轉(zhuǎn)移到一個新的無菌三角瓶中，在37 ℃條件下滅活36 h，滅活過程中于200 r·min-1不斷振蕩，使滅活完全。滅活結(jié)束后，取滅活后病毒液5 mL，分別接種5 瓶長滿單層的BHK-21 細(xì)胞（25 cm2），每瓶1 mL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)7 d，觀察是否有細(xì)胞病變出現(xiàn)，并盲傳3 代，確定病毒滅活完全。

1.5 滅活疫苗制備

1.5.1 水相佐劑滅活疫苗的制備和檢驗(yàn) 準(zhǔn)備75 mL的佐劑GEL02 和425 mL 滅活的水相抗原，將盛放水相抗原的燒杯置于攪拌器下，攪拌速度200 r·min-1，向水相抗原中加入佐劑相，200 r·min-1攪拌10 min后，20 ℃靜置過夜，將制備好的疫苗分裝于玻璃瓶中，進(jìn)行性狀檢驗(yàn)，另分別儲存在3 個溫度（4 ℃、20 ℃、37 ℃）下，進(jìn)行穩(wěn)定性觀察，其余保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 油佐劑滅活疫苗的制備和檢驗(yàn)油相制備 添加適量司盤-80 到400 mL 白油中，在60 ℃條件下充分?jǐn)噭颍?15 ℃高壓滅菌15 min。水相制備：將適量的吐溫-80 緩慢加入到160 mL 滅活后的PRV 病毒液中，攪拌使吐溫-80 充分溶解并混勻。乳化：含368 mL的油相燒杯轉(zhuǎn)移到乳化機(jī)下，調(diào)整乳化機(jī)轉(zhuǎn)速11 000 r·min-1，混合油相15 s，將上述水相抗原加入到油相中，乳化機(jī)在＜25 ℃下，11 000 r·min-1乳化7 min后停止，進(jìn)行性狀檢驗(yàn)，觀察疫苗色澤，另取一潔凈吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴(kuò)散；取3 mL 乳化后樣品在20 ℃下，1 570 g 離心15 min 應(yīng)無明顯分層；在37 ℃左右條件下放置21 d 應(yīng)不破乳，其余保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 雙相佐劑滅活疫苗的制備和檢驗(yàn) 準(zhǔn)備200 mL的雙相佐劑ISA206VG 和200 mL 滅活的水相抗原，在31 ℃水浴鍋將兩相分別加熱30～40 min，將裝有佐劑的燒杯置于攪拌器下，攪拌速度350 r·min-1，從水浴鍋中拿出加熱后的水相抗原，擦干燒杯外壁，向佐劑中快速加入水相（約3 s），350 r·min-1攪拌5 min 后，停止攪拌冷卻，在20 ℃靜置1 h，疫苗制備完畢后室溫放置過夜。將制備好的疫苗分裝于玻璃瓶中，進(jìn)行性狀檢驗(yàn)，另分別儲存在4 ℃和20 ℃下，進(jìn)行穩(wěn)定性測定，其余保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 不同滅活疫苗的免疫效力試驗(yàn)

將25 頭體重15～20 kg 的綿羊分5 組，每組5頭，其中3 組分別使用GEL02 佐劑滅活疫苗、ISA 206VG 佐劑滅活疫苗和白油佐劑滅活疫苗以頸部皮下注射方式免疫疫苗5 mL，免疫4 周后連同對照組以皮下注射的方式每頭感染強(qiáng)毒FJ-2012 株病毒液1 mL（含病毒104TCID50），另設(shè)陰性對照組。免疫前和攻毒前均采血分離血清，采用ELISA 方法測定gB和gE抗體；免疫后觀察動物免疫應(yīng)激反應(yīng)情況，包括是否出現(xiàn)死亡、變態(tài)反應(yīng)、接種部位膿腫等現(xiàn)象；攻毒后觀察動物精神狀態(tài)以及是否發(fā)病，包括是否啃咬接種部位，接種部分是否發(fā)生潰爛，是否出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，記錄發(fā)病死亡情況。攻毒后連續(xù)觀察14 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 的構(gòu)建及驗(yàn)證

以FJ2012 株DNA 為模板，擴(kuò)增gE/gI基因上下游同源臂H1 和H2 片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期相符，預(yù)期片段大小分別為1 135 bp和1 163 bp，將H1 和H2 片段先后插入到pUC19 質(zhì)粒中，構(gòu)建pUC19:H1:H2 質(zhì)粒。將構(gòu)建好的pUC19:H1:H2質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindIII 和PstⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切后片段大小預(yù)期為4 000 bp 和1 100 bp，酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測構(gòu)建的pUC19:H1:H2 質(zhì)粒正確。

將EGFP 表達(dá)盒從pEGFP-N1 質(zhì)粒上擴(kuò)增后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶PacⅠ酶切后插入到pUC19:H1:H2 質(zhì)粒，用EGFP-D-F 和EGFP-D-R 引物進(jìn)行PCR 鑒定，其擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期大小339 bp 相符，然后將鑒定正確的pUC19:H1:EGFP:H2 和pBelo BAC II 質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶SphI 酶切后，將二者連接克隆，用BAC-D-F 和BAC-D-R 引物進(jìn)行PCR 鑒定，其擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期大小390 bp 相符，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUC19:H1:EGFP:BAC:H2。

將構(gòu)建正確的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2轉(zhuǎn)染細(xì)胞BHK-21 后，在細(xì)胞中觀察其轉(zhuǎn)染效率和是否產(chǎn)生熒光，驗(yàn)證其是否可以作為構(gòu)建PRV 基因缺失株的同源重組質(zhì)粒。結(jié)果表明pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 經(jīng)轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞后可以使細(xì)胞產(chǎn)生熒光（圖1），且轉(zhuǎn)染效率較高，可作為同源重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。

圖1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞熒光性的鑒定Fig. 1 Green fluorescence of pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 plasmid transfected into BHK-21 cell

2.2 gE/gI 基因缺失病毒FJ2012ΔgE/gI 的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)過第一次同源重組和噬斑純化，成功篩選到含有熒光標(biāo)記的gE/I基因缺失的重組病毒rPRVFJ2012 ΔgE/gI:EGFP+:BAC+，在明場下可以觀察到相應(yīng)的細(xì)胞病變（圖2）。以熒光重組病毒基因組DNA為模板，以PRV-gE-632-F 和PRV-gE-632-R 引物對重組病毒進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果表明gE/gI基因已經(jīng)被轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的相應(yīng)序列替換。經(jīng)第二輪同源重組和噬斑純化，成功篩選到gE/I基因缺失、不含有EGFP和BAC 序列的無痕重組病毒rPRV-FJ2012ΔgE/gI，在熒光顯微鏡下無熒光，在明場下可以觀察到明顯的細(xì)胞病變（圖3），以PRV-gE-632-F 和PRV-gE-632-R引物擴(kuò)增序列經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果表明gE/gI基因缺失成功，將鑒定正確的病毒命名為FJ2012ΔgE/gI。對重組病毒傳代穩(wěn)定性測定發(fā)現(xiàn)P1、P5、P10、P20 代病毒的TCID50分別為108.3·mL-1、108.5·mL-1、108.6·mL-1、108.4·mL-1，與親本株FJ2012株（108.0～8.5·mL-1）無明顯差異，表明重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖2 pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 與PRV FJ-2012 毒株感染性DNA 共轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞后形成的帶有EGFP 序列的rPRV:EGFP+:BAC+重組病毒Fig. 2 Plaques of recombinant PRV rPRV- FJ2012ΔgE/gI:EGFP+:BAC+ from pUC19:H1:EGFP:BAC:H2 plasmid and PRV FJ2012 strain DNA co-transfected into BHK-21 cells

圖3 pUC19:H1:H2 與rFJ-2012-ΔgE/gI:EGFP+:BAC+毒株的感染性DNA 共轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞后形成的刪除EGFP:BAC 序列的rPRV FJ-2012-ΔgE/gI 重組病毒Fig. 3 Plaques of recombinant PRV- FJ2012ΔgE/gI from pUC19:H1:H2 plasmid and rPRV- FJ2012ΔgE/gI:EGFP+:BAC+ strain DNA co-transfected into BHK-21 cells

2.3 制苗用病毒液的滴度測定和滅活效果

將收獲的PRV FJ-2012ΔgE/gI株病毒液混勻后測定的TCID50為107.8·mL-1，基本達(dá)到制備滅活疫苗的要求。滅活后的病毒液在BHK-21 細(xì)胞盲傳3 代均不出現(xiàn)CPE，表明病毒經(jīng)0.1%的甲醛在37 ℃下36 h滅活完全。

2.4 不同佐劑的滅活疫苗制備及檢驗(yàn)

制備的水相佐劑（GEL02）滅活疫苗，外觀呈淡粉紅色乳劑；將少量疫苗滴于冷水中，液滴擴(kuò)散到水中；在4 ℃和20 ℃下存放30 d，無析出和分層現(xiàn)象，結(jié)果表明滅活疫苗劑型正確、乳化充分、穩(wěn)定性較好，符合規(guī)定要求。制備的油佐劑滅活疫苗，外觀為乳白色的乳劑；將少量疫苗滴于冷水中，呈油滴狀不擴(kuò)散；1 570 g 離心15 min 無明顯分層；在37 ℃左右條件下放置21 d 不破乳，結(jié)果表明制備的油佐劑滅活疫苗劑型正確、乳化充分、穩(wěn)定性較好，符合規(guī)定要求。制備的雙相佐劑（ISA 206VG）滅活疫苗，外觀呈淡粉紅色乳劑；將少量疫苗滴于冷水中，呈云霧狀擴(kuò)散；在4 ℃和20 ℃下存放30 d，無析出和分層現(xiàn)象，結(jié)果表明滅活疫苗劑型正確、乳化充分、穩(wěn)定性較好，符合規(guī)定要求。對制備的3 種滅活疫苗按照《中國獸藥典》（2015 版）進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，均無菌生長。

2.5 不同佐劑的FJ-2012ΔgE/gI 株滅活疫苗的免疫效果及抗體檢測結(jié)果

將制備的3 種不同劑型的滅活疫苗以每頭皮下注射5 mL 的方式免疫綿羊后，僅有1 頭綿羊出現(xiàn)了過敏變態(tài)反應(yīng)，其他接接種綿羊均無不良反應(yīng)發(fā)生。將免疫前和免疫后28 d 采集的血清進(jìn)行ELISA檢測，5 組所有綿羊免疫前的血清gB和gE抗體均為陰性，表明無PRV 感染。免疫28 d 后3 個免疫組綿羊的gB抗體全部為陽性，gE抗體全部為陰性（表1），結(jié)果表明疫苗接種效果良好，疫苗株gE/gI基因缺失完全。在免疫28 d 后，連同一組對照組使用PRV FJ-2012 株以每頭104TCID50的劑量感染后觀察14 d，陽性感染組綿羊在感染后4～5 d 全部死亡，而GEL02佐劑疫苗組和白油佐劑疫苗組的綿羊全部存活，保護(hù)率為100 %，ISA 206VG 佐劑疫苗組免疫綿羊死亡2 頭，保護(hù)率僅為60%，陰性對照組全部健存，其中死亡的動物在接種部位均出現(xiàn)啃咬或瘙癢以及四肢劃水樣等典型的偽狂犬病毒感染癥狀。表明以GEL02 佐劑和白油佐劑制成的FJ-2012ΔgE/gI株滅活疫苗免疫綿羊后可以抵御變異毒親本株FJ-2012 株的攻擊。

表1 PRV FJ-2012ΔgE/gI 株不同佐劑滅活疫苗免疫綿羊28 d后ELISA 測定血清gB 和gE 抗體結(jié)果Table 1 gB and gE antibodies in sheep vaccinated by different inactivated PRV FJ-2012ΔgE/gI vaccines detected using IDEXX ELISA kit

3 討論

我國在2011 年以前使用Bartha-K61 疫苗株或本地gE缺失弱毒苗使PR 得到了很好的控制[4]。然而從2011 年10 月開始，我國從不同流行地區(qū)規(guī)?；i場分離到的PRV 均表現(xiàn)出毒力增加[6]，對育肥豬和仔豬的致病性也增加，并且可以引起育肥豬的死亡，現(xiàn)有疫苗對新發(fā)變異株不能提供很好的保護(hù)[9]。與經(jīng)典的PRV 毒株相比，糖蛋白gB 的變異導(dǎo)致PRV變異株JS-2012 和Bartha-K61 的免疫原性不同，序列分析表明新發(fā)的PRV變異株JS-2012 的gB基因與疫苗株Bartha-K61 相比具有多個變異位點(diǎn)[10]。與歐洲和美洲毒株或2000 年以前分離的中國傳統(tǒng)毒株相比，在基因組序列上具有明顯的變異[7]，為新發(fā)變異的PRV 超強(qiáng)毒株，包括HNX、ZJ01、HeN1、SMX、HNB、HN1201 和FJ-2012 等[2,5,7,9,11]。為了有效應(yīng)對新發(fā)變異PRV 的感染，我國許多研究團(tuán)隊(duì)均開展了中國變異PRV 毒株的基因缺失疫苗研究[12-15]。本研究以福建本地PRV 分離株FJ-2012 為親本株，通過構(gòu)建gE/gI基因缺失株后制備不同佐劑的滅活疫苗，在綿羊上評估滅活疫苗的安全性和有效性。

YU等通過構(gòu)建兩株P(guān)RV嵌合病毒BJB（Bartha-K61 +JS-2012gB）和JBJ（JS-2012-ΔgE/gI+Bartha-K61gB），使用滅活的BJB 和JBJ 對小鼠進(jìn)行免疫，使用JS-2012 毒株攻毒表明BJB 能夠增加保護(hù)力到80%，而Bartha-K61 的保護(hù)力只有40%，JBJ的保護(hù)效果只有65%，而JS-2012-ΔgE/gI毒株的保護(hù)力能夠達(dá)到90%，表明gB基因的交換可以顯著改變重組病毒的免疫原性[10]。新發(fā)變異毒株TJ 缺失gE/gI基因后對于豬是無致病性，而對綿羊具有毒力[12]。本研究對分離于福建的新發(fā)變異PRV 病毒FJ-2012 株采用同源重組的方法成功構(gòu)建了具有g(shù)E/gI基因缺失標(biāo)記的偽狂犬病疫苗候選株FJ-2012ΔgE/gI，并以此為種毒甲醛滅活后利用商品化的白油佐劑、水相佐劑、雙相佐劑制備了不同劑型的PRV FJ-2012gE/gI基因缺失滅活疫苗。結(jié)果表明以FJ-2012ΔgE/gI疫苗候選株制備的滅活疫苗能夠采用gE-ELISA 的方法鑒別疫苗接種和野毒感染，并且以水相佐劑GEL02和白油佐劑制備的FJ-2012ΔgE/gI滅活疫苗其免疫保護(hù)效力較高。

因此，本研究構(gòu)建的PRV FJ2012 毒株的gE/gI基因缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，以其作為抗原病毒與合適的佐劑制成滅活疫苗，可以對新發(fā)變異毒株的感染提供完全保護(hù)效果，為我國新發(fā)變異PRV 的防控提供了新的技術(shù)參考。