宋崇陽, 張思勉, 李永闖, 張 攀, 賴曉芳, 王攀攀, , 于 飛,高 煥, , 閻斌倫,

(1. 江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室 江蘇省海洋生物技術重點實驗室, 江蘇 連云港222005; 2. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 連云港 222005; 3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質資源保護與利用平臺, 江蘇 南京 210014; 4. 連云港市海洋與漁業(yè)發(fā)展促進中心, 江蘇 連云港 222005)

DNA甲基化是由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase, DNMT)以活性甲基化合物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體, 將甲基基團催化并轉移到DNA特定堿基上的表觀遺傳修飾過程[1],在基因印跡[2]、X染色體失活[3]和維持染色體結構完整性[4]等方面發(fā)揮重要作用。DNA甲基轉移酶在生物機體內(nèi)由甲基化轉移酶基因表達而來, 已知生物基因組中含有多種DNA甲基化轉移酶基因,包括Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3等[5], 其中DNA甲基轉移酶2基因(DNA methyltransferase2,Dnmt2)在各類真核生物中廣泛存在, 含有DNA甲基轉移酶的所有特征性保守基序, 是DNA甲基轉移酶基因家族進化過程中最保守的家族成員[6]。研究發(fā)現(xiàn),DNMT2還具有催化tRNA甲基化的功能[7]。在羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)中的研究顯示,Dnmt2在卵巢中的表達量顯著高于其他組織, 胚胎早期發(fā)育階段中表達量顯著高于其他發(fā)育階段,表明其可能在羅氏沼蝦早期胚胎發(fā)育中起調(diào)節(jié)作用[8]。對三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Dnmt2基因于不同組織及發(fā)育階段的表達分析中同樣發(fā)現(xiàn),Dnmt2在三疣梭子蟹胚胎、幼體和性腺發(fā)育調(diào)控中可能具有重要作用[9]?；虻谋磉_受多種調(diào)控機制影響, 啟動子是最主要的調(diào)控方式之一, 真核生物的啟動子是一段位于結構基因5′端上游的DNA序列, 含有RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列, 決定基因轉錄起始的位置[10]。通常情況下, 轉錄因子通過與啟動子上特定序列的結合,將來自細胞表面的信息傳遞至核內(nèi)基因, 促進或抑制相關蛋白的轉錄[11], 啟動子區(qū)域的元件組成和其具有的功能對于基因的表達和轉錄環(huán)節(jié)的調(diào)控至關重要[12,13]。

目前, 有關Dnmt2轉錄調(diào)控的研究較少, 尤其在甲殼動物中。脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)廣泛分布于中國沿海海域, 具有繁殖能力強、生長周期短、環(huán)境適應性廣的特點。近年來, 在傳統(tǒng)蝦類養(yǎng)殖難度增加、利潤下降的情況下, 脊尾白蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量增長迅速, 已成為中國沿海地區(qū)池塘單養(yǎng)或混養(yǎng)的重要品種[14,15]。本課題組前期克隆獲得脊尾白蝦Dnmt2cDNA全長序列1 321 bp, 同源序列比對發(fā)現(xiàn)與羅氏沼蝦Dnmt 2同源性最高為78.67%,進一步通過構建NJ系統(tǒng)進化樹, 顯示與羅氏沼蝦Dnmt 2聚為一支。在此基礎上, 本研究通過染色體步移技術克隆得到脊尾白蝦Dnmt2啟動子序列, 運用生物信息學方法預測轉錄因子結合位點和CpG島位點, 構建了相應的報告基因驗證啟動子活性,為進一步揭示Dnmt2轉錄調(diào)控的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用脊尾白蝦為實驗室自繁而來個體, HEK293細胞為本實驗室保存。

1.2 實驗方法

取脊尾白蝦新鮮肌肉組織, 液氮研磨后用動物基因組DNA快速抽提試劑盒(生工生物工程)提取DNA。根據(jù)本課題組克隆獲得的脊尾白蝦Dnmt2cDNA全長序列, 利用PrimerPremier 5.0設計步移引物(表1), 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Genome Walking Kit(TaKaRa)試劑盒對Dnmt2啟動子序列進行克隆。

1.3 序列分析

利用在線分析網(wǎng)站BDGP(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預測Dnmt2啟動子序列起始位點, 使用JASPAR(https://jaspar.genereg.net/)、TFBIND(https://tfbind.hgc.jp/)和AnimalTFDB3.0(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/)預測分析啟動子轉錄調(diào)控位點, 通過MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預測CpG島。

1.4 啟動子活性分析

1.4.1 啟動子不同截短體的構建

根據(jù)克隆得到的脊尾白蝦Dnmt2的啟動子序列,設計啟動子區(qū)域不同長度片段擴增引物, 引物序列見表2。上下游引物5′端分別添加MluI和SmaI酶切位點(加粗字母表示), 酶切位點前添加保護堿基, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 脊尾白蝦Dnmt2啟動子不同長度片段克隆引物Tab. 2 Primers used to amplify deletion fragments of the E. carinicauda Dnmt2 promoter

以提取的DNA為模板, 使用Dnmt2啟動子不同長度片段的擴增引物進行PCR擴增, 得到片段D1、D2、D3、D4和T1、T2、T3、T4。使用MluI和SmaI快切酶(生工生物工程, 上海)分別雙酶切片段D1~D4、T1~T4和pGL3-Basic質粒, 利用T4連接酶連接構建重組質粒, 并轉化至DH5α感受態(tài)細胞(Vazyme, China), 將菌液PCR篩選得到的陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。利用質粒小提試劑盒(生工生物工程, 上海)提取測序結果正確的陽性質粒, 使用MluI和SmaI快切酶進行雙酶切驗證, 將構建成功的重組質粒分別命名為pGL3-Basic-D1~D4和pGL3-Basic-T1~T4。

1.4.2 細胞培養(yǎng)及瞬時轉染

使用含有10%血清、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)基(生工生物工程, 上海), 于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293細胞。細胞生長至指數(shù)生長期時, 接種于24孔板中, 待細胞完全貼壁生長至約80%匯合時, 使用轉染試劑ExFect Transfection Reagent (Vazyme, China)進行瞬時轉染, 內(nèi)參質粒為pRL-TK, 分別將重組質粒和空載質粒與內(nèi)參質粒以100︰1的比例共轉染到細胞中, 每個樣品做3次重復, 轉染32 h后收集細胞,使用Dual Luciferase Reporter Assay Kit (Vazyme,China)報告基因活性檢測試劑盒進行雙熒光素酶活性檢測。

1.4.3 雙熒光素酶活性測定

待轉染32 h后, 吸棄細胞培養(yǎng)基, 用PBS洗滌兩次, 每個孔加入100 μL細胞裂解緩沖液, 室溫靜置裂解5 min, 吹打并吸取細胞裂解產(chǎn)物至1.5 mL離心管中, 12 000 g常溫離心2 min后, 取上清用于后續(xù)檢測。首先進行螢火蟲熒光素酶反應檢測: 將100 μL平衡至室溫的熒光素底物加入檢測管中, 小心吸取20 μL細胞裂解上清至檢測管中, 迅速混勻后立即于發(fā)光檢測儀(Promega GloMax 20/20)中檢測螢火蟲熒光素酶報告基因活性。再進行海腎熒光素酶反應檢測: 在以上反應液中加入100 μL新鮮配制的海腎底物工作液, 迅速混勻后立即于發(fā)光檢測儀中檢測海腎熒光素酶報告基因活性, 記錄結果。

1.4.4 統(tǒng)計分析

啟動子的相對活性用螢火蟲熒光素酶的值/海腎熒光素酶的值表示。實驗數(shù)據(jù)利用SPSS22.0進行統(tǒng)計學分析, 使用Origin9.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 脊尾白蝦Dnmt2啟動子序列的克隆和生物信息學分析

通過染色體步移克隆獲得Dnmt2啟動子序列, 從翻譯起始密碼子(ATG)起向上游共1 551 bp。對序列進行生物信息學分析, 結果顯示: 轉錄起始位點是位于ATG上游的第236個堿基“A”, –26 bp處發(fā)現(xiàn)TATA-box, 分析啟動子序列發(fā)現(xiàn),Dnmt2啟動子含有多個轉錄因子結合位點, 包括STAT3、NF-κB、E2F、GATA-1和SOX等(圖1)。用在線軟件MethPrimer預測啟動子區(qū)域CpG島(檢索標準: Islandsize>100.0、GCPercent>50.0、Obs/Exp>0.6), 結果顯示本研究獲得的Dnmt2啟動子區(qū)域中不含CpG島。

圖1 脊尾白蝦Dnmt2近端啟動子轉錄因子結合位點預測Fig. 1 Prediction of transcription factor binding sites in the proximal promoter of Dnmt2 in E. carinicauda

2.2 脊尾白蝦Dnmt2啟動子區(qū)不同長度片段的擴增

以脊尾白蝦基因組DNA為模板, 用引物D-F-1和D-R-1擴增片段D1(–215 bp~+92 bp), 引物D-F-2分別于D-R-2、D-R-3和D-R-4擴增片段D2(–452 bp~+81 bp),D3(–452 bp~–106 bp)和D4(–452 bp~–196 bp), 引物T-F-1, T-F-2, T-F-3和D-F-2分別與D-R-1擴增片段T1(–1315 bp~+92 bp), T2(–940 bp~+92 bp), T3(–640 bp~+92 bp)和T4(–452 bp~+92 bp), PCR產(chǎn)物大小分別與預期設計的長度一致(圖2), 表明成功獲得目的DNA片段。

圖2 脊尾白蝦Dnmt2啟動子不同長度片段的擴增(M. DL2000 DNA Marker)Fig. 2 Amplification of Dnmt2 promoter deletion fragments of the E. carinicauda

2.3 脊尾白蝦Dnmt2啟動子不同長度片段表達載體的構建

用MluI和SmaI快切酶雙酶切各表達載體PGL3-Basic-D1~D4以及PGL3-Basic-T1~T4, 電泳檢測結果(圖3)顯示, 有相應的載體和啟動子片段2條帶,說明表達載體構建成功。

圖3 脊尾白蝦Dnmt2啟動子不同長度片段的擴增(M.DL2000 DNA Marker)Fig. 3 Amplification of Dnmt2 promoter recombinant plasmids of the E. carinicauda

2.4 脊尾白蝦Dnmt2核心啟動子區(qū)的驗證

將構建的雙熒光素酶報告基因重組質粒pGL3-Basic-D1~D4(圖4)和空載質粒pGL3-Basic分別與內(nèi)參質粒pRL-TK共轉染至HEK 293細胞, 轉染32 h后, 收集細胞檢測熒光值, 將檢測的結果進行單因素方差分析。結果顯示, 重組質粒pGL3-D4熒光活性與對照質粒pGL3-Basic無顯著性差異(P<0.05),pGL3-Basic-D1、pGL3-Basic-D2和pGL3-Basic-D3與對照質粒pGL3-Basic均有顯著性差異(P<0.05),其中pGL3-Basic-D2的相對熒光活性最高, pGL3-Basic-D1和pGL3-Basic-D3活性次之(圖5)。結果表明–196bp~+81bp能夠維持Dnmt2啟動子基本轉錄活性, 為該基因核心啟動子區(qū)域。

圖4 質粒pGL3-Basic-D1~D4簡圖Fig. 4 Diagram of plasmids pGL3-Basic-D1~D4

圖5 脊尾白蝦Dnmt2啟動子含轉錄起始位點和不含轉錄起始位點活性分析Fig.5 Activity analysis of the fragments containing and not containing transcription start site of the E. carinicauda Dnmt2 promoter

2.5 脊尾白蝦Dnmt2啟動子不同截短體的活性分析

對Dnmt2啟動子不同長度片段的雙熒光素酶報告基因表達載體進行活性檢測。結果顯示, 重組質粒pGL3-Basic-T1、pGL3-Basic-T2、pGL3-Basic-T3、pGL3-Basic-T4轉染32 h后的活性較對照質粒pGL3-Basic均顯著性增強(P<0.05)。pGL3-Basic-T3的相對熒光活性顯著高于其他組(P<0.05), pGL3- Basic-T1和pGL3-Basic-T2兩組之間活性無顯著性差異(P<0.05),pGL3-Basic-T4的相對熒光活性顯著低于pGL3-Basic-T3(P<0.05)(圖6b)。結果說明, 在脊尾白蝦Dnmt2啟動子–640 bp~–452 bp區(qū)域可能存在促進該基因表達的轉錄調(diào)控元件, 在–940 bp~–640 bp區(qū)域的轉錄調(diào)控元件表現(xiàn)出抑制該基因表達的作用。

圖6 脊尾白蝦Dnmt2啟動子不同長度片段示意圖及活性分析Fig. 6 Diagrammatic drawing (a) and activity analysis (b) of deletion fragments of the E. carinicauda Dnmt2 promoter

3 討論

3.1 啟動子結構及轉錄因子分析

本研究獲得脊尾白蝦Dnmt25′端上游1 315 bp啟動子序列, 轉錄起始位點為翻譯起始密碼子ATG上游236 bp處的堿基“A”, 在其上游26 bp處發(fā)現(xiàn)TATA-box轉錄結合位點。TATA-box為真核生物啟動子序列關鍵的調(diào)控元件, 通常位于轉錄起始位點前25~30 bp區(qū)域內(nèi)[16], 能與RNA聚合酶Ⅱ特異性結合形成轉錄前起始復合物(Transcription pre-initiation com plex, PIC), 調(diào)節(jié)轉錄起始。TATA-box一旦發(fā)生突變將導致轉錄效率降低, 甚至轉錄被阻止[17]。而另有研究發(fā)現(xiàn), 缺少TATA-box的啟動子也可以調(diào)節(jié)基因的組織特異性表達[18]。在甲殼類動物中, TATA-box調(diào)控基因表達的機制還需要進一步研究。

經(jīng)在線軟件預測, Dnmt2啟動子區(qū)域含有STAT3、NF-кB、E2F、SOX、GATA-1等多種轉錄因子結合位點。其中, SOX轉錄因子廣泛參與生物體早期胚胎及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控[19], 并在性別決定和分化過程中發(fā)揮重要作用[20]。STAT3轉錄因子具有信號轉導和轉錄激活的雙重作用, 是 JAK-STAT 信號途徑的重要環(huán)節(jié)[21]。同時也在胚胎早期發(fā)育的過程中扮演重要角色, 在小鼠(Mus musculus)的試驗中表明,STAT3轉錄因子對于大鼠胚胎早期發(fā)育和存活至關重要[22]。轉錄因子E2F家族可以通過調(diào)節(jié)細胞DNA合成以及與細胞增殖有關的基因表達參與細胞周期的調(diào)控, 在細胞增殖、分化和凋亡的過程中發(fā)揮作用[23]。以上轉錄因子的存在, 提示Dnmt2啟動子有可能參與脊尾白蝦早期胚胎發(fā)育及性腺發(fā)育過程。

CpG島通常位于基因的啟動子和第一個外顯子區(qū)域[24], 這些區(qū)域的DNA甲基化與轉錄激活密切相關[25]。將本研究獲得的啟動子進行軟件分析, 發(fā)現(xiàn)其不含CpG島。統(tǒng)計顯示, 大約有40%的哺乳動物基因在其啟動子和外顯子區(qū)域中包含 CpG 島[26], 提示脊尾白蝦Dnmt2啟動子可能不含CpG島, 也另有可能是因目前獲得的脊尾白蝦Dnmt2啟動子太短,需進一步向上游擴增獲得更長的序列再進行CpG島檢測。

3.2 核心啟動子區(qū)分析

核心啟動子區(qū)是指在RNA聚合酶及轉錄因子共同作用下精確指導轉錄起始的最小一段DNA序列,包含 TATA-box、TFIIB識別元件和以轉錄起始位點為中心的起始子等結構, 是基因準確有效轉錄的核心區(qū)域[27]。本研究的核心啟動子區(qū)驗證結果顯示–196~+81 bp能夠維持Dnmt2啟動子基本轉錄活性, 為該基因核心啟動子區(qū)域。在DNA甲基轉移酶基因家族成員Dnmt1啟動子的研究中, 小鼠Dnmt1核心啟動子被發(fā)現(xiàn)位于–1 866~–1 734 bp區(qū)域內(nèi)[28]。因此, 不同基因核心啟動子在結構和功能上會存在差異[29]。

3.3 啟動子調(diào)控原件分析

為檢測Dnmt2啟動子區(qū)域活性, 本研究同時構建了4個啟動子逐漸缺失片段表達載體, 用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶雙報告基因檢測各缺失片段表達載體的轉錄活性。結果發(fā)現(xiàn), 在脊尾白蝦Dnmt2啟動子–640b~–452 bp區(qū)域可能存在促進該基因表達的轉錄調(diào)控原件, 經(jīng)在線軟件分析, 在–640~–452 bp內(nèi)發(fā)現(xiàn)GATA-1轉錄因子結合位點, 表明GATA-1轉錄因子可能正調(diào)控Dnmt2表達, 這與GATA-1轉錄因子在中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)βGBP-HDL基因啟動子中表現(xiàn)出的正調(diào)控作用一致[30]。在胚胎發(fā)育過程中, 組織器官的形成依賴于干細胞正確的定向分化以及中間細胞的凋亡, 在這一精確調(diào)控過程中, GATA 轉錄因子家族扮演了不可或缺的角色[31-32]。另有研究表明,Dnmt2在斑馬魚(Danio rerio)胚胎發(fā)育期敲除后, 導致斑馬魚視網(wǎng)膜、肝臟和大腦出現(xiàn)分化上的缺陷[33]。以上結果進一步提示Dnmt2可能參與調(diào)控脊尾白蝦早期胚胎發(fā)育過程。本研究中,Dnmt2啟動子活性并沒有隨序列長度的增加而上升, 長片段pGL3-Basic-T1和pGL3-Basic-T2與較短片段pGL3-Basic-T3的轉錄活性相比顯著性下降(P<0.05)。在小鼠Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b啟動子研究結果中[34], 轉錄因子對小鼠每種DNA甲基轉移酶基因啟動子片段的調(diào)節(jié)作用各不相同; 但從整體上看, 不同轉錄因子對各DNA甲基轉移酶基因啟動子區(qū)域的長啟動子片段都表現(xiàn)出抑制作用, 這與我們的實驗結果一致。接下來可利用點突變、EMSA和ChIP等方法進一步研究Dnmt2啟動子中起關鍵調(diào)控作用的轉錄因子。以上結果為探明脊尾白蝦Dnmt2啟動子的表達調(diào)控網(wǎng)絡奠定理論基礎。