荀靖懿 , 鄭紀勇, 程旭東 馬 力, 張宏泉 藺存國

(1. 武漢理工大學 材料科學與工程學院, 湖北 武漢 430070; 2. 中國船舶重工集團公司第七二五研究所 海洋腐蝕與防護重點實驗室, 山東 青島 266237)

海洋生物污損對海洋工程、管道設備、船舶等造成很大危害[1]。對船舶而言, 生物污損會增加船舶航行阻力, 加快燃料消耗, 降低船舶在航率, 還會破壞設施的表面涂層, 加速金屬腐蝕[2]。為了解決海洋污損問題, 人類開發(fā)多種防污損方法, 比如機械清除法、低表面能涂料防污法、超聲波防污法、化學防污法及生物防污法。其中化學防污法是目前使用最廣泛的方法之一, 防污劑是其發(fā)揮作用的關鍵成分。傳統(tǒng)的化學防污法通常使用有毒的化學物質(zhì)如TBT、砷、汞化合物、氧化亞銅等[3], 對海洋環(huán)境造成嚴重危害?；赥BT的防污涂料高效且穩(wěn)定, 但對環(huán)境影響巨大, 已于2008年被禁用。而無錫自拋光涂料也因為重金屬積累的問題飽受詬病。因此,越來越多的研究人員開始研制綠色長效的新型防污劑[4-8]。

目前新型防污劑主要來自天然提取物的篩選[9-10]和人工合成化合物的改性。天然提取物主要是從海陸微生物和動植物體內(nèi)分離提取的具備防污活性的次級代謝產(chǎn)物[11-13], 該類產(chǎn)品添加劑在海洋環(huán)境中易于降解, 可保持生態(tài)平衡。在所有來源類別中, 微生物是主要的來源, 超過一半的防污化合物從海洋微生物中分離出來, 包括真菌和細菌。此外, 22%的防污化合物從藻類中鑒定出來, 而23%從包括珊瑚和海綿在內(nèi)的海洋無脊椎動物中分離出來[14-15]。海洋天然產(chǎn)品雖然被認為是有毒殺菌劑或金屬基防污涂料的替代品,但其供應問題限制了它們在海洋涂料行業(yè)的商業(yè)應用, 因此研究人員通過人工合成的方法來制備經(jīng)濟高效的新型防污劑[16-17]。在合成中, 防污活性基團的保留是合成高效防污劑的關鍵。

本文以先期研究從天然產(chǎn)物中獲得的苯酰胺類化合物為模型, 探究分子結(jié)構中的防污活性基團及其對污損生物附著的影響, 設計并合成出非對稱的苯酰胺化合物HNOB(2-hydroxy-N-octylbenzamide)、含有長碳鏈對稱結(jié)構的化合物DOLPA(N1, N3-dioctylisophthalamide)和含有苯酚對稱結(jié)構的化合物DHNOB[N, N′-(octane-1, 8-diyl)bis(2-hydroxybenzamide)], 利用室內(nèi)硅藻附著實驗和貽貝實驗初步測試3種物質(zhì)的防污活性, 結(jié)合分子結(jié)構對比, 來推測可能的防污活性基團結(jié)構。這項工作有助于新型防污活性化合物的設計開發(fā)和結(jié)構優(yōu)化, 并對探討該類化合物防除污損生物附著機理、快速篩選有潛力的防污化合物具有重要意義。

1 實驗

1.1 樣品和試劑

1-氨基辛烷, 1-8-二氨基辛烷, 水楊酸甲酯和間苯二甲酸二甲酯均購自于麥克林, AR級試劑; 碳酸鈉, 無水硫酸鈉, 正己烷, 乙醇, 丙酮, 二甲基亞砜和二氯甲烷均購自于上海滬試, AR級試劑; F/2 Medium購自于上海光語生物科技; Econea購自北京偶合科技, 純度95%。

1.2 HNOB、DHNOB、DOLPA的合成

本文采用胺酯的交換[18-20]反應來合成酰胺[21-22],3種苯酰胺類化合物合成路線如圖1所示。

圖1 三種化合物的合成路線: (a) HNOB、(b) DOLPA和(c) DHNOBFig. 1 Synthesis route of three compounds: (a) HNOB, (b) DOLPA, and (c) DHNOB

1.2.1 HNOB的合成

HNOB通過1-氨基辛烷和水楊酸甲酯進行酯交換反應得到(圖1a)。在100 mL三口燒瓶中依次加入50 mmol水楊酸甲酯, 55 mmol辛胺, 并以500 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌, 加熱至140 ℃時, 反應開始計時, 反應12 h。反應結(jié)束后, 停止加熱, 冷卻出料。加入二氯甲烷溶解產(chǎn)物, 將反應液置于分液漏斗中, 加入50 mL的 5% 鹽酸水溶液, 震蕩靜置后分液, 得到下層液,再加入適量10% Na2CO3水溶液洗滌至中性, 靜置分層得到下層液, 重復3次上述步驟。取有機相, 加入5 g無水硫酸鈉干燥劑過夜干燥, 過濾。對濾液進行旋蒸, 除去二氯甲烷, 最后得到淡粉色固體。

1.2.2 DOLPA的合成

DOLPA通過間苯二甲酸二甲酯和1-氨基辛烷進行酯交換反應得到(圖1b)。在氮氣氛圍下, 將2.91 g(15 mmol)間苯二甲酸二甲酯和3.89 g (30 mmol) 1-氨基辛烷加入到帶有冷凝器的圓底燒瓶中, 混合物在100 ℃下攪拌12 h, 得到粗產(chǎn)物。所得產(chǎn)物用適量丙酮溶解, 用布氏漏斗進行抽濾, 再用丙酮沖洗過濾物, 按上述步驟洗滌3次。用正己烷/乙醇進行重結(jié)晶, 最后結(jié)晶物在60 ℃下真空干燥24 h, 得到白色結(jié)晶物DOLPA。

1.2.3 DHNOB的合成

DHNOB通過1-8-二氨基辛烷和水楊酸甲酯進行酯交換反應得到(圖1c)。在氮氣氛圍下, 將1.4 g(10 mmol) 1-8-二氨基辛烷和3.80 g (25 mmol)水楊酸甲酯加入到帶有冷凝器的圓底燒瓶中, 混合物在100 ℃下攪拌7 h, 得到粗產(chǎn)物。所得產(chǎn)物用適量二氯甲烷溶解, 布氏漏斗進行抽濾, 再用二氯甲烷沖洗過濾物, 按上述步驟洗滌3次。用正己烷/乙醇進行重結(jié)晶, 最后過濾物在60 ℃下真空干燥24 h, 得到白色粉末固體DHNOB。

2 材料測試與表征

2.1 傅里葉紅外分析

用Nicolet 8700型紅外吸收光譜儀對樣品進行結(jié)構表征, 測其在400~4 000 cm–1范圍內(nèi)的吸收峰,得到紅外吸收光譜圖。

2.2 核磁共振分析

核磁共振譜圖采用Bruker Avance NEO 600測試。HNOB、DOLPA和DHNOB樣品測試分別使用二氯甲烷、甲醇和二甲基亞砜氘代溶劑溶解。化學位移(δ)是相對于三甲基硅烷(TMS)的百萬分之一(ppm)。

2.3 硅藻附著實驗

硅藻是導致生物污損的關鍵污損生物, 其在固相表面的附著可誘導大型污損生物附著, 同時附著的硅藻生物膜異常頑固, 能夠廣泛適應各種性質(zhì)的表面[23]。因此, 抑制硅藻的附著是防除污損生物的重要思路之一。室內(nèi)硅藻附著實驗可用于表征化合物的防污性能(圖2)。

圖2 室內(nèi)硅藻附著實驗示意圖Fig. 2 Schematic of the indoor diatom attachment experiment

按照Guillard & Ryther方法配置含硅F/2培養(yǎng)液用于培養(yǎng)小形舟形藻(Navicula parva)和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)。本實驗設計6個梯度濃度, 分別為6.5 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL, 考察3種化合物在不同濃度下對硅藻附著抑制效果。此外每組增設陰性對照組和空白對照組, 化合物濃度為0 μg/mL且含5%體積溶劑的為陰性組, 化合物濃度為0 μg/mL且無溶劑的為空白組。6.5 μg/mL組按下述步驟實施: 預先刻制好圓載玻片, 培養(yǎng)濃度約為1×106個/mL的小形舟形藻或中肋骨條藻藻液以及濃度為6.5 μg/μL的HNOB溶液(HNOB使用二甲基亞砜溶解, DOLPA和DHNOB使用乙醇溶解)。在24微孔板中依次加入圓載玻片、1 900 μL小形舟形藻或中肋骨條藻藻液, 13 μL HNOB溶液和87 μL二甲基亞砜溶劑, 混合均勻。其他組依此類推。最后將微孔板放置于人工氣候箱中, 23 ℃恒溫培養(yǎng)。每組設置3個平行樣。72 h后用滅菌海水輕輕沖洗圓載玻片上未附著硅藻, 用LEICA DM2500熒光顯微鏡在20倍物鏡下觀察圓載玻片上硅藻附著情況, 并隨機選取5個視野在360 nm波長下拍攝熒光照片, 視野面積為0.197 5 mm2, 使用Image pro圖像識別處理軟件對照片中硅藻個數(shù)進行計數(shù)。SY為陰性組硅藻附著數(shù)量,ST為測試組硅藻附著數(shù)量。硅藻附著抑制率Y按下述公式計算:

使用GraphPad Prism 9軟件中的Dose-Response模型將抑制率與對數(shù)濃度擬合曲線[24], 根據(jù)函數(shù)計算出半數(shù)抑制濃度(EC50),式中Hill Slop描述了曲線的陡度。

2.4 貽貝實驗

貽貝足絲腺可分泌足絲, 足絲末端含有萬能膠水之稱的“貽貝粘著蛋白”, 可錨固在大部分硬質(zhì)表面,這使得貽貝成為船體上常見的污損生物, 群集數(shù)目高達1 000個/m2。貽貝實驗主要考察化合物對貽貝足絲的抑制效果。實驗步驟如下: 向6孔細胞培養(yǎng)板中加入9 950 μL天然海水和50 μL濃度為1 μg/μL的化合物溶液, 配制成5 μg/mL的混合液。同時設置空白組, 陰性組(該組中使用乙醇溶劑為陰性組1, 使用二甲基亞砜溶劑為陰性組2)和陽性組(Econea)。向細胞培養(yǎng)板中加入貽貝, 24 h后觀察貽貝活性和分泌的足絲個數(shù), 記為實驗組1。觀察后將實驗組1中的貽貝取出并放入正常海水中繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 再次觀察其活性和足絲個數(shù), 該組記為實驗組2。

3 結(jié)果與分析

3.1 苯酰胺類化合物分子結(jié)構表征

對合成的3種苯酰胺類化合物進行紅外光譜、核磁氫譜和核磁碳譜的測試, 結(jié)果分別如圖3、圖4和圖5所示:

圖3 三種苯酰胺類化合物及其原料的紅外光譜表征Fig. 3 Chemical characterization of the three compounds and their raw materials via FTIR

圖4 三種苯酰胺類化合物的核磁氫譜表征Fig. 4 Chemical characterization of the three compounds via 1H NMR

圖5 三種苯酰胺類化合物的核磁碳譜表征Fig. 5 Chemical characterization of the three compounds via 13C NMR

在HNOB紅外譜圖(圖3a)中, 3 407 cm–1單峰為酰胺N-H伸縮振動峰, 1 644 cm–1和1 540 cm–1分別為羰基伸縮振動(酰胺Ⅰ帶)和N-H彎曲振動(酰胺Ⅱ帶), 另外HNOB沒有出現(xiàn)羰基峰, 這表明合成初步成功。結(jié)合圖4中1H NMR分析: δ0.89為長碳鏈末端-CH3信號, 其峰面積為 3。δ1.22~δ1.41, δ1.65,δ3.45為長碳鏈上亞甲基-CH2-信號, 峰總面積約為14, 與亞甲基上H個數(shù)一致。δ6.53~δ7.43為苯環(huán)及酰胺上H吸收峰。δ12.51為酚羥基吸收峰。通過圖5的13C NMR證實分子結(jié)構中碳的個數(shù)與目標產(chǎn)物一致。

結(jié)合DOLPA和間苯二甲酸二甲酯紅外譜圖(圖3b)看, 在1 715 cm–1處酯鍵C==O振動峰消失, 能夠初步說明DOLPA成功合成。通過1H NMR確定DOLPA化學結(jié)構, 如圖4所示, δ8.24, δ7.94, δ7.55歸屬于苯環(huán)上-C-H信號, 3個信號峰面積比約為1∶2∶1。δ1.30~δ1.63則為長鏈上-CH2-信號。δ0.90為長鏈上末端甲基-CH3信號, 其峰面積約為6。同時通過圖5中13C NMR證實DOLPA結(jié)構中碳的個數(shù)與目標產(chǎn)物一致。

綜合水楊酸甲酯和DHNOB紅外譜圖(圖3c)看,酯基吸收振動峰消失, 酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的生成,能夠初步表明DHNOB合成成功。通過1H NMR確定DHNOB的化學結(jié)構, 如圖4所示, δ7.80的信號屬于-NH, δ6.72~δ7.27歸屬于苯環(huán)上-C-H信號, 峰面積比約為1∶1∶1∶1。δ1.50和δ1.32為長鏈-CH2-信號。這些數(shù)據(jù)表明成功合成DHNOB。同時通過13C NMR確定DHNOB化學結(jié)構(圖5): 167 ppm為羰基C信號, 162 ppm為連接酚羥基C信號, 118 ppm、132 ppm、116 ppm、115 ppm、128 ppm分別為苯環(huán)位置上的碳信號。38 ppm、28 ppm、26 ppm、29 ppm則為長碳鏈上碳信號。

3.2 硅藻附著實驗

對合成的化合物HNOB, DOLPA和DHNOB進行硅藻附著實驗, 使用LEICA熒光顯微鏡對圓載玻片進行拍照, 用Image pro軟件對熒光照片上的紅點進行計數(shù), 并測出其對典型污損生物的半抑制濃度。擬合曲線如圖6所示:

根據(jù)抑制率Y與對數(shù)濃度lgC的關系擬合出如圖6a和圖6b的圖像, 表1給出擬合后的相關系數(shù)R2、Hill Slope和EC50。從表1的EC50看出, 化合物對兩種硅藻都具有一定的抑制, 并且EC50(HNOB)

表1 擬合函數(shù)的相關數(shù)值R2, Hill Slope和EC50Tab. 1 Correlation values of the fitting function R2, Hill Slope, and EC50

圖6 硅藻抑制率與lgC的擬合曲線Fig. 6 Fitting curve of the inhibition rate with lgC

如圖7a和圖8所示, 3種化合物對小形舟形藻均有明顯的抑制作用, 其中HNOB對小形舟形藻的抑制效果最明顯, 半數(shù)抑制濃度EC50為4.661 μg/mL。HNOB和DOLPA的濃度在200 μg/mL時, 對硅藻具有強烈的滅殺效果, 但HNOB在低濃度時具有比DOLPA更好的抑制效果, 6.5 μg/mL濃度作用下, 視野中小形舟形藻的附著個數(shù)為177。DHNOB也具有一定抑制作用, 但是在濃度達到50 μg/mL后, 提高濃度對硅藻的抑制作用不明顯, 小形舟形藻的附著個數(shù)均在70左右。

圖7 不同化合物濃度作用下, 20倍視野中硅藻附著個數(shù)Fig. 7 Number of diatoms attached in the 20× field under different compound concentrations

圖8 硅藻在不同濃度化合物作用下72 h后的熒光照片F(xiàn)ig. 8 Fluorescence images of diatoms exposed to different concentrations of compounds for 72 h

從圖7b和圖8可以看出3種化合物對中肋骨條藻抑制規(guī)律和小形舟形藻相似, 不同之處在于高濃度時DOLPA對中肋骨條藻抑制作用不明顯。

苯酰胺類化合物結(jié)構類似于表面活性劑的結(jié)構[25]。結(jié)合表面活性劑的生物效應[26], 我們認為苯酰胺類化合物可能吸附于帶負電荷的微生物表面, 并逐步滲入類脂層[25], 從而改變細胞膜通透性, 使細胞內(nèi)容物外滲, 導致微生物死亡, 推測機理如圖9a所示。另外結(jié)合藥物設計中的藥效團模型[27-28], 認為化合物有可能在通過磷脂雙分子層后, 與細胞器上的糖蛋白或者其他類型的蛋白進行結(jié)合并對該蛋白的正常功能起到抑制作用, 最終導致微生物失去活性[27],推測機理如圖9b所示。

圖9 化合物抑制硅藻活性的機理示意圖Fig. 9 Mechanism diagram of the compound inhibiting the diatom activity

結(jié)合3種化合物結(jié)構看, DHNOB由于結(jié)構中疏水性烷基結(jié)構[29]被兩端的酚結(jié)構所屏蔽, 從而使化合物不易穿透生物膜進入細胞體內(nèi)進行作用。同時氫鍵供體酚羥基和氫鍵受體酰胺結(jié)構依然能與部分蛋白結(jié)合而起到抑制作用, 但是作用程度有限, 所以具有對稱酚類結(jié)構的化合物對硅藻附著的抑制效果一般。僅具有長碳鏈結(jié)構的化合物(DOLPA)對硅藻附著的抑制效果不佳, 對2種硅藻的半抑制濃度均大于20 μg/mL。分析認為與結(jié)構的極性大小有關, 極性小不易吸附在微生物膜表面。另外還與化合物長碳鏈的構象有關, 蜷曲的構象不易穿透生物膜, 反之伸展開的構象容易穿透生物膜。HNOB化合物具有靜電作用的酚羥基和酰胺結(jié)構, 可以像表面活性劑一樣先吸附于細胞膜等表面, 再通過疏水性烷基結(jié)構滲入類脂層, 破壞細胞正常的結(jié)構, 最終導致微生物死亡。所以HNOB在實驗中表現(xiàn)出較好的防污活性。

3.3 貽貝實驗

通過貽貝足絲個數(shù)和存活狀態(tài)來判斷化合物對大型污損生物的抑制和毒殺作用。3種苯酰胺類化合物對貽貝足絲和活性的影響結(jié)果如表2所示。

表2 3種苯酰胺類化合物對貽貝足絲及活性的影響Tab. 2 Effects of the three benzamide compounds on mussel byssus and activity

對照組中可以看出, 陽性組均殺死了貽貝, 空白組和陰性組貽貝均存活且有足絲生成。實驗組1中HNOB的3組平行樣在24 h后沒有足絲生成, 可以判斷其對貽貝足絲具有抑制作用。同時3個平行樣的貽貝均存活, 初步表明HNOB對貽貝沒有毒殺作用。DOLPA組貽貝均存活且生成足絲, 每組貽貝平均生成12根足絲, 對貽貝足絲的抑制效果不明顯。DHNOB樣中2#平行樣貽貝死亡, 其他兩組貽貝均存活且有足絲生成。從實驗組2看出, HNOB的3#貽貝存活且生出4根足絲, 1#貽貝死亡。結(jié)合實驗組1的情況看, 貽貝在有HNOB的海水中不會分泌足絲, 24 h后將其放入正常海水中后又會分泌足絲, 表明HNOB對貽貝足絲具有抑制效果, 且對貽貝的毒殺作用較低, 符合綠色防污劑的設計要求。DOLPA和DHNOB兩組均存活, 但DOLPA組貽貝分泌的足絲個數(shù)要少于DHNOB組。長期來看, DOLPA對貽貝的抑制作用比DHNOB好, 但遠低于HNOB防污效果。

4 結(jié)論

在這項工作中, 我們通過酯交換反應合成HNOB,DOLPA和DHNOB 3種化合物, 對其進行FTIR,1H NMR和13C NMR表征與分析, 并通過室內(nèi)硅藻附著和貽貝實驗對化合物防污性能進行測試, 根據(jù)實驗結(jié)果與化合物結(jié)構對比分析, 得到如下結(jié)論:

(1)1H NMR、13C NMR和FTIR表明成功合成3種目標化合物, 其中DOLPA兩端具有8個碳的脂肪鏈結(jié)構, DHNOB兩端具有親水性的酚羥基和能形成氫鍵的酰胺結(jié)構, 而HNOB既有酚酰胺的結(jié)構又有8個碳的脂肪鏈結(jié)構。

(2) 硅藻附著和貽貝實驗均表明HNOB防污性能好于DOLPA和DHNOB。根據(jù)Does-Response模型擬合出曲線并計算得到EC50, HNOB