王曉英 萬學(xué)鋒 任艷霞

腦膠質(zhì)瘤本身具有強破壞性、高侵襲性、進(jìn)展迅速等特點[1,2]，主要分為高級別型和低級別型，其中高級別致死率高，中位生存期方面膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人存活時間不足1年。近年研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤致死率高的主要原因是由于其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生局部和系統(tǒng)性的免疫抑制，而免疫抑制狀態(tài)下，腫瘤生長迅速，且不受免疫系統(tǒng)攻擊。而在免疫抑制過程中，腫瘤組織的微環(huán)境以及腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用[3,4]。PD-L1作為一種負(fù)性共刺激分子可以讓腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)免疫逃逸，目前臨床開始重點研究該蛋白[5-7]。CD133作為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)的重要標(biāo)志物，臨床和科研中CD68廣泛被用作腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)標(biāo)志物。故本研究分析病理分級不同的腦膠質(zhì)瘤組織中CD133、PD-L1和CD68的表達(dá)及相關(guān)性，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月至2020年6月神經(jīng)外科收治的腦膠質(zhì)瘤患者68例為研究對象，男性40例，女性28例，年齡24～68歲(中位年齡46歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：第一次確診為腦膠質(zhì)瘤者；經(jīng)手術(shù)切除治療，術(shù)后取得標(biāo)本；術(shù)前未接受放、化療；對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤、糖尿病和風(fēng)濕免疫性疾病等；臨床、隨訪資料不完整者。按照WHO在2007年制定的標(biāo)準(zhǔn)將其分為Ⅰ級和Ⅱ級(低級別膠質(zhì)瘤)和Ⅲ級和Ⅳ級(高級別膠質(zhì)瘤)，本研究低級別組34例，其中Ⅰ級9例，Ⅱ級25例；高級別組34例，其中Ⅲ級14例，Ⅳ級20例。兩組患者一般資料可比(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 小鼠抗人CD68抗體(批號：ab201973)、兔抗人PD-L1抗體(批號：ab213524)均購自Abeam公司；兔抗人CDl33抗體(產(chǎn)品編號：bs-0395R)購自北京博奧森公司；SP試劑盒(批號：KIT-9720)、DAB顯色試劑盒(批號：DAB-0031)、緩沖液等均購于上海西格生物科技有限公司。

1.2.2 檢測方法 切取每例患者3張不間斷的石蠟標(biāo)本，厚度在4 μm左右，按照說明書對其中的CDl33、PD-L1和CD68蛋白進(jìn)行免疫組化染色。在400倍的視野下尋找不間斷的3張切片的相同區(qū)域位置，然后拍照，染色結(jié)果用Image-Pro 軟件分析其光密度，從而定量分析不同病理級別的腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的CD133、PD-L1和CD68蛋白的表達(dá)情況。每張切片隨機觀察視野區(qū)域個數(shù)超過20個。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CD133、CD68和PD-L1在不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

CD133、PD-L1和CD68在高級別組腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的表達(dá)量顯著高于低級別組，差異顯著(P<0.001)。見表1。

表1 CD133、CD68和PD-L1在不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2.2 CD133、PD-L1和CD68表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病理分級的相關(guān)性

CD133、PD-L1和CD68在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與其病理分級呈正相關(guān)，見表2。

表2 CD133、PD-L1和CD68表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病理分級的相關(guān)性

3 討論

腦膠質(zhì)瘤高惡性程度，且患者預(yù)后極差，確診后采取各種措施綜合治療后，復(fù)發(fā)率仍較高[8]。隨著腫瘤病理學(xué)研究的不斷深入，Paget提出的腫瘤生長的“土壤和種子”學(xué)說[9]，這使惡性腫瘤的認(rèn)識有了飛躍式的進(jìn)步。在腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)，GSCs作為“種子”可以利用誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞可以不讓自身的免疫系統(tǒng)監(jiān)視、清除，在放化療過程中具有很強的抵抗性。GSCs被當(dāng)做腦膠質(zhì)瘤的起源細(xì)胞，有報道[10-12]表明，GSCs本身具有的逃避人體免疫監(jiān)控能力和腫瘤微環(huán)境這種作為“土壤”的PD-L及巨噬細(xì)胞等關(guān)鍵成分之間關(guān)系密切。免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及各類因子共同構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境，其細(xì)胞成分中具有大量的TAMs[13]，腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)大量的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤在TAMs中，占腫瘤細(xì)胞團(tuán)比例接近4成，遠(yuǎn)超淋巴細(xì)胞數(shù)量，說明了TAMs在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮著極為重要額作用[14,15]。B7家族的負(fù)性共刺激分子成員之一的PD-L1，可以作用于受體PD-1，從而讓腫瘤免疫逃逸產(chǎn)生作用。因此，研究腫瘤組織中PD-L1蛋白的表達(dá)及調(diào)控對于腦膠質(zhì)瘤意義重大。

在腦膠質(zhì)瘤的組織細(xì)胞當(dāng)中，同時存在GSCs、PD-L1和TAMs，但過去大量研究集中在PD-L1在TAMs和GSCs分開表達(dá)，對于它們是否在免疫逃逸中發(fā)揮作用的研究，并不多見。本研究探究了病理級別存在差異腦膠質(zhì)瘤的組織內(nèi)CDl33、PD-L1和CD68的表達(dá)及相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤的組織內(nèi)PD-L1和CD68在巨噬細(xì)胞上共同表達(dá)，即PD-L1為陽性的巨噬細(xì)胞大多和腫瘤相關(guān)，且隨病理級別上升，PD-L1和CD68蛋白水平亦上升。腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的CDl33、PD-L1和CD68 mRNA在的表達(dá)和病理分級呈正相關(guān)；高級別組中三者的表達(dá)水平較低級別組高；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤的組織細(xì)胞內(nèi)的CDl33、PD-L1、CD68表達(dá)在不同病理分級中呈正相關(guān)。提示腦膠質(zhì)瘤的惡性程度和CDl33、PD-L1和CD68的表達(dá)關(guān)系密切，且以往研究發(fā)現(xiàn)，CDl33、CD68均與PD-L1均存在一定的正相關(guān)關(guān)系。表明三者在腦膠質(zhì)瘤發(fā)展中共同發(fā)揮作用。這可能是GSCs通過誘導(dǎo)TAMs高表達(dá)PD-L1，從而讓機體的免疫監(jiān)視無法探測到，加速腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞快速生長。因此通過“種子”與“土壤”進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，從而避免膠質(zhì)瘤進(jìn)一步惡化，或可為臨床治療帶來新的思路。

綜上所述，PD-L1在膠質(zhì)瘤組織內(nèi)主要通過腫瘤微環(huán)境中的TAMs進(jìn)行表達(dá)；腦膠質(zhì)瘤的惡性程度和CDl33、PD-L1和CD68表達(dá)關(guān)系密切。