牟大超 吳沙沙 周 軼 白秀峰
目前,腫瘤的治療手段包括傳統(tǒng)手術(shù)治療、放化療、小分子抑制劑治療、單克隆抗體治療以及細(xì)胞靶向治療等[1-4]。傳統(tǒng)的手術(shù)治療不能保證病灶的完全切除,易復(fù)發(fā)[5,6];放化療會(huì)波及正常細(xì)胞,產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用[7,8];生物靶向治療存在耐藥性,且較難尋找腫瘤特異性抗原和治療靶點(diǎn)等[9,10];單一小分子藥物使用時(shí)濃度高,易產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用,同時(shí)容易產(chǎn)生耐藥性。隨著研究深入,制備多種小分子的聯(lián)合藥物,有望使各藥物分子發(fā)揮協(xié)同增加的作用,降低單一藥物使用劑量,降低毒副作用和耐藥性[11,12]。甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)是一種抗葉酸類抗腫瘤藥,通過(guò)抑制二氫葉酸還原酶,使二氫葉酸不能還原成四氫葉酸,從而導(dǎo)致DNA的合成受到抑制而阻礙腫瘤細(xì)胞的合成,達(dá)到抗腫瘤目的,但單一長(zhǎng)期使用可引起胃腸道反應(yīng)、肝損傷和腎損傷等[13,14]。匹莫齊特(Pimozide),近期報(bào)道顯示,其可通過(guò)抑制stat3和stat5磷酸化水平,達(dá)到抗腫瘤目的,但單一使用效果不佳[15-16]。本文將MTX和Pimozide聯(lián)合使用,探討不同濃度配比對(duì)人胃癌細(xì)胞系MKN45和MKN74的抑制作用。
1.1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞系MKN45和MKN74由華西醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng),本科室凍存。
1.1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640培養(yǎng)基和青霉素鏈霉素購(gòu)自Gibco公司,胎牛血清購(gòu)自阿根廷Natocor公司,CCK8檢測(cè)試劑購(gòu)自索萊寶公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與孔板設(shè)置 體外培養(yǎng)MKN45和MKN74細(xì)胞系,培養(yǎng)基為RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%新生牛血清),細(xì)胞置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后,使用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞消化完成后,加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止消化。300 g×5 min離心后,收集細(xì)胞。使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,制成單細(xì)胞懸液,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞,以每孔12000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中,每孔體積為100 μl。設(shè)置空白對(duì)照孔:僅含100 μl完全培養(yǎng)基;細(xì)胞對(duì)照孔:僅含細(xì)胞和完全培養(yǎng)基,不加藥物處理;藥物處理孔:含細(xì)胞和不同濃度藥物(藥物為單獨(dú)使用MTX、單獨(dú)使用Pimozide以及MTX和Pimozide聯(lián)合使用,藥物用DMSO溶解,配制成10 mmol/L母液,使用時(shí)用培養(yǎng)基配制成相應(yīng)濃度)。將96孔板置于二氧化碳孵箱中培養(yǎng)24 h。棄孔板中原培養(yǎng)基,加入新鮮培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基配制的不同濃度藥物溶液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h。
1.2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè) 使用CCK8檢測(cè)試劑盒,操作按說(shuō)明書所示。在96孔板各孔中加入CCK8溶液10 μl,37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1~4 h。使用酶標(biāo)儀,在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度OD值,記錄結(jié)果,計(jì)算細(xì)胞存活率。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率計(jì)算公式:細(xì)胞存活率=(A藥物處理孔-A空白對(duì)照孔)/(A細(xì)胞對(duì)照孔-A空白對(duì)照孔)。
1.2.3 藥物聯(lián)合使用協(xié)同指數(shù)計(jì)算 為了進(jìn)一步分析MTX和Pimozide的協(xié)同作用效果,使用本領(lǐng)域認(rèn)可且廣泛使用的CompuSyn軟件,對(duì)各濃度下MTX和Pimozide的協(xié)同指數(shù)進(jìn)行了計(jì)算分析,協(xié)同指數(shù)CI<1.1表示有協(xié)同增效作用。
采用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)。細(xì)胞存活率分析采用單因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,P<0.05判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
單獨(dú)使用Pimozide時(shí),Pimozide劑量(0~1 μM)太小對(duì)MKN45細(xì)胞幾乎沒(méi)有抑制效果,只有Pimozide大劑量(2~4 μM)使用才對(duì)MKN45細(xì)胞有抑制效果(存活率<70%),且隨著Pimozide濃度增加,抑制效果增加。單獨(dú)使用MTX時(shí),對(duì)MKN45細(xì)胞的抑制效果均很差(各濃度下存活率均>70%)(表1、圖1)。
圖1 單獨(dú)使用Pimozide或MTX抑制MKN45細(xì)胞的細(xì)胞存活率
Pimozide和MTX聯(lián)合使用后,可以在減小藥物使用劑量的情況下,顯著提高對(duì)MKN45細(xì)胞的抑制效果,降低毒副作用。其中,當(dāng)Pimozide濃度為4 μM,MTX濃度為0.1~20 μM時(shí),細(xì)胞活性受到十分顯著抑制,細(xì)胞存活率低于15%(表1、圖2)。
圖2 聯(lián)合使用Pimozide和MTX抑制MKN45細(xì)胞的細(xì)胞存活率
表1 不同濃度MTX或/和Pimozide作用于MKN45細(xì)胞72h的細(xì)胞存活率
使用CompuSyn軟件分析,當(dāng)MTX濃度>0.1 μM時(shí),各濃度Pimozide和MTX聯(lián)合使用對(duì)MKN45的抑制效果具有協(xié)同增效作用(表2)。
表2 MTX和Pimozide聯(lián)合藥物作用于MKN45細(xì)胞72h的聯(lián)合藥物協(xié)同指數(shù)值(CI)
單獨(dú)使用Pimozide時(shí),Pimozide劑量(1 μM)太小對(duì)MKN74細(xì)胞幾乎沒(méi)有抑制效果,只有Pimozide大劑量(2~4 μM)使用才對(duì)MKN74細(xì)胞有抑制效果(存活率<70%),隨著Pimozide濃度增加,抑制效果增加。單獨(dú)使用MTX時(shí),對(duì)MKN74細(xì)胞的抑制效果均很差(表3、圖3)。
圖3 單獨(dú)使用Pimozide或MTX抑制MKN74細(xì)胞的細(xì)胞存活率
Pimozide和MTX聯(lián)合使用后,可以在減小藥物使用劑量的情況下,顯著提高對(duì)MKN74細(xì)胞有抑制效果。即Pimozide和MTX聯(lián)合使用后既可以提高對(duì)胃癌細(xì)胞MKN74的抑制效果,又可以降低藥物使用劑量,降低毒副作用。其中,當(dāng)Pimozide濃度為4 μM,MTX濃度為0.01~20 μM時(shí),細(xì)胞活性受到十分顯著抑制,細(xì)胞存活率低于15%(表3、圖4)。
圖4 聯(lián)合使用Pimozide和MTX抑制MKN74細(xì)胞的細(xì)胞存活率
表3 不同濃度MTX或/和Pimozide作用于MKN74細(xì)胞72 h的細(xì)胞存活率
使用CompuSyn軟件分析,當(dāng)Pimozide濃度>1 μM時(shí),各濃度MTX和Pimozide聯(lián)合使用對(duì)MKN74的抑制效果具有協(xié)同增效作用(表4)。
表4 使用CompuSyn軟件計(jì)算MTX和Pimozide聯(lián)合藥物作用于MKN74細(xì)胞72h的聯(lián)合藥物協(xié)同指數(shù)值(CI)
甲氨蝶呤在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用已有很長(zhǎng)的歷史,對(duì)多種腫瘤具有抑制作用,但大劑量使用會(huì)引起骨髓抑制和肝功能異常等不良反應(yīng)[17-18]。匹莫齊特的抗腫瘤活性,最早由R Taub和M Baker報(bào)道[19],用于黑色素瘤的治療。近年來(lái),越來(lái)越多的報(bào)道顯示,匹莫齊特具有抗多種腫瘤活性[20-21]。但是,使用單一藥物治療腫瘤,需要的藥物濃度較大,會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的副作用。
將甲氨蝶呤和匹莫齊特聯(lián)合使用,對(duì)腫瘤細(xì)胞,特別是胃癌細(xì)胞MKN45以及高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞MKN74的抑制效果顯著優(yōu)于單獨(dú)使用甲氨蝶呤和匹莫齊特,并發(fā)揮了協(xié)同增效抗腫瘤以及防止腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。此外,將甲氨蝶呤和匹莫齊特聯(lián)合使用,可以減少藥物的使用劑量,降低藥物毒副作用,安全性更好。將甲氨蝶呤和匹莫齊特作為活性成分制備抗腫瘤藥物,或者將甲氨蝶呤和匹莫齊特用于制備抗腫瘤聯(lián)合用藥物,具有良好的應(yīng)用前景。