李君，梁曉

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；2.桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 桂林 541199

鴨公樹子為樟科（Lauraceae）新木姜子屬（NeolitseaMerr.）植物鴨公樹N.chuiiMerr.的干燥成熟種子，被收載于《中華本草》[1]。鴨公樹，又名沙樟、假桂皮、青膠木、欖味新木姜等，為常綠喬木，廣泛分布于福建、江西、湖南、廣東、廣西、貴州、云南等地的山谷疏林中[2]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為鴨公樹子的功效為行氣止痛、利水消腫。前期已從鴨公樹子乙酸乙酯部位和正丁醇部位分離出14 個(gè)化合物，主要是二苯乙烯類、黃酮類、小分子脂肪族類等成分[3-4]。為了進(jìn)一步闡明鴨公樹子藥材作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，更好地利用鴨公樹子植物資源，本研究以干燥處理后的鴨公樹子藥材為材料，經(jīng)過95%乙醇提取、三氯甲烷萃取，結(jié)合薄層色譜法（TLC）、Sephadex LH-20 柱色譜法及高效液相制備色譜法，對(duì)其中的生物堿類成分進(jìn)行了分離及結(jié)構(gòu)鑒定，從中共分離鑒定出9 個(gè)生物堿類化合物，分別為樟蒼堿（1）、N-甲基樟蒼堿（2）、烏藥堿（3）、波爾定堿（4）、新木姜子堿（5）、杏黃罌粟堿（6）、異紫堇定堿（7）、煙酰胺（8）、N-反式阿魏酰酪胺（9）。并對(duì)其進(jìn)行了抗炎鎮(zhèn)痛活性評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器

Photolysis-TOF MS 型高質(zhì)量質(zhì)譜儀（英國(guó)Kore公司）；AVANCE-500 型核磁共振儀（瑞典Bruker公司）；LC-8A 型高壓制備液相色譜儀（日本島津儀器公司）；X6 型熔點(diǎn)測(cè)定儀（深圳科聯(lián)儀器有限公司）；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；BPG-9030BH 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海和呈儀器制造有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)式水真空泵（鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海新諾儀器集團(tuán)有限公司）；OVP-60 型無油真空泵[陸冠森生物科技（上海）有限公司]；BSA224S 型電子天平（德國(guó)賽多利斯儀器公司）。

1.2 試藥

鴨公樹子采自湖南省邵陽(yáng)市隆回縣、湖南省邵陽(yáng)市洞口縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定為樟科新木姜子屬植物鴨公樹Neolitsea chuiiMerr.的成熟種子，其標(biāo)本（編號(hào)：YGSZ-2019-1216）保存于湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥標(biāo)本館。

制備型薄層硅膠F254（德國(guó)Merck 公司）；薄層色譜硅膠G（10～40 μm，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20 柱色譜（瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB 公司）；阿司匹林片[批號(hào)：20210524，遠(yuǎn)大醫(yī)藥（中國(guó)）有限公司]；甲醇、乙醇、三氯甲烷均為分析純（天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水為自制雙蒸水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠240 只，雌雄各半，體質(zhì)量（170±15）g，由湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0001。實(shí)驗(yàn)經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批，批準(zhǔn)號(hào)：倫審（科）2021-2-1024。

2 提取與分離

取鴨公樹子10.0 kg壓碎后，以95%乙醇加熱回流提取3 次，每次1 h。濾過，棄去藥材殘?jiān)?，合并乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味，得乙醇提取物浸膏763.6 g。將此浸膏以蒸餾水10 L 分散后，加入0.1 mol·L–1硫酸溶液，調(diào)節(jié)pH 為2～3，用三氯甲烷8 L 萃取4 次，加入0.1 mol·L–1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 為9～10，再用三氯甲烷8 L 萃取3 次，合并萃取液，減壓濃縮后得到鴨公樹子總生物堿粗提物（28.0 g）。

取總生物堿粗提物20.0 g，采用三氯甲烷-甲醇（90∶10→0∶100）梯度洗脫，以TLC 檢測(cè)洗脫液，合并相同部分，得到4個(gè)流分（Fr.1～Fr.4）。其中，F(xiàn)r.1 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，以甲醇洗脫，得到化合物8[40 mg，tR=12.4 min）、9（26 mg，tR=21.6 min）。Fr.2 經(jīng)半制備液相色譜（甲醇-水，35∶65，流速為2.0 mL·min–1）分離，得到化合物1（65 mg，tR=15.5 min）、5（28 mg，tR=26.8 min）。Fr.3 經(jīng)半制備液相色譜（甲醇-水，45∶55，流速為2.0 mL·min–1）分離，得到化合物3（24 mg，tR=19.7 min）、4（43 mg，tR=26.2 min）。Fr.4經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，以甲醇洗脫，再經(jīng)半制備型液相色譜（甲醇-水，60∶40，流速為2.0 mL·min–1）分離得到化合物2（48 mg，tR=12.2 min）、6（19 mg，tR=18.4 min）、7（31 mg，tR=29.5 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：棕黃色固體，mp 102.4～103.1 ℃。ESI-MSm/z327.4 [M+H]+。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.96(1H,s,H-11),6.77(1H,s,H-3),6.70(1H,s,H-8),4.19 (1H,dd,J=13.5,4.5 Hz,H-6a),3.83 (3H,s,2-OCH3),3.82 (3H,s,10-OCH3),3.66(1H,dd,J=13.0,6.0 Hz,H-5),3.62 (3H,s,1-OCH3),2.98 (1H,dd,J=17.0,4.5 Hz,H-4),2.87 (1H,dd,J=14.0,4.5 Hz,H-7)。13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:155.4 (C-2),148.6 (C-10),148.2 (C-9),146.7 (C-1),128.5 (C-7a),127.9 (C-3a),127.7(C-1b),124.3(C-1a),122.2 (C-11a),116.2 (C-8),113.3 (C-3),112.1(C-11),60.8(1-OCH3),56.9(2-OCH3),56.7(10-OCH3),54.8(C-6a),42.8(C-5),34.4(C-7),26.6(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5]，故鑒定化合物1 為樟蒼堿。

化合物2：棕黃色固體。ESI-MSm/z342.1[M+H]+。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.94 (1H,s,H-11),6.81 (1H,s,H-3),6.77 (1H,s,H-8),4.07 (1H,dd,J=13.5,4.5 Hz,H-6a),3.84 (3H,s,2-OCH3),3.82 (3H,s,10-OCH3),3.62 (1H,dd,J=13.0,4.5 Hz,H-5),3.61 (3H,s,1-OCH3),3.29 (1H,dd,J=17.0,6.0 Hz,H-4),3.25 (1H,dd,J=14.0,4.5 Hz,H-7),3.12 (3H,s,N-CH3)。13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:155.6 (C-2),148.7 (C-10),148.3 (C-9),146.8 (C-1),128.9 (C-7a),127.9 (C-1b),127.8 (C-3a),124.1 (C-1a),122.1 (C-11a),116.4 (C-8),113.5 (C-3),111.9(C-11),64.3 (C-6a),60.8 (1-OCH3),56.9 (10-OCH3),56.7 (2-OCH3),54.1 (C-5),42.5 (N-CH3),32.6 (C-7),27.5 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[6]，故鑒定化合物2為N-甲基樟蒼堿。

化合物3：白色粉末。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.08 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),6.72(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,5′),6.64 (1H,s,H-8),6.61(1H,s,H-5),3.79(3H,s,-OCH3),3.16～2.68(4H,m,H-3,4)。13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:156.4 (C-4′),147.3 (C-6),146.1 (C-7),130.0 (C-2′,6′),125.1(C-1′),123.4(C-8a),122.1(C-4a),116.1(C-3′,5′),112.5(C-8),109.8(C-5),56.1(C-1),54.6(-OCH3),39.1 (C-7′),38.2 (C-3),24.2 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[7]，故鑒定化合物3為烏藥堿。

化合物4：無定形粉末，與碘化鉍鉀試劑反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z360.1[M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.84(1H,s,H-11),6.70(1H,s,H-8),6.48(1H,s,H-3),3.77 (3H,s,10-OCH3),3.56 (3H,s,1-OCH3),2.92(1H,s,H-7),2.88(1H,s,H-4),2.86(1H,m,H-5),2.75 (1H,dd,J=12.0,2.0 Hz,H-6a),2.38(3H,s,N-CH3)。13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ:149.5 (C-2),146.5 (C-10),146.3 (C-9),143.0 (C-1),130.1 (C-7a),129.2 (C-3a),126.6 (C-1a),125.9 (C-1b),123.2 (C-11a),115.7 (C-8),114.7 (C-3),112.4(C-11),62.7 (C-6a),59.7 (1-OCH3),56.2 (10-OCH3),53.3 (C-5),44.2 (N-CH3),34.2 (C-7),29.0 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8]，故鑒定化合物4 為波爾定堿。

化合物5：結(jié)晶性粉末，與碘化鉍鉀試劑反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESI-MSm/z346.2[M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.84 (1H,s,H-11),6.77 (1H,s,H-8),6.53 (1H,s,H-3),3.82 (3H,s,10-OCH3),3.74 (1H,dd,J=13.2,3.6 Hz,H-6a),3.64(3H,s,1-OCH3)。13CNMR (125 MHz,DMSO-d6)δ:150.9 (C-2),147.8 (C-9),147.2(C-1),144.5(C-10),130.1(C-7a),129.8(C-3a),127.6(C-1b),126.2(C-1a),124.7(C-11a),115.8(C-8),115.5 (C-11),112.9 (C-3),60.4 (C-6a),56.6(1-OCH3),54.7 (10-OCH3),43.5 (C-5),36.5 (C-7),28.8 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9]，故鑒定化合物5為新木姜子堿。

化合物6：無色細(xì)棱柱狀結(jié)晶（丙酮），與改良碘化鉍鉀試劑反應(yīng)顯橘紅色。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ:6.94(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),6.66(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,5′),3.83 (3H,s,6-OCH3),3.74(1H,dd,J=6.5,12.0 Hz,H-1),3.57 (3H,s,7-OCH3),3.14～2.58 (6H,m,H-3,4,9),2.53 (3H,s,N-CH3)。13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ:154.9 (C-4′),147.4(C-6),146.4(C-7),131.1(C-1′),130.9(C-2′),130.3(C-6′),128.8 (C-8a),125.3 (C-4a),115.6 (C-3′),115.5 (C-5′),111.3 (C-5),111.1 (C-8),65.1 (C-1),55.9 (6-OCH3),55.7 (7-OCH3),46.2 (C-3),42.3 (NCH3),40.7(C-9a),24.8(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10]，故鑒定化合物6為杏黃罌粟堿。

化合物7：棕黃色固體。ESI-MSm/z341.8[M+H]+。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ:6.94 (1H,d,J=8.0 Hz,H-8),6.90 (1H,d,J=8.0 Hz,H-9),6.74 (1H,s,H-3),4.02 (1H,dd,J=13.5,4.5 Hz,H-6a),3.89(3H,s,10-OCH3),3.82 (3H,s,2-OCH3),3.74 (1H,dd,J=13.0,6.0 Hz,H-5a),3.66 (3H,s,1-OCH3),3.45(1H,ddd,J=13.0,12.5,4.5 Hz,H-5b),3.27 (1H,ddd,J=17.0,12.5,6.0 Hz,H-4a),3.23 (1H,dd,J=14.0,4.5 Hz,H-7a),3.13 (3H,s,N-CH3),3.08 (1H,dd,J=17.0,4.5 Hz,H-4b),2.66 (1H,dd,J=14.0,13.5 Hz,H-7b)。13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ:155.0(C-2),151.3(C-10),145.6(C-11),144.2(C-1),128.1 (C-7a),127.9 (C-3a),127.2 (C-1b),126.4 (C-1a),121.1 (C-8),120.7 (C-11a),113.4(C-9),112.8(C-3),64.6 (C-6a),60.8 (1-OCH3),57.0 (2-OCH3),56.9 (10-OCH3),53.8 (C-5),42.3 (N-CH3),34.1 (C-7),27.4(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]，故鑒定化合物7為異紫堇定堿。

化合物8：白色粉末，易溶于甲醇、丙酮。ESI-MSm/z121.2 [M–H]–。1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ:9.07(1H,d,J=1.5 Hz,H-2),8.79(1H,d,J=5.0 Hz,H-6),8.25 (1H,d,J=8.0 Hz,H-4),7.56 (1H,dd,J=8.0,5.0 Hz,H-5)。13C-NMR (125 MHz,CDCl3）δ:152.9(C-6),149.7(C-2),135.8(C-4),124.1(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物8 為煙酰胺。

化合物9：白色晶體（丙酮），易溶于甲醇。ESIMSm/z313.2 [M+H]+。1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.06(1H,d,J=1.7 Hz,H-2),6.99(1H,d,J=8.5 Hz,H-2′),6.96 (1H,dd,J=8.1,1.7 Hz,H-6),6.73 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.69 (1H,d,J=8.5 Hz,H-6′),6.62(1H,d,J=8.5 Hz,H-3′),6.34(1H,d,J=15.5 Hz,H-8),3.83(3H,s,3-OCH3),3.74(1H,d,J=15.5 Hz,H-7),3.43(1H,d,J=8.5 Hz,H-8′)。13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:166.3 (C-9),156.5 (C-4′),149.2 (C-3),148.9(C-4),140.1(C-7),131.2(C-1′),130.8(C-2′),130.2 (C-6′),128.2 (C-1),122.2 (C-6),119.1 (C-8),115.8(C-5),115.7(C-3′),115.5(C-5′),111.3(C-2),55.8 (3-OCH3),42.2 (C-8′),36.1 (C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物9 為的N-反式阿魏酰酪胺。

4 活性評(píng)價(jià)

4.1 抗炎作用

取清潔級(jí)昆明種小鼠120 只，稱體質(zhì)量，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（化合物1～9），每組10 只，雌雄各半。采用灌胃給藥方式，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予阿司匹林（0.26 g·kg–1），實(shí)驗(yàn)組分別給予相應(yīng)化合物（0.26 g·kg–1，均以0.3%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑）。連續(xù)灌胃給藥3 d，灌胃體積均為20 mL·kg–1。末次給藥30 min 后，對(duì)照組小鼠用移液槍在右耳兩面涂生理鹽水20 μL，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠右耳涂以二甲苯溶液20 μL 致炎，左耳不做處理。30 min后脫頸處死小鼠，用直徑7 mm的打孔器在左右兩耳相同部位取下耳片，采用電子天平分別稱取兩耳片的濕質(zhì)量，以兩耳質(zhì)量之差作為炎癥腫脹度觀察指標(biāo)，按照公式（1）和（2）計(jì)算耳腫脹率和耳腫脹抑制率[14-17]。

抗炎活性結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組小鼠耳腫脹率顯著提高（P<0.01），證明模型制備成功。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹（P<0.01），抗炎作用顯著；鴨公樹子中新木姜子堿表現(xiàn)出明顯的抗炎活性（P<0.01），其余生物堿類成分組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組小鼠腫脹率和腫脹抑制率見表1。

表1 鴨公樹子中生物堿化學(xué)成分對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹率和腫脹抑制率的影響（,n=10）%

表1 鴨公樹子中生物堿化學(xué)成分對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹率和腫脹抑制率的影響（,n=10）%

注：除對(duì)照組和模型組外，其余各組給藥劑量均為0.26 g·kg–1；與對(duì)照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；表2同。

4.2 鎮(zhèn)痛作用

取清潔級(jí)昆明種小鼠120 只，動(dòng)物分組、給藥劑量同4.1 項(xiàng)下。末次給藥1 h 后，對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水0.01 mL·g–1，其余各組小鼠腹腔注射1%冰醋酸溶液0.01 mL·g–1。注射后，立即放入觀察籠中，觀察并記錄小鼠扭體潛伏期和20 min 內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)。扭體的觀察標(biāo)準(zhǔn)：腹腔內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高[18-20]。按照公式（3）計(jì)算藥物鎮(zhèn)痛率。

鎮(zhèn)痛活性結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組小鼠扭體次數(shù)顯著增加（P<0.001），證明模型制備成功。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林組能抑制醋酸引起的小鼠疼痛反應(yīng)，減少小鼠扭體次數(shù)（P<0.01）；鴨公樹子中新木姜子堿明顯延遲初次疼痛時(shí)間，具有鎮(zhèn)痛作用（P<0.01），其余生物堿成分則均不能延遲初次疼痛時(shí)間，沒有表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用。各組小鼠扭體次數(shù)和扭體抑制率見表2。

表2 鴨公樹子中生物堿化學(xué)成分對(duì)醋酸致小鼠扭體次數(shù)和扭體抑制率的影響（,n=10）

表2 鴨公樹子中生物堿化學(xué)成分對(duì)醋酸致小鼠扭體次數(shù)和扭體抑制率的影響（,n=10）

5 討論

本研究從鴨公樹子提取物中分離得到9 個(gè)生物堿類化合物，其中7個(gè)為四氫異喹啉類化合物、1個(gè)為哌啶類化合物、1 個(gè)為酰胺類化合物。目前已從樟科新木姜子屬植物中分離得到的生物堿有多種類型，按生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為四氫異喹啉類生物堿、吡啶類生物堿、有機(jī)胺類生物堿、芐基異喹啉類生物堿、阿撲芬型生物堿。研究中所分離鑒定的鴨公樹子中的化學(xué)成分與該屬植物化學(xué)成分的基本特征相符[21-27]，這些生物堿成分均為首次從鴨公樹子中分離獲得。

在抗炎鎮(zhèn)痛的活性實(shí)驗(yàn)中，分別采用二甲苯所致小鼠耳廓腫脹法研究鴨公樹子中生物堿成分的消炎作用，小鼠醋酸扭體法研究鴨公樹子中生物堿成分的鎮(zhèn)痛作用。二甲苯涂在小鼠耳廓上面導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增大、組織液滲透增多，產(chǎn)生紅腫現(xiàn)象。在小鼠扭體實(shí)驗(yàn)中，對(duì)小鼠腹腔注射醋酸引起急性腹膜炎。藥理活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鴨公樹子中新木姜子堿表現(xiàn)出明顯的抗炎鎮(zhèn)痛活性，與以往網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究推測(cè)新木姜子堿作用于多巴胺能和5-羥色胺能突觸通路的蛋白靶點(diǎn)發(fā)揮行氣止痛一致[28-29]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴨公樹子具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，可結(jié)合傳統(tǒng)行氣止痛的功效開發(fā)單一制劑，用于疼痛癥狀的治療。