楊姍姍，王儀，劉紫祺，邵慧慧，高微微

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193

西洋參Panax quinquefoliusL.為五加科人參屬多年生藥用植物，其干燥根具有抗疲勞、提高免疫力的功能[1-2]。西洋參栽培過程中病害及連作障礙現(xiàn)象嚴重，已成為制約其種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。其中，由茄病鐮刀菌（Fusarium solani）引發(fā)的根腐病是西洋參的主要根部病害，嚴重影響西洋參藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]；該病原菌可在土壤中存活很多年，也是導致連作障礙發(fā)生的重要因素之一。目前生產(chǎn)上以化學防治為主的農(nóng)藥施用導致殘留超標和抗藥性等一系列問題。研究根腐病與西洋參之間的互作關(guān)系、解析西洋參的抗病機制、選育抗病能力強的品種是解決西洋參根腐病最為經(jīng)濟有效的策略。

轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗病原菌的過程中發(fā)揮重要作用。GRAS 蛋白是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛存在于各高等植物中[4-6]，在植物根發(fā)育、側(cè)枝形成、光信號轉(zhuǎn)導、赤霉素（gibberellin，GA）合成等方面發(fā)揮著重要作用[7-9]。GRAS 蛋白可分為SCL9、SCR、DELLA、SHR、LAS 等亞家族，其中DELLA 蛋白是GA 信號系統(tǒng)的一個重要的負調(diào)控蛋白。GA是植物主要激素之一，不僅可促進植物細胞生長發(fā)育，其在植物抗病方面也發(fā)揮著重要的作用[10-11]。與GA 合成相關(guān)的DELLA 蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育及抵御各種脅迫的過程中均發(fā)揮著不可替代的重要作用[12]。然而，目前針對DELLA基因的研究多集中在種子萌發(fā)、莖伸長、根形成等[13-15]植物生長發(fā)育的作用方面，雖然有報道DELLA基因可提高擬南芥對丁香假單胞菌DC3000的敏感性[16]，但該基因?qū)χ参锟共》磻挠绊憟蟮篮苌佟?/p>

為探究DELLA蛋白是否參與西洋參抗病原菌侵染過程，本研究在對西洋參進行轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，經(jīng)分析比對獲得可響應茉莉酸誘導的F01_transcript_39804 轉(zhuǎn)錄本。以此為模板設(shè)計引物，以西洋參互補脫氧核糖核酸（cDNA）為模板，擴增獲得西洋參DELLA基因，對其編碼蛋白理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育樹等進行生物信息學分析，并對其表達部位及F.solani侵染下的表達模式進行分析，為通過基因工程手段提高西洋參抗根腐病提供參考。

1 材料

1.1 植物

2 年生西洋參根采自山東威海文登傳福參業(yè)有限公司小英種植基地，于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所溫室25 ℃、26 h 光照/8 h 黑暗條件下栽培。取西洋參根、莖、葉組織于液氮中速凍并于–80 ℃冰箱保存，用于檢測基因組織特異性。西洋參接 種F.solani后第0、1、3、5、8、13 天取樣，液氮速凍并于–80 ℃冰箱保存，用于檢測F.solani對寄主西洋參基因表達的影響。

1.2 菌株與載體

F.solani（4171 菌株）為本實驗室分離鑒定并保藏；大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；pYBA1132 植物表達載體為中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所王國梁研究員實驗室饋贈。

1.3 試劑

Q5?超保真DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶和質(zhì)粒小提試劑盒購自北京江晨文軒生物科技有限責任公司；Clone Express?ⅡOne Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Taq酶和StarPrep快速DNA 膠回收試劑盒購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；dNTP Mixture、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、Recombinant RNase Inhibitor、Recombinant DNase Ⅰ（RNase-free）和TB Green?Premix ExTaq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司；Trizol 購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 儀器

Veriti DX 型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems 公司）；DYCP-31DN 型核酸電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；CFX96型實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）儀（美國伯樂公司）；ND-1000 型超微量分光光度計（美國NanoDrop公司）。

2 方法

2.1 總RNA的提取及cDNA的合成

取西洋參各部分組織于液氮中迅速研磨，利用Trizol試劑法提取西洋參根、莖、葉等不同部位，以及F.solani侵染不同時間后的西洋參總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，用超微量分光光度計測定其濃度和純度，并利用反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)成單鏈cDNA。

2.2 PqDELLA1基因的克隆及載體的構(gòu)建

2.2.1PqDELLA1基因的克隆 設(shè)計引物（1132-PqDELLA1-F：5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATCCAT GGTTACAAAGAGAGATCGCG-3'；1132-PqDELLA1-R：5'-GGGCCCCCCCTCGAGGTCGACTGGATCCTCG ACGGCGA-3'），以西洋參cDNA 為模板，擴增PqDELLA1序列。按如下比例配制反應體系：ddH2O 28.5 μL，5×Q5 Buffer 10 μL，dNTP mix（2.5 mmol·L–1）4 μL，1132-PqDELLA1-F、1132-PqDELLA1-R各2.5μL，Q5酶0.5μL，模板2μL；反應條件：98 ℃，30 s；98 ℃，10 s；60 ℃，30 s；72 ℃，1 min 30 s；35個循環(huán)；72 ℃，2 min；4 ℃，10 min。參照StarPrep 快速DNA 膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物。

2.2.2 pYBA1132 載體的酶切 提取pYBA1132 質(zhì)粒，并用BamHI/SalI 進行雙酶切，酶切體系及條件如下：pYBA1132 1μg，BamHI-HF、SalI-HF各1μL，10×CutSmartBuffer 5 μL，加ddH2O 至50 μL；酶切條件為37 ℃，4 h。

2.2.3 pYBA1132載體與PqDELLA1基因的連接 采用無縫克隆技術(shù)（in-fusion cloning）[17-18]將PqDELLA1基因連接到pYBA1132 植物表達載體上。連接體系如下：5×CEⅡBuffer 4 μL，雙酶切后的pYBA1132 50～200 ng，PqDELLA120～200 ng，Exnase?Ⅱ2μL，加ddH2O 至20 μL；連接條件為37 ℃，30 min，冰浴5 min。

2.2.4 轉(zhuǎn)化及測序 轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)，篩選陽性克隆，由北京六合華大基因科技有限公司測序。

2.3 PqDELLA1基因生物信息學分析

利用BioXM 2.6 分析PqDELLA1基因編碼的氨基酸序列；利用NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析PqDELLA1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）進行氨基酸理化性質(zhì)的分析；利 用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測PqDELLA1蛋白信號肽；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測PqDELLA1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；利用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢索PqDELLA1同源蛋白；利用DNAMAN 進行同源序列比對；通過MEGA 6.0 使 用Maximum Likelihood（RaxML）方法并將bootstrap 設(shè)為1000 次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用PSORT（http://psort1.hgc.jp/form.html）預 測PqDELLA1蛋白的亞細胞定位；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）和 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件對PqDELLA1蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)進行分析。

2.4 qPCR分析

利用qPCR儀分析PqDELLA1基因在西洋參不同組織部位及F.solani侵染不同時間下的表達模式。利用Primer Premier 5.0 設(shè)計PqDELLA1熒光定量特異引物（5'-CACCGCTATTATCCCTTCCG-3'/5'-TTG CTCTCAAATCATACTCCGAA-3'），按 照SYBR?Premix EXTaq?Ⅱ試劑盒說明書操作。反應條件如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40 個循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。以西洋參持家基因之一PqGAPDH（5'-CAAAGACTGGA GAGGTGGAAGAG-3'/5'-TGCAGGTAGCACTTTAC CAACAG-3'）為內(nèi)參，利用2–ΔΔCt法計算PqDELLA1相對表達量。所有樣品設(shè)置3 個技術(shù)重復和生物學重復，利用t檢驗進行顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 PqDELLA1基因的克隆

以cDNA 為模板，以1132-PqDELLA1-F/1132-PqDELLA1-R 為引物，擴增得到大小為1700 bp左右的單一特異條帶（圖1），利用無縫克隆技術(shù)獲得重組載體pYBA1132-PqDELLA1，測序結(jié)果表明PqDELLA1基因的CDS 序列長1743 bp（此處擴增未加終止密碼子，大小為1740 bp），與本實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中序列一致。

圖1 PqDELLA1基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

3.2 PqDELLA1基因生物信息學分析

3.2.1 序列分析 通過BioXM 2.6 軟件分析獲得PqDELLA1基因編碼的氨基酸序列（圖2A）。通過ProtParam 在線軟件預測分析PqDELLA1 蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果表明該蛋白（C2795H4409N777O874S32）由580 個氨基酸組成，負電荷氨基酸75個，正電荷氨基酸51個，其相對分子質(zhì)量為63 910，理論等電點為5.01，不穩(wěn)定系數(shù)為48.70，為不穩(wěn)定蛋白，平均親水系數(shù)為–0.249。Blastp 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PqDELLA1 蛋白包含DELLA（41～103）及GRAS 保守結(jié)構(gòu)域（216～573）（圖2B）。

圖2 PqDELLA1蛋白的氨基酸序列及保守結(jié)構(gòu)域分析

使用SignalP 5.0 軟件對PqDELLA1 進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PqDELLA1 蛋白不含信號肽，為非分泌性蛋白（圖3A）。使用TMHMM 在線預測結(jié)果表明PqDELLA1 不含跨膜區(qū)（圖3B），說明PqDELLA1不是跨膜蛋白。以上預測結(jié)果說明PqDELLA1 符合其作為一個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達的基本特性。

圖3 PqDELLA1蛋白信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

3.2.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析 用SOPMA 對PqDELLA1 蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果表明α螺旋是構(gòu)成西洋參PqDELLA1 蛋白結(jié)構(gòu)的重要組成部分，占比為45.69%；其次是無規(guī)卷曲和β轉(zhuǎn)角，占比分別為37.41%和5.69%（圖4A）。用SWISS-MODEL 對PqDELLA1 蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致，含有大量的α螺旋、無則卷曲和β轉(zhuǎn)角。PqDELLA1 蛋白的39～103 個氨基酸的三級結(jié)構(gòu)與2zsh.1.B 模板相似度為64.52%，覆蓋度為16%，為DELLA 蛋白GAI結(jié)構(gòu)域，是DELLA 被GA受體識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)（圖4B）；PqDELLA1 蛋白的208～574 個氨基酸的三級結(jié)構(gòu)與5hyz.1.A 模板相似度為34.07%，覆蓋度為62%，為GRAS 轉(zhuǎn)錄因子家族所含結(jié)構(gòu)域（圖4C）。由此可推測PqDELLA1 蛋白為含有DELLA 結(jié)構(gòu)域的GRAS轉(zhuǎn)錄因子，具有該蛋白家族相似的生理調(diào)控功能。PSORT 在線軟件分析顯示，PqDELLA1 蛋白最可能定位于植物細胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子的基本特征（圖4D）。

圖4 PqDELLA1蛋白結(jié)構(gòu)及亞細胞定位分析

3.2.3 同源性及系統(tǒng)進化分析 將西洋參PqDELLA1與擬南芥DELLA、番茄SlDELLA、葡萄VvGAI1、水稻OsSLR1[19-21]的核苷酸及氨基酸序列進行系統(tǒng)進化及同源性分析，結(jié)果顯示，西洋參PqDELLA1 與番茄SlDELLA 在核苷酸水平及氨基酸水平上均聚為一支，相似度最高，核苷酸相似度為64.89%（圖5A），氨基酸相似度為67.93%（圖5B）。

3.3 PqDELLA1基因組織表達特征分析

采用qPCR方法對西洋參根、莖、葉各組織進行PqDELLA1基因表達差異分析。結(jié)果表明，PqDELLA1在西洋參不同組織中均有表達，葉片中表達量最高，其次為莖，根中最少，莖和葉中的表達量與根中相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），分別增加83.17%和138.12%（圖6）。以上結(jié)果說明PqDELLA1主要在葉中的表達量最高，遠高于其他組織。

圖6 PqDELLA1基因的組織特異性表達（,n=3）

3.4 F.solani對PqDELLA1基因表達的影響

F.solani侵染后西洋參中PqDELLA1基因的表達呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，以F.solani侵染后0 d為參照，侵染后3 d基因表達量與其相比開始差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），5 d 基因表達量達到最高，是0 d 該基因表達量的2.26 倍，8 d 后基因表達量恢復到正常水平（圖7）。以上結(jié)果說明PqDELLA1基因響應F.solani的侵染，西洋參PqDELLA1基因可能參與其抗病反應。

圖7 PqDELLA1基因在F.solani侵染下的表達模式（,n=3）

4 討論

DELLA蛋白是GA信號通路的一種重要抑制子，通過與不同的調(diào)控蛋白發(fā)生相互作用參與信號傳導，從而抑制植物生長[19]。例如，葡萄DELLA基因突變導致葡萄節(jié)間縮短從而表現(xiàn)出極度矮化現(xiàn)象[22]。已報道人參中存在的DELLA 亞家族基因（PgGRAS44-04、PgGRAS48-01、PgGRAS50-01和PgGRAS68-01），參與GA信號途徑，響應GA處理且不同GA濃度條件下表達量存在差異[23]。另外，DELLA 蛋白也與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用參與植物激素的信號調(diào)節(jié)，在植物生命活動中發(fā)揮重要作用，近年來有少量其參與植物抗病的報道。例如，擬南芥DELLA蛋白能夠參與水楊酸信號途徑，進而調(diào)控植物對病原菌的抗性[24]。Navarro等[16]研究發(fā)現(xiàn)AtDELLA蛋白通過平衡茉莉酸和水楊酸信號來控制植物的免疫反應，使得植物對不同致病菌的抗性發(fā)生改變，從而提高擬南芥對丁香假單胞菌DC3000 的敏感性。另外，李小林[25]通過煙草瞬時表達發(fā)現(xiàn)，MeDELLA蛋白可提高木薯胼胝質(zhì)的累積和相關(guān)抗病基因的表達，從而增強木薯對枯萎病菌的抗性。

本研究首次從西洋參中獲得DELLA 蛋白基因PqDELLA1，并對其進行了生物信息學及表達模式分析。組織表達特異性分析發(fā)現(xiàn)，PqDELLA1基因表達量在葉片中最高，其次為莖，根中最少，提示西洋參不同部位均發(fā)揮重要作用。面對F.solani的侵染，西洋參PqDELLA1基因表達模式出現(xiàn)較為有趣的現(xiàn)象，其表達在接種F.solani5 d內(nèi)持續(xù)升高后下降。也進一步說明植物與病原的協(xié)同進化，植物產(chǎn)生各種抗病蛋白抵抗真菌的侵染，與此同時，真菌也會分泌效應蛋白來抑制抗性基因的表達，這是一個此起彼伏的動態(tài)變化過程[26]。因此，筆者推測在西洋參與F.solani互作初期，為了抵抗F.solani的侵染，西洋參PqDELLA1基因表達量上升，但是此時F.solani為了抵抗西洋參的防御反應分泌多種效應蛋白，其中某些效應蛋白可抑制西洋參免疫反應，影響PqDELLA1基因的表達，因此其表達量下降。這與之前報道的擬南芥和木薯中DELLA基因參與植物的抗病反應是一致的[16,25]。本研究發(fā)現(xiàn)了西洋參中PqDELLA1基因可能參與抗F.solani，這為解析西洋參抗根腐病的分子機制提供了參考。