劉 娜 李 品 王齊霞 李明明 黃淑紅 黨寧寧

1濰坊醫(yī)學(xué)院，濰坊，261000；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟南市中心醫(yī)院，濟南，251003；3山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新中心，濟南，250117；4山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟南，250117；5山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟南，250021

轉(zhuǎn)移性黑素瘤的預(yù)后很差，五年生存率<25%[1]，直到近年來才出現(xiàn)有限的治療選擇[2]?；蚪M測序結(jié)果顯示，黑素瘤比其他實體腫瘤具有更高的突變性[3]。BRAF激酶編碼基因突變占黑素瘤發(fā)生的40%～60%，且最常見的致癌突變基因為V600E[3]。維莫非尼是一種競爭性激酶抑制劑，對具有V600E等突變的BRAF激酶具有活性，它通過與突變BRAF的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合來發(fā)揮其功能；而達帕非尼是一種可逆的ATP競爭性激酶抑制劑，靶向MAPK途徑。二者均可以有效抑制V600E突變的BRAF蛋白[4]。盡管延長黑素瘤患者無進展生存期和總生存期的方法已經(jīng)出現(xiàn)，但有效率卻存在很大差異?；颊邔σ种苿┊a(chǎn)生耐藥性可能是造成這些差異的原因[7]，而有研究顯示，人類Eph受體家族可能與這種耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。

人類Eph受體家族目前有14個成員，它們構(gòu)成最大的受體酪氨酸激酶家族[8]。這些Eph受體及其ephrin配體參與了多種發(fā)育功能，包括脊椎動物的后腦發(fā)育、組織發(fā)育和血管生成[9]。過表達Eph受體及其Ephrin配體的各種成員在癌癥中經(jīng)常被報道。相比之下，另一種激酶缺陷受體EphB6在黑素瘤[11]、乳腺癌和前列腺癌[12]等最具侵襲性的細胞系中表達下調(diào)，這表明EphB6與其他家族成員相比具有獨特的作用。

本研究將揭示過表達EphB6和BRAF抑制劑(BRAFi)在侵襲性黑素瘤細胞增殖和侵襲中的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析 GSE141484是7個與BRAFi治療前后相匹配的黑素瘤組織的基因表達譜。GSE22838是對6例BRAF野生型和5例BRAF突變型黑素瘤患者的基因表達分析?；趌og2(Fold變化)>1或<-1，及雙尾T檢驗P值<0.05，對差異表達基因進行篩選。維莫非尼的316個基因和達帕非尼的330個基因從Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 從ATCC(馬納薩斯，VA，USA)獲得375和1205Lu細胞(BRAFV600E突變，無NRAS突變)，用含10%胎牛血清和1% Pen/Strep的DMEM高糖(HyCloneSH30243.01)在37℃和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將EphB6cDNA克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中，用Lipo2000試劑轉(zhuǎn)染細胞。維莫非尼(10μM)和達帕非尼(1μM)購自Selleck.cn。

1.3 蛋白免疫印跡分析 使用含有混合蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細胞。裂解液在冰下孵育10分鐘，接著在4℃，12 000 g的條件下離心10 min。采用BCA法測定每個樣品的蛋白濃度。樣品裝載在SDS-PAGE上。電泳后，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在含5%脫脂牛奶的TBST中封閉膜1 h，然后與一抗 (抗EphB6、PA5-115191、Anti-GAPDH、ab8245、Abcam) 孵育過夜。通過ECL Plus系統(tǒng) (Tanon，中國) 觀察免疫反應(yīng)條帶。

1.4 CCK-8分析 分別將2個過表達EphB6的細胞接種于96孔板中，每孔接種2×103個細胞并培養(yǎng)24 h。加入10 μM維莫非尼或1 μM達帕非尼，培養(yǎng)24 h。隨后，去除培養(yǎng)基，加入10%的CCK-8試劑孵育2 h。使用自動平板閱讀器讀取每孔在450 nm處的吸光度(OD)值，并計算孵育0 h和48 h時OD值的倍數(shù)變化。

1.5 克隆形成分析 分別將過表達EphB6的細胞以1×103的數(shù)量接種于6孔板的每孔中培養(yǎng)2周。隨后，去除培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細胞，然后用0.2%結(jié)晶紫染色并計數(shù)。

1.6 Transwell分析 在饑餓4 h后，將過表達EphB6的細胞以1×105的數(shù)量接種于200 μL無血清培養(yǎng)基的基質(zhì)膠涂層膜上孵育12 h。在培養(yǎng)基中加入10 μM維莫非尼或1 μM達帕非尼。用PBS洗滌粘附在上部的細胞，然后用4%多聚甲醛固定穿過膜的細胞，最后用0.2%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機5個視野計數(shù)。

1.7 傷口愈合試驗 使用EphB6過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染24 h后在6孔板中培養(yǎng)成融合的單層。使用10 μL的無菌移液管尖端在單層上畫一個線性傷口，用PBS洗滌去除細胞碎片。隨后，將細胞在含有10 μM維莫非尼或1 μM達帕非尼的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。在0和24 h拍攝損傷單層，計算傷口愈合面積。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)用GraphPadPrism7進行分析。兩組間的統(tǒng)計學(xué)差異采用雙重t檢驗進行評估。*P<0.05為顯著。

2 結(jié)果

2.1 BRAF突變型黑素瘤中EphB6的鑒定 維莫非尼和達帕非尼的靶向基因從Pubchem數(shù)據(jù)庫中下載，獲得304個共同靶基因(圖1a、1b)。然后，分析GSE141484和GSE22838芯片中的差異表達基因，利用藥物靶向基因和疾病差異表達基因的交叉，基于log2(Fold變化)>1或<-1，及雙尾T檢驗P值<0.05，得到EphB6(圖1c、1d)。

1a、1b：Pubchem數(shù)據(jù)庫中維莫非尼和達帕非尼的結(jié)構(gòu)分子式；1c：維莫非尼和達帕非尼靶向基因從Pubchem數(shù)據(jù)庫下載；1d：來自GSE141484和GSE22838芯片的藥物靶向基因和疾病差異表達基因的交叉點，獲得EphB6

2.2 過表達EphB6可抑制A375和1205Lu細胞的活力和運動性 EphB6在A375和1205Lu細胞中外源性表達如圖2a所示。過表達EphB6對A375和1205Lu細胞活力和運動能力的影響，如圖(2b～2d)所示。過表達EphB6顯著抑制了A375和1205Lu細胞在450 nm處的OD值和克隆形成，說明EphB6抑制了A375和1205Lu細胞的增殖和生長。此外，EphB6的過表達也通過基質(zhì)凝膠顯著阻礙了A375和1205Lu細胞的穿透速度和傷口愈合，如圖(2e～2h)所示。結(jié)果表明，過表達EphB6可以抑制A375和1205Lu細胞的侵襲和遷移能力。

將pcDNA3.1-EphB6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A375和1205Lu細胞中，(2a)檢測EphB6、(2b)增殖、(2c、2d)克隆形成、(2e、2g)侵襲和(2g、2h)遷移的蛋白表達。*P<0.05。

2.3 EphB6過表達促進維莫非尼和達帕非尼對A375和1205Lu細胞活力和運動能力的抑制作用 隨后，我們檢測了EphB6過表達與維莫非尼或達帕非尼的協(xié)同作用。與單獨使用維莫非尼(或達帕非尼)治療相比，過表達EphB6和維莫非尼(或達帕非尼)治療顯著降低了450 nm處的OD值(圖3a、3b)。通過A375和1205Lu細胞的transwell細胞數(shù)以及創(chuàng)面愈合速度(圖3c～3f、4a～4d)。這些結(jié)果表明，過表達EphB6可能促進維莫非尼和達帕非尼對BRAFV600E突變型黑素瘤細胞惡性增殖和侵襲的抑制作用。

將pcDNA3.1-EphB6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A375和1205Lu細胞，10 μM維莫非尼或1 μM達帕非尼處理的細胞24 h，檢測(a、b)增殖和(c～f)侵襲。*P<0.05

將pcDNA3.1-EphB6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A375和1205Lu細胞、10 μM維莫非尼或1 μM達帕非尼處理的細胞24 h，通過傷口愈合試驗檢測細胞遷移。*P<0.05

3 討論

人類Eph受體是由14個成員組成的最大的受體酪氨酸激酶家族，根據(jù)其配體的序列同源性和對其的親和力，將成員分為A型和B型。人類的ephrin家族由8個已知的成員組成，根據(jù)序列同源性和與Eph受體相互作用的類型，它們同樣分為A類和B類。EphA類由成員A1-A8和A10成員組成，與5個ephrin分子(A1-A5)混合；而EphB類由EphB1-B4和B6組成，主要與三個ephrinB配體eprinB1-B3結(jié)合。ephrins除了作為配體還可以在細胞中傳遞信號，但是對它們的具體途徑的研究很少[9]。

先前的研究表明，黑素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)疾病的進展與EphB6基因表達降低之間存在顯著的相關(guān)[11]。在本研究中，我們首先利用該數(shù)據(jù)庫和芯片鑒定了EphB6的表達與維莫非尼和達帕非尼的腫瘤抑制機制相關(guān)，以及黑素瘤細胞中EphB6的表達與黑素瘤細胞中BRAFV600E突變相關(guān)。隨后，體外細胞實驗證實了過表達EphB6對BRAFV600E突變體黑素瘤細胞的增殖和運動有顯著的抑制作用。此外，Caleb的研究還揭示了EphB6作為癌細胞轉(zhuǎn)移抑制劑的作用[13]。黑素瘤細胞利用其部分祖胚胎神經(jīng)嵴遷移過程來促進侵襲[6]。Caleb發(fā)現(xiàn)，過表達EphB6迫使轉(zhuǎn)移性黑素瘤細胞偏離了在雞胚胎移植模型中觀察到的典型遷移模式[13]。此外，過表達EphB6的黑素瘤細胞在絨毛膜尿囊膜轉(zhuǎn)移試驗中的轉(zhuǎn)移潛能顯著降低[13]。

除了低表達外，在黑素瘤中還發(fā)現(xiàn)了編碼EphB6的基因突變。新西蘭是世界上黑素瘤發(fā)病率最高的國家。瓊斯等人的研究對466例新西蘭黑素瘤患者的轉(zhuǎn)移性黑素瘤樣本進行測序分析，發(fā)現(xiàn)北島黑素瘤中EphB6G404S突變的發(fā)病率為7.8%(26/466，P=0.0002) ，而南島黑素瘤樣本的發(fā)病率為0%[15]。另一項研究涵蓋了77例日本原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤樣本，其中21例樣本(27%)檢測到BRAFV600E突變，6例樣本(7.79%)檢測到EphB6G404S突變。EphB6G404S突變涉及到纖維連接蛋白結(jié)合域的絲氨酸取代甘氨酸，然而，結(jié)構(gòu)-功能分析程序預(yù)測該突變是良性的[17]。這些結(jié)果表明EphB6在黑素瘤的轉(zhuǎn)移進展中發(fā)揮了重要作用。

最重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)了過表達EphB6與維莫非尼和達帕非尼治療對抑制黑素瘤的協(xié)同作用。通過以上結(jié)果推測，EphB6類似物與BRAFi的聯(lián)合作用有利于黑素瘤的臨床治療。

總而言之，過表達EphB6可以顯著抑制黑素瘤的轉(zhuǎn)移進展，有利于黑素瘤的BRAFi治療。