馬立文 曾 霓 駱 丹

1南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院皮膚性病科，江蘇南京，210008;2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，江蘇南京，210008

原發(fā)性局限性皮膚淀粉樣變(primary localized cutaneous amyloidosis，PLCA)是一種以皮膚真皮淺層淀粉樣物質(zhì)為特征的慢性瘙癢性皮膚病，本病只涉及皮膚一般不累及內(nèi)臟系統(tǒng)[1]。臨床上一般分為斑疹型、丘疹型和結(jié)節(jié)型，其他特殊類型包括色素異常性淀粉樣變(amyloidosis cutis dyschromica，ACD)、皮膚異色病樣淀粉樣變、大皰性淀粉樣變和肛門、骶部淀粉樣變[2]。色素異常性淀粉樣變發(fā)病率低，以瘙癢為癥狀的彌漫性的色素沉著伴色素減退斑為特征，一般不伴有皮膚萎縮和毛細(xì)血管擴(kuò)張。大多數(shù)的PLCA都是散發(fā)病例，家族聚集現(xiàn)象主要被報(bào)道在南美洲、東南亞及中國(guó)，并且這些家族多表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳[3]。通過遺傳連鎖分析和候選基因篩查確定本病遺傳易感性和兩個(gè)基因突變相關(guān)：OSMR 和IL31RA基因。到目前為止有十余個(gè)OSMR基因突變和2個(gè)IL31RA突變被報(bào)道[4-9]。我們檢測(cè)了一例位于中國(guó)南部的ACD家系。

1 臨床資料

本家系兩代人中共有5例患者(圖1)，表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳。先證者為發(fā)育正常的56歲女性，該患者約20年前背部出現(xiàn)斑點(diǎn)狀色素沉著和色素減退斑并伴有瘙癢，后其四肢亦出現(xiàn)類似皮損，無(wú)苔蘚樣丘疹，否認(rèn)光敏現(xiàn)象及水皰史，系統(tǒng)檢查未見明顯異常。先證者的姐姐、弟弟、外甥及女兒均有類似皮損，均為青春期后發(fā)病，因先證者的父母已經(jīng)去世。故不能求證他們是否也患此病。該家系均為非近親結(jié)婚。

圖1 ACD家系圖

2 實(shí)驗(yàn)方法和儀器

2.1 DNA提取 經(jīng)該家系成員知情同意并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后抽取該家系5例患者的外周血各約5 mL并用EDTA抗凝，以無(wú)皮膚病的健康人DNA為對(duì)照。采用杭州寶賽生物科技有限公司血液抽提試劑盒抽提基因組DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)Genebank上序列信息(OSMR基因依據(jù)NT_006576，IL31RA基因依據(jù)NM_139017)使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)基因引物。0SMR基因第12號(hào)外顯子引物序列：上游5’-TAAGAGACAAGAACTCACCC-3’，下游5’-GAAGTAGTCCAGAAATCCCA-3’，13號(hào)外顯子引物序列：上游5’-CTCTGCCTCTTGGGTTCA-3’，下游5’-TTGGGTATGGTGCTGACA-3’，14號(hào)外顯子引物序列：上游5’-AGAGCTGGCTATGGTTCTTC-3’，下游5’-AGCTGGTGGTGTTTCAGATG-3’，15號(hào)外顯子引物序列：上游5’-GGTGGTGCTGAGTTAACAAG-3’，下游5’-AATTGTCTCAAGGGCCACTG-3’，IL31RA基因第12號(hào)外顯子引物序列：上游5’-TGGAAGCACAGGTTCCAATG-3’，下游5’-CCAGGAAGGTTGGTGAACAG-3’。采用的PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL。使用ABI 9700PCR擴(kuò)增儀，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸7 min，最后4℃保存。50 μL PCR產(chǎn)物中加入溴酚藍(lán)加樣緩沖液5 μL，混勻后將全部55 μL樣品分別加在2個(gè)加樣孔中，1.5%瓊脂糖凝膠 ，100 V電泳100 min，EB染色，紫外線燈下切取膠帶。杭州寶賽生物科技有限公司純化試劑盒純化。

2.3 Sanger基因測(cè)序 PCR產(chǎn)物分離純化后應(yīng)用Big Dye Direct Sanger Sequencing Kit在ABI3500基因測(cè)序儀進(jìn)行直接雙向測(cè)序，此項(xiàng)工作由杭州寶賽生物科技有限公司完成。測(cè)序分析結(jié)果與Genbank中人類OSMR基因的12～15號(hào)外顯子及IL31RA基因第12號(hào)外顯子的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

3 結(jié)果

3.1 皮膚科及病理檢查 患者的背部、上臂及大腿可見彌漫性的色素沉著伴色素減退斑，以背部及上肢為重(圖2a、2b)，未見明顯紅斑、丘疹、水皰、皮膚萎縮及毛細(xì)血管擴(kuò)張，系統(tǒng)檢查未見明顯異常。取自先證者的上臂組織可見真皮乳頭層有團(tuán)塊狀嗜酸性物質(zhì)沉積，結(jié)晶紫染色陽(yáng)性(圖2c)，提示為淀粉樣物質(zhì)沉積。根據(jù)該患者臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)檢查結(jié)果診斷為ACD。

2a、2b:背部及上肢彌漫性色素沉著斑及色素減退斑；2c:真皮乳頭狀區(qū)無(wú)定形嗜酸性腫塊(HE,×100)；2d:結(jié)晶紫染色陽(yáng)性(HE,×100)

3.2 臨床表現(xiàn) 該家系成員中Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅲ1及Ⅲ2可見上臂、大腿或背部可見彌漫性的色素沉著伴色素減退斑，均未見紅斑、丘疹、水皰、皮膚萎縮及毛細(xì)血管擴(kuò)張，Ⅱ2伴有瘙癢，其他人無(wú)明顯瘙癢，且均無(wú)光敏及水泡史。該家系所有患者臨床表現(xiàn)均符合ACD，并表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳。

3.3 測(cè)序結(jié)果 通過基因測(cè)序及后續(xù)比對(duì)并未發(fā)現(xiàn)本家系中成員存在OSMR和IL31RA基因突變。通過檢查我們發(fā)現(xiàn)cSNP，患者Ⅲ2存在SNP:rs2278329, c.1657G→A(圖3a)；患者Ⅱ3、Ⅱ4和Ⅲ1存在SNP: rs161704, c.1586G→A(圖3b)。

圖3 ACD家族中OSMR和IL31RA基因突變分析

4 討論

ACD是原發(fā)性皮膚淀粉樣變的一種罕見類型，由日本的Morishma在1970年首次報(bào)道 ，ACD具有以下特點(diǎn)：(1)皮損為彌漫分布的色素沉著伴色素減退斑；(2)輕度或不伴癢感；(3)青春期前發(fā)??；(4)組織病理見真皮乳頭層淀粉樣樣物質(zhì)沉積[10,11]。原發(fā)性皮膚淀粉樣變病中的另一亞型皮膚異色病樣淀粉樣變(poikilodenna—like cutancous amyloidosis，PCA)與ACD表現(xiàn)相似。Ogino等[12]在1977年將PCA分為兩類：一般型和PCA綜合征。一般型PCA的主要特征：有皮膚異色病典型皮損，有苔蘚樣丘疹，多有光敏性，于日曬后皮損加重，不具有水皰和掌跖角化，也不伴有系統(tǒng)受累，組織病理學(xué)改變可見真皮乳頭內(nèi)有淀粉樣物質(zhì)沉著，一般成年后發(fā)病。PCA綜合征的主要特征：具有皮膚異色病樣損害，苔蘚樣丘疹，組織病理檢查可見真皮層淀粉樣物質(zhì)沉積，多具有光敏性，可出現(xiàn)水皰或掌跖角化病等，一般身材矮小，發(fā)病年齡較早。由此可見兩者臨床表現(xiàn)有較多重疊，且病理檢查不能鑒別，并且亦有國(guó)外學(xué)者認(rèn)為ACD是皮膚異色病樣淀粉樣變的亞型[13]。因此這兩種PLCA亞型之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。本家系患者符合ACD的特點(diǎn)，因此本家系患者診斷為ACD。但是本家系患者均為青春期后發(fā)病更為少見，國(guó)外有學(xué)者曾報(bào)道一例青春期后發(fā)病的ACD[14]。另外本病需與先天性皮膚異色病、著色性干皮病、血管萎縮性皮膚異色病、皺褶部網(wǎng)狀色素沉著癥、遺傳性泛發(fā)性色素異常等具有皮膚異色病樣改變的疾病相鑒別，可通過組織病理及結(jié)晶紫或剛果紅特殊染色進(jìn)行明確。

既往研究通過定位候選克隆的方法發(fā)現(xiàn)OSMR基因和IL31RA基因和PLCA發(fā)病相關(guān)，這兩種基因都屬于IL-6受體基因家族。OSMR基因編碼抑瘤素M受體β(oncostatin M receptor-beta，OSMRβ)，OSMRβ是OSM II型受體和IL31受體兩種細(xì)胞因子的組成成分[8,9]。OSM II型受體包括OSMRβ和gp130[15]，IL31RA基因編碼IL31受體α，后者與OSMRβ結(jié)合組成IL-31受體。既往報(bào)道的突變都位于OSMRβ和IL-31RA的FNIII結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)NIII結(jié)構(gòu)域在受體的二聚化及后續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用，所以本區(qū)域的突變導(dǎo)致Jak/STAT、MAPK及 PI3K/Akt信號(hào)通路中OSM或IL-31配體與受體結(jié)合后信號(hào)不能正常傳導(dǎo)[4]。體外研究中通過去除或替換FNIII結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)氨基酸證實(shí)了這個(gè)家族受體在受體二聚化中的關(guān)鍵作用[16]。中國(guó)學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)了OSMR突變導(dǎo)致OSM/OSMRβ/STAT5/KLF7軸的失調(diào)可能導(dǎo)致PLCA[17]。Arita等發(fā)現(xiàn)用OSM及IL-31刺激體外培養(yǎng)伴有OSMR突變的PLCA家族的角質(zhì)形成細(xì)胞，經(jīng)過OSM刺激后Jak/STAT、MAPK及PI3K/Akt 信號(hào)通路的活性減弱程度為65%～90%，IL-31刺激后活性減弱100%?，F(xiàn)在研究認(rèn)為OSM在炎癥刺激中維持痛覺并利于發(fā)現(xiàn)外來(lái)的有害刺激[18]。敲除OSM后的小鼠對(duì)于急性熱、化學(xué)、機(jī)械及內(nèi)臟痛等各種刺激的反應(yīng)減弱或消失[19]。OSM還可以促使角質(zhì)形成細(xì)胞遷移及表皮增殖[20]，推測(cè)可能和PLCA的角化過度及棘層肥厚有關(guān)。IL-31在皮膚瘙癢中起著重要作用[21]，Dillon[22]發(fā)現(xiàn)小鼠的淋巴細(xì)胞過表達(dá)IL-31會(huì)誘發(fā)瘙癢及皮膚病，結(jié)節(jié)型癢疹中有著較高水平的IL-31表達(dá)[23]，IL-31可以激活STAT3信號(hào)通路并通過IL-31RA調(diào)節(jié)可能和細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白[24]。因此IL31RA基因突變可能和PLCA中的瘙癢產(chǎn)生有關(guān)。由此可推測(cè)OSMR基因和IL31RA基因的突變可能通過影響皮膚相應(yīng)的信號(hào)通路而導(dǎo)致PLCA的發(fā)生。

目前在OSMR基因中發(fā)現(xiàn)的十余種PLCA致病突變，在IL31RA基因中發(fā)現(xiàn)了2種PLCA致病突變。其中p.Pro694Leu和p.Gly513Asp為高頻突變位點(diǎn)，并且有家族史的PLCA患者中OSMR基因突變率明顯高于無(wú)家族史患者[25]這些突變集中在OSMR基因的12-15號(hào)外顯子及IL31RA基因的12號(hào)外顯子，所以我們檢測(cè)了本家系中的這些外顯子，但是并沒有檢測(cè)到突變基因，可能和樣本量少或存在其他基因突變位點(diǎn)有關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。不過亦有國(guó)內(nèi)學(xué)者林楊楊[26]及國(guó)外學(xué)者Sakuma[24]也曾有ACD家系中沒有發(fā)現(xiàn)基因突變的報(bào)道。另外有學(xué)者[27]在ACD患者中發(fā)現(xiàn)存在GPNMB基因突變，與黑素小體形成、自噬、吞噬、組織修復(fù)和炎癥負(fù)性調(diào)節(jié)有關(guān)的GPNMB的缺失可能和ACD的發(fā)病有關(guān)，近期馮婉婷等[28]亦發(fā)現(xiàn)GPNMB基因在ACD患者中存在突變，為ACD致病基因的研究提供了新的方向，但是其具體致病機(jī)制尚不清楚[29]。另外，在本家系中的OSMR基因的12～15號(hào)外顯子及IL31RA基因的12號(hào)外顯子中檢測(cè)到兩處SNP，這兩處SNP也分別在兩個(gè)國(guó)內(nèi)家系中被檢測(cè)出[6,30]。但是其在PLCA的發(fā)病中是否發(fā)揮作用尚不清楚。

總之，PLCA的病因存在遺傳異質(zhì)性，OSMR、IL31RA和GPNMB基因在PLCA的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，OSMR基因突變可能和PLCA的角化過度及棘層肥厚有關(guān)，IL31RA基因突變可能和PLCA瘙癢有關(guān)，GPNMB基因可能和色素異常有關(guān)。另外ACD是否有特定的基因突變位點(diǎn)以及SNP在PLCA的發(fā)病中是否起作用也有待進(jìn)一步研究。