梁家榕，楊 煥，寸勇丹，王麗歡，李儀杰，葉 斌

云南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是導(dǎo)致慢性腎臟損傷［1］、代謝綜合征［2］、痛風(fēng)［3］、高血壓［4］等疾病的重要危險(xiǎn)因素，而嘌呤代謝異常［5］和尿酸排泄［6］不足所導(dǎo)致的血尿酸升高是其發(fā)病基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著富含嘌呤食物攝入量的逐漸增加，我國(guó)HUA的發(fā)病率逐年增高［7］。研究指出，截至2017年底中國(guó)HUA確診病例已達(dá)到1.7億例，其中女性發(fā)病率為7.9%，男性發(fā)病率為19.4%［8］。目前臨床治療HUA主要采用別嘌醇、非布司他、苯溴馬龍等藥物控制，雖有一定效果，但存在誘發(fā)痛風(fēng)急性癥狀、損傷肝腎組織和停藥易復(fù)發(fā)等副作用［9］。因此，尋找一種副作用小且療效顯著的治療方法一直是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。近年來(lái)，“運(yùn)動(dòng)是良醫(yī)”的觀念已深入人心［10］，科學(xué)合理的運(yùn)動(dòng)可以有效預(yù)防疾病、提高生活質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)研究顯示運(yùn)動(dòng)療法可以治療代謝性疾病［11-12］。臨床研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)可以起到增加脂肪代謝、降低血尿酸等作用［13-14］。目前關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)可以改善HUA患者血尿酸水平的機(jī)制研究主要集中于調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2［ATP-binding cassette superfamily G（White）member 2，ABCG2］［15］，但ABCG2是通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟排泄尿酸，還是促進(jìn)腎臟尿酸重吸收尚不明確。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（glucose transporter 9，GLUT-9）作為腎臟組織中廣泛表達(dá)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員之一，在尿酸（uric acid，UA）的重吸收過(guò)程中具有不可或缺的作用［16］。本研究嘗試通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證有氧運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟尿酸重吸收以達(dá)到降低HUA患者血尿酸的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，6～8周齡，初始體質(zhì)量200～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SYXK（滇）K2017-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。每籠4只，自由飲食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃，濕度50%～60%，人工光照12 h∶12 h明暗交替（8∶00—20∶00），更換墊料1次/2 d。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理原則，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：R-062021006）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

氧嗪酸鉀（上海源葉生物科技有限公司，S17112）；尿酸（uric acid，UA）試劑盒、肌酐（creatinine，Cre）試劑盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（南京建成科技有限公司，貨號(hào)：C012-2-1、C011-2-1、C013-2-1）；大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0047R1）；Caspase-1、IL-1β、GLUT-9抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：22915-1-AP、16806-1-AP、26486-1-AP）；4%多聚甲醛溶液（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1101）；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Hettich科學(xué)儀器有限公司，Mikro185型）；-80℃超低溫冰箱（中國(guó)海爾集團(tuán)公司，DW-86L828J型）；氣體麻醉機(jī)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，ZS-MV-IDV型）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（瑞士Tccan有限公司，SPARK10M型）；熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，ChemiScope 6000 pro型）；冰凍切片機(jī)（北京萊比信儀器有限公司，MEV型）；倒置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)（上海尼康儀器有限公司，Ti-S型）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠，JD-PT型）；實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)（重慶華創(chuàng)水處理工程有限公司，GYJ1-10L-S型）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 將24只雄性SD大鼠編號(hào)，采用Excel生成隨機(jī)數(shù)字表（1～8），任意選擇隨機(jī)數(shù)字表中的一個(gè)數(shù)字作為起始點(diǎn)并對(duì)應(yīng)大鼠編號(hào)1，從左到右、自上而下分別對(duì)應(yīng)1～24號(hào)大鼠。用隨機(jī)數(shù)字除以3所得到的余數(shù)以確定每只大鼠的分組，余數(shù)0、1、2分別對(duì)應(yīng)對(duì)照組、模型組和有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組（運(yùn)動(dòng)組），每組8只。

每天9∶00，對(duì)照組按照劑量2 g/（kg·d）蒸餾水灌胃；模型組、運(yùn)動(dòng)組采用氧嗪酸鉀（oxonic aid potassium salt，OAPS）灌胃造模，劑量2 g/（kg·d），連續(xù)灌胃造模10 d，第10天灌胃結(jié)束后1 h，大鼠眼眶后靜脈叢取血檢測(cè)血UA含量，若模型組、運(yùn)動(dòng)組血UA濃度比對(duì)照組血UA濃度明顯升高（P＜0.05），則表示HUA大鼠模型造模成功［17］。

1.3.2 干預(yù)方法

1.3.2.1 對(duì)照組 第11天起，對(duì)照組改為隔天9∶00蒸餾水灌胃。不限制飲食及飲水，鼠籠中自由運(yùn)動(dòng)，不進(jìn)行其他干預(yù)，共持續(xù)3周。

1.3.2.2 模型組 第11天起，模型組改為隔天9∶00 OAPS灌胃以維持干預(yù)期間持續(xù)高尿酸狀態(tài)，劑量為2 g/（kg·d），不限制飲食及飲水，鼠籠中自由運(yùn)動(dòng)，不進(jìn)行其他干預(yù)，共持續(xù)3周。

1.3.2.3 運(yùn)動(dòng)組 第11天起，運(yùn)動(dòng)組改為隔天9∶00 OAPS灌胃以維持干預(yù)期間持續(xù)高尿酸狀態(tài)，劑量為2 g/（kg·d）。每天10∶00將其放入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物跑臺(tái)中進(jìn)行有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，速度12 m/min，20 min/次，1次/d，每周訓(xùn)練6 d，休息1 d，持續(xù)3周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 腎臟病理學(xué)改變 處理后的大鼠，仰臥位放置于解剖臺(tái)上，打開(kāi)腹腔摘取腎臟組織，剝?nèi)ツI臟組織被膜，左腎放入凍存管中，于-80℃冰箱冷凍保存；右腎經(jīng)4%多聚甲醛固定，樣本固定狀態(tài)良好后，分別將樣本放入80%、90%、95%、100%不同濃度乙醇中脫水2 h，脫水后的組織浸入蠟塊包埋，將含有組織的蠟塊放入切片機(jī)中，調(diào)整切片厚度15μm。蠟帶平鋪在載玻片上后放入恒溫烘箱內(nèi)脫去并熔化組織間隙的石蠟。制備好的石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟后，采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylineosin staining，HE）進(jìn)行染色。首先，將脫蠟后的切片放入100%、90%、80%、70%不同濃度乙醇浸泡5 min，蘇木精染色5 min后，5%乙酸分化1 min，伊紅染色1 min，再進(jìn)行70%、80%、90%、100%乙醇清洗10 s，二甲苯浸泡1min后通風(fēng)處風(fēng)干5 min，封片，顯微鏡（×400）下拍照，觀察腎臟組織腎小管及腎小球結(jié)構(gòu)變化。

1.4.2 腎臟功能檢測(cè) 3組末次干預(yù)結(jié)束后1 h，采用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉過(guò)量處死所有大鼠，待大鼠死亡后，仰臥位放置于解剖臺(tái)上，打開(kāi)胸腔暴露心臟，采用10 mL一次性注射器從大鼠心尖部快速抽取約5 mL心尖血，室溫下靜置1 h，于離心機(jī)上離心（3 500 r/min，20 min，-4℃），取上層血清，用于檢測(cè)UA、肌酐（creatinine，Cre）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）等腎臟功能指標(biāo)。將UA、Cre和BUN試劑盒從冰箱中取出在室溫環(huán)境下放置20 min；將所有血清樣本及標(biāo)準(zhǔn)品加入離心管中；按照說(shuō)明書(shū)步驟操作，在酶標(biāo)儀690 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度。

1.4.3 血清、腎臟炎性因子含量 將5 mL大鼠心尖血液放入低溫高速離心機(jī)中，3 500 r/min，4℃，離心20 min，將離心出的血清轉(zhuǎn)移至新的離心管-80℃冷凍保存。準(zhǔn)確稱(chēng)取腎臟組織質(zhì)量，按照1∶9比例加入9倍腎臟組織體積的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），放入高速低溫自動(dòng)研磨儀中研磨2 min，制備成10%勻漿液，3 500 r/min，離心10 min，取上清液測(cè)定。將ELISA試劑盒從冰箱中取出放置于室溫下20 min；加樣后將酶標(biāo)板放置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min；洗板5次后每孔加入酶標(biāo)試劑50μL；再次37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min；每孔加入顯色液A、B各50μL；避光37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min；每孔加入終止液50μL在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度，根據(jù)各濃度標(biāo)準(zhǔn)品所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出公式并將各孔吸光度值代入公式計(jì)算出每個(gè)樣本中白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的含量。

1.4.4 腎臟組織蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測(cè)腎臟組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）、IL-1β和GLUT-9的表達(dá)。每個(gè)樣本（約0.03 g）中加入700μL細(xì)胞裂解液，冰上操作研磨5 min，離心后取上清，并進(jìn)行蛋白定量；加入Marker及蛋白樣本；80 V電壓電泳30 min后轉(zhuǎn)為120 V電泳1 h，剪裁大小適合聚偏氟乙烯（Poly vinylidene fluoride，PVDF）膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，300 mA電流轉(zhuǎn)膜1 h。棄去膠塊，裁剪出相應(yīng)蛋白分子量所在的條帶，用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。TBST緩沖液洗膜3次，5 min/次，配置抗Caspase-1、IL-1β和GLUT-9抗體（1∶500）進(jìn)行孵育，過(guò)夜。次日，一抗回收，TBST緩沖液洗膜，二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，配置ECL底物發(fā)光液。采用ChemiScope 6000 pro成像分析系統(tǒng)曝光掃描，將檢測(cè)得出的目標(biāo)條帶及內(nèi)參條帶灰度值進(jìn)行比較得出比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Graphpad Prism 7.04軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組腎臟組織病理變化

HE染色病理分析結(jié)果顯示，對(duì)照組腎臟組織未見(jiàn)明顯病理改變；模型組腎臟組織被膜不完整，腎小球變形萎縮，腎小管排列紊亂，上皮細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化，腎小管間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，可見(jiàn)核固縮、崩解和碎裂，血管周?chē)w維組織增生，見(jiàn)細(xì)胞核呈長(zhǎng)梭形或長(zhǎng)橢圓形的成纖維細(xì)胞增多；運(yùn)動(dòng)組腎臟組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯減少，腎小管結(jié)構(gòu)較為完整，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)空泡化等病理改變明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 3組腎臟組織病理變化圖（×400）Figure 1 Pathological changesof kidney tissues in three groups(×400)

2.2 3組血清UA、Cre、BUN含量比較

與對(duì)照組比較，模型組、運(yùn)動(dòng)組血清UA、BUN和Cre水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組血清UA、BUN和Cre水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組血清UA、BUN、Cre含量比較（±s） μmol/LTable1 Comparison of serum UA，BUN，and Cre contents in three groups（±s） μmol/L

表1 3組血清UA、BUN、Cre含量比較（±s） μmol/LTable1 Comparison of serum UA，BUN，and Cre contents in three groups（±s） μmol/L

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the Contorl group,1)P＜0.05;compared with the Model group,2)P＜0.05.

組別對(duì)照組模型組運(yùn)動(dòng)組n8 8 8血清UA濃度108.17±14.79 355.44±52.901）267.52±64.441）2）血清BUN濃度20.97±1.78 40.87±2.321）32.19±2.041）2）血清Cre濃度38.97±6.81 68.85±8.191）57.35±8.271）2）

2.3 3組血清及腎臟IL-1β含量比較

與對(duì)照組比較，模型組、運(yùn)動(dòng)組大鼠血清和腎臟中IL-1β的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組大鼠血清和腎臟組織中IL-1β明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組血清及腎臟IL-1β含量比較（±s）Table2 Comparison of IL-1βcontent of serum and renal in three groups（±s）

表2 3組血清及腎臟IL-1β含量比較（±s）Table2 Comparison of IL-1βcontent of serum and renal in three groups（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the Contorl group,1)P＜0.05;compared with the Model group,2)P＜0.05.

組別對(duì)照組模型組運(yùn)動(dòng)組n 8 8 8血清IL-1β含量/（ng/L）16.39±1.71 31.32±1.731）28.12±3.091）2）腎臟組織IL-1β含量/（ng/g）0.14±0.04 0.28±0.041）0.21±0.041）2）

2.4 3組Caspase-1、IL-1β、GLUT-9蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，模型組、運(yùn)動(dòng)組腎臟組織中Caspase-1、IL-1β和GLUT-9的蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組大鼠腎臟組織中Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

表3 3組Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白表達(dá)比較（±s）Table 3 Comparison of caspase-1，IL-1βand GLUT-9 protein expression in three groups（±s）

表3 3組Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白表達(dá)比較（±s）Table 3 Comparison of caspase-1，IL-1βand GLUT-9 protein expression in three groups（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the Contorl group,1)P＜0.05;compared with the Model group,2)P＜0.05.

組別對(duì)照組模型組運(yùn)動(dòng)組n 8 8 8 Caspase-1蛋白1.00±0.00 1.77±0.251）1.40±0.071）2）IL-1β蛋白1.00±0.00 1.53±0.141）1.25±0.161）2）GLUT-9蛋白1.00±0.00 1.70±0.211）1.29±0.231）2）

圖2 3組Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白電泳圖Figure 2 Protein electrophoresisof Caspase-1,IL-1βand GLUT-9 in three groups

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組血清UA、Cre、BUN、IL-1β含量均出現(xiàn)明顯降低。這提示，有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以降低OAPS誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型大鼠尿酸和炎癥水平，改善腎臟損傷。此外，結(jié)果顯示，與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組Caspase-1、IL-1β、GLUT-9蛋白表達(dá)明顯降低，這提示有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以下調(diào)Caspase-1、IL-1β和GLUT-9蛋白表達(dá)，促進(jìn)尿酸的重吸收并減輕HUA大鼠腎臟的炎癥反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)腎臟保護(hù)作用。這可能與以下因素有關(guān)：①HUA患者體內(nèi)血UA濃度長(zhǎng)期處于較高的水平，而UA主要由腎臟排泄，UA排泄不足會(huì)導(dǎo)致腎臟損傷，而有氧運(yùn)動(dòng)可以加速血液循環(huán)，促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，加速HUA患者體內(nèi)UA排泄，改善腎臟功能［17-18］。這與SUN等［14，19-20］研究發(fā)現(xiàn)12周的有氧訓(xùn)練可有效降低慢性病患者血尿酸、血糖等生化指標(biāo)的結(jié)果一致。②炎癥反應(yīng)是HUA腎臟損傷的關(guān)鍵病理過(guò)程，HUA患者體內(nèi)可析出UA晶體，而該晶體可激活含NLR家族PYRIN域蛋白3（recombinant NLR family，pyrin domain containing protein 3，NLRP3）-IL-1β信號(hào)通路以及Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）-核因子κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）-Caspase-1信號(hào)通路，參與炎癥反應(yīng)，使患者體內(nèi)炎性因子累積，加重腎臟損傷［21-23］，甚至可能導(dǎo)致腎臟衰竭。有氧跑臺(tái)訓(xùn)練可以降低HUA患者體內(nèi)UA水平，抑制Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)，減輕腎臟炎癥反應(yīng)［23-25］。③GLUT-9轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要存在于近曲小管的頂端和基底外側(cè)膜上，是維持體內(nèi)尿酸穩(wěn)態(tài)主要的調(diào)節(jié)因子［15，26-27］，人體內(nèi)UA清除與GLUT-9特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)。有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以降低GLUT-9轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，促進(jìn)患者體內(nèi)尿酸重吸收，降低患者腎臟炎癥水平，從而改善腎臟功能。這提示，有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善HUA模型大鼠腎臟功能的具體機(jī)制可能與抑制GLUT-9蛋白表達(dá)有關(guān)。這與LIU等［28-29］研究結(jié)果相似。

4 小 結(jié)

有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以降低OAPS誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型大鼠UA水平，減輕腎臟炎性反應(yīng)，改善腎臟功能。但本研究仍存在一些不足之處，如未就有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練抑制GLUT-9表達(dá)的具體機(jī)制進(jìn)行探討；未就GLUT-9與其他可能影響尿酸排泄因素（如有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等）的協(xié)同作用進(jìn)行深入探討。