朱思行，嚴世蕓，徐 燕，秦 嫣，陳麗云*，賈美君*

1上海中醫(yī)藥大學科技人文研究院，上海 201203；2上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；3上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071

心力衰竭（heart failure，HF）是心室舒張或收縮功能受損，以動脈缺血和/或靜脈淤血為主要特征的一組臨床綜合征，常常是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導致的，是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿［1］，常見于各種心臟疾病的危重期或晚期階段。近年來，HF的患病率、病死率和再住院率居高不下［2］，嚴重危害人們的身心健康。細胞凋亡是各種生物體內(nèi)較常見的細胞死亡方式，心肌細胞數(shù)量減少是導致心肌功能障礙的決定性因素［3］。PI3K/Akt信號通路對細胞生長、合成、維持、凋亡等方面都起著重要的作用，研究表明，通過對PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)，減緩心肌細胞的凋亡進程是控制HF的有效途徑［4-5］。

HF屬于中醫(yī)“心水”“心痹”“心悸”等范疇，其病機關(guān)鍵為陽虛不化、水飲內(nèi)停、痰濁瘀阻等，溫陽利水是HF的主要治法之一［6］。中醫(yī)藥在心臟治療和康復方面療效顯著［7］，有其獨特優(yōu)勢。嚴氏強心飲是國醫(yī)大師嚴世蕓教授創(chuàng)制的治療HF的經(jīng)驗方和基礎方，具有補益心腎、溫陽利水的作用。前期臨床研究證明，嚴氏強心飲能夠改善HF患者的臨床癥狀，提高其生活質(zhì)量［8-9］。但其具體作用機制尚不完全清楚?；诖耍狙芯繑M構(gòu)建阿霉素誘導的HF大鼠模型，觀察嚴氏強心飲對HF大鼠的干預效果，并探討其作用機制是否與PI3K/Akt信號通路的調(diào)控有關(guān)，為嚴氏強心飲的后續(xù)臨床應用提供新的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量約200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK2019-0001）。適應性喂養(yǎng)2周后，按體質(zhì)量由高到低進行編號，采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、嚴氏強心飲低劑量組、嚴氏強心飲中劑量組、嚴氏強心飲高劑量組和培哚普利組，每組10只。

1.2 實驗藥物

實驗藥物為嚴氏強心飲水煎液。嚴氏強心飲（制附子12 g，茯苓15 g，豬苓15 g，白術(shù)12 g，白芍12 g，淫羊藿20 g，補骨脂12 g，鹿角9 g）采用傳統(tǒng)方法水煎并水浴濃縮，分別配制成含生藥0.432 5、0.865、1.73 g/mL的提取液。所用中藥均購自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中藥房。

1.3 主要試劑與設備

1.3.1 主要試劑 阿霉素（阿拉丁控股集團有限公司，A183027）；培哚普利（MedChemExpress公司，HY-B0130）；異氟烷（上海玉研科技有限公司，S10010533）；BNP ELISA試劑盒（CUSABIO公司，CSB-E07972r）；TUNEL試劑盒（Roche公司，116848 17910）；DAPI試劑盒（Sigma公司，D9542）；PI3K抗體（Abcam公司，ab191606）；Akt抗體（4060T）、Caspase-9抗體（9507s）、Caspase-3抗體（9664T）均購自CST公司；Bax抗體（ab32503）、Bcl-2抗體（ab59348）均購自Abcam公司。

1.3.2 實驗設備 超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（VisualSonics公司，型號：Vevo2100）；激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，型號：TCSSPE）；電泳儀（BIORAD公司，型號：165-8000）。

1.4 模型制備及干預方法

在避光條件下，用0.9%NaCl溶液將阿霉素粉針配成濃度1 mg/mL的溶液（避光），培哚普利配成濃度0.4 mg/mL的溶液。參照相關(guān)文獻方法［10］，除正常組外，其余各組大鼠每周按2 mg/（kg·d）的劑量給予尾靜脈注射阿霉素溶液進行造模，共注射6周；正常組尾靜脈注射等容積0.9%NaCl溶液。同時，嚴氏強心飲低、中、高劑量組分別給予低、中、高劑量嚴氏強心飲灌胃［11］，各組含生藥分別為4.325、8.65、17.3 g/（kg·d）；培哚普利組予培哚普利溶液灌胃，劑量為4 mg/（kg·d）。灌胃劑量以10 mL/（kg·d）計算，正常組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠心臟超聲檢測 末次給藥1 d后，將大鼠麻醉及心臟部位脫毛處理后，采用超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（圖像深度調(diào)為2 cm，頻率為21 MHz）對大鼠進行M型超聲心動圖檢測。主要測量指標包括左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension diastole，LVIDd）及左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension systole，LVIDs）。

1.5.2 大鼠血清B型鈉尿肽含量檢測 心臟超聲檢查完畢后，對大鼠進行腹主動脈采血。血液靜置2 h后離心（4℃，3 000 r/min，10 min）。利用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清B型鈉尿肽（B-typenatriuretic peptide，BNP）含量。操作步驟均嚴格按試劑盒說明書進行，分別設標準孔、空白孔、待測樣品孔，每孔加入相應的試劑100μL，封板后置37℃溫育2 h后，每孔先后加入100μL生物素抗體、100μL HRPavidin、90μL TMB，并置37℃孵育，避光顯色后加入終止液終止反應，測量各孔的光密度值（optical density，OD）。

1.5.3 心肌組織病理學檢測 用異氟烷麻醉大鼠后，在其膈肌處剪一橫行切口，充分暴露胸腔，分離心包后迅速摘取大鼠心臟，用4℃克氏液沖洗干凈后置于4℃克氏液中，于顯微鏡下快速分離主動脈和上、下腔靜脈以及肺動脈、肺靜脈，并用濾紙吸干表面水分。切取一部分左室心肌組織置入脫水盒內(nèi)，用自動組織脫水機常規(guī)梯度脫水、透明、浸蠟后進行人工石蠟包埋，用石蠟切片機切片。將處理好的切片用4%多聚甲醛處理（室溫）30 min后，置于二甲苯中脫蠟2次，5 min/次；再置于無水乙醇中浸泡5 min，95%乙醇中浸泡5 min，70%乙醇中浸泡5 min；然后用0.5%Txiton X-100處理（室溫）5 min后，加入配置好的TUNEL標記液，37℃避光孵育60 min，加入DAPI染色液，孵育5 min；最后用抗熒光淬滅封片液封片，待干后用激光共聚焦顯微鏡，調(diào)至×200倍鏡下觀察心肌細胞凋亡情況并拍照，采用Image J軟件計算心肌細胞凋亡指數(shù)。

心肌細胞凋亡指數(shù)＝凋亡心肌細胞數(shù)/心肌總細胞數(shù)×100%

1.5.4 PI3K/Akt/Caspase-9信號通路蛋白表達水平及凋亡因子檢測 將待測的大鼠左室心肌組織放置于培養(yǎng)皿中，加入1×RIPA 100μL的裂解液，待充分溶解后提取蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。取15μg總蛋白進行凝膠電泳（電壓分別為80、120 V），再通過半干轉(zhuǎn)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間為90 min；用含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h后，孵于1∶1 000稀釋好的一抗，4℃過夜。洗膜后加入以1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h后，將膜放入發(fā)光成像儀中，滴加發(fā)光試劑曝光。以β-actin為內(nèi)參，檢測PI3K、Akt、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表達。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊用校正t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 6組大鼠存活情況

在造模及給藥過程中，共有7只接受阿霉素注射的大鼠死亡，其中模型組、嚴氏強心飲低劑量組、嚴氏強心飲中劑量組、嚴氏強心飲高劑量組和培哚普利組分別死亡2、1、1、1、2只。最終納入實驗研究大鼠正常組、模型組、嚴氏強心飲低劑量組、嚴氏強心飲中劑量組、嚴氏強心飲高劑量組和培哚普利組分別為10、8、9、9、9、8只。

2.2 6組心臟超聲檢測結(jié)果比較

M模式下大鼠心臟超聲結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組左室前壁運動波形不明顯，接近直線運動，且LVEF、LVFS明顯下降（P＜0.05），LVIDd、LVIDs明顯升高（P＜0.05），左室明顯擴大，收縮能力減弱，提示HF模型復制成功。給予不同劑量嚴氏強心飲干預后，嚴氏強心飲低、中、高劑量組左室前壁運動波形的幅度較模型組均有不同程度的增長，且隨著給藥濃度升高，LVEF、LVFS逐漸升高（P＜0.05），LVIDd僅在嚴氏強心飲中劑量組降低（P＜0.05）。與模型組比較，LVIDs在嚴氏強心飲中、高劑量組均明顯降低（P＜0.05），嚴氏強心飲中劑量組降低最明顯（P＜0.05）。與嚴氏強心飲中劑量組比較，嚴氏強心飲高劑量組LVIDd、LVIDs差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

2.3 6組血清BNP含量比較

與正常組比較，模型組BNP含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，嚴氏強心飲低、中、高劑量組BNP含量均明顯降低，且隨著給藥濃度的升高，BNP含量呈下降趨勢（P＜0.05）。見表2。

圖1 6組大鼠心臟超聲檢測圖Figure 1 Cardiac ultrasound patterns in six groups

表1 6組心臟超聲檢測指標比較（±s）Table 1 Comparison of cardiac ultrasound in six groups（±s）

表1 6組心臟超聲檢測指標比較（±s）Table 1 Comparison of cardiac ultrasound in six groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴氏強心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴氏強心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the mediumdose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴氏強心飲低劑量組嚴氏強心飲中劑量組嚴氏強心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8 LVEF/%84.28±1.76 30.07±0.781）35.19±1.162）40.99±1.22）3）48.83±2.372）3）4）68.75±1.372）LVFS/%58.97±5.81 16.65±2.981）18.6±1.88 33.57±11.212）3）30.41±6.752）3）4）39.7±1.022）LVIDd/mm 184.13±47.07 380.82±48.271）406.59±101.79 248.11±28.482）3）329.58±17.86 278.07±37.072）LVIDs/mm 48.84±28.45 255.95±49.841）253.73±50.56 100.61±36.342）3）145.98±29.972）87.25±14.142）

表2 6組大鼠血清BNP含量比較（±s） pg/mLTable 2 Comparison of serum BNP content in six groups（±s） pg/mL

表2 6組大鼠血清BNP含量比較（±s） pg/mLTable 2 Comparison of serum BNP content in six groups（±s） pg/mL

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴氏強心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴氏強心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the medium dose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴氏強心飲低劑量組嚴氏強心飲中劑量組嚴氏強心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8 BNP 172.36±9.01 348.02±11.991）313.55±9.602）272.55±9.652）3）207.06±10.492）3）4）183.08±8.672）

2.4 6組心肌組織病理學檢測結(jié)果比較

心肌組織細胞由DAPI＋TUNEL雙染色后，兩者圖像經(jīng)軟件融合后得到merge圖片，其中陽性凋亡細胞核呈綠色熒光。圖像中的心肌細胞凋亡免疫熒光結(jié)果顯示：正常組細胞基本沒有凋亡，幾乎檢測不到陽性信號；經(jīng)阿霉素造模后，模型組大鼠心肌細胞凋亡較正常組明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，培哚普利組細胞凋亡數(shù)最少（P＜0.05），隨著嚴氏強心飲濃度的升高，其細胞凋亡數(shù)量呈下降趨勢（P＜0.05）。見表3、圖2。

表3 6組心肌細胞凋亡情況比較（±s） %Table 3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis in six groups（±s） %

表3 6組心肌細胞凋亡情況比較（±s） %Table 3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis in six groups（±s） %

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴氏強心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴氏強心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the medium dose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴氏強心飲低劑量組嚴氏強心飲中劑量組嚴氏強心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8心肌細胞凋亡指數(shù)0.01±0.01 58.93±3.461）52.13±1.36 35.87±2.482）3）15.40±2.162）3）4）9.53±0.702）

圖2 6組心肌組織病理學檢測圖（×200）Figure 2 Myocardial histopathology figure in six groups(×200)

2.5 6組PI3K/Akt/Caspase-9信號通路蛋白表達水平比較

與正常組相比，模型組PI3K、Akt蛋白表達降低，Caspase-9、Caspase-3蛋白表達升高。與模型組比較，嚴氏強心飲低、中、高劑量組PI3K、Akt蛋白表達均明顯升高（P＜0.05），且隨著給藥濃度升高而逐漸升高（P＜0.05），嚴氏強心飲低、中、高劑量組Caspase-9、Caspase-3蛋白表達均明顯降低（P＜0.05），且隨著給藥濃度升高而逐漸降低（P＜0.05）。見圖3、表4。

圖3 6組PI3K/Akt/Caspase-9信號通路蛋白表達Figure 3 Expression of PI3K,Akt,Caspase-9 signaling pathway protein in six groups

表4 6組PI3K、Akt、Caspase-9信號通路蛋白表達比較（±s）Table 4 Comparison of expression of PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway protein in six groups（±s）

表4 6組PI3K、Akt、Caspase-9信號通路蛋白表達比較（±s）Table 4 Comparison of expression of PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway protein in six groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴氏強心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴氏強心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the mediumdose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴氏強心飲低劑量組嚴氏強心飲中劑量組嚴氏強心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8 PI3K 1.50±0.25 0.39±0.031）0.74±0.112）1.03±0.192）3）1.15±0.082）3）4）1.26±0.222）Akt 1.49±0.41 0.74±0.41）0.95±0.382）1.09±0.362）3）1.27±0.372）3）4）1.34±0.392）Caspase-9 0.42±0.05 1.00±0.091）0.89±0.142）0.77±0.112）3）0.65±0.072）3）4）0.51±0.082）Caspase-3 0.41±0.05 1.01±0.231）0.87±0.242）0.73±0.162）3）0.56±0.122）3）4）0.46±0.072）

2.6 6組心肌組織凋亡因子比較

與正常組比較，模型組Bcl-2含量、Bcl-2/Bax比值均明顯降低，而Bax含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，嚴氏強心飲低、中、高劑量組Bcl-2含量明顯升高（P＜0.05），隨著嚴氏強心飲濃度的升高而逐漸增多（P＜0.05）；嚴氏強心飲中、高劑量組Bax含量隨著嚴氏強心飲濃度的增加而逐漸下降（P＜0.05），而Bcl-2/Bax比值隨著給藥濃度升高而逐漸提高（P＜0.05）。見圖4、表5。

3 討 論

3.1 嚴氏強心飲可改善HF大鼠心臟功能，減少心肌細胞凋亡

圖4 6組心肌組織凋亡因子檢測結(jié)果Figure 4 Myocardial tissue apoptosisfactor assay results in six groups

經(jīng)胸超聲心動圖是評估心臟結(jié)構(gòu)和功能的首選方法，LVEF可反映左心室收縮功能［11-12］。本研究結(jié)果顯示，嚴氏強心飲低、中、高劑量組LVEF、LVFS逐漸升高，且嚴氏強心飲高劑量組改善效果更明顯；嚴氏強心飲中劑量組LVIDd降低，與模型組比較，嚴氏強心飲中、高劑量組LVIDs均明顯降低，這提示嚴氏強心飲可改善HF大鼠心臟功能。BNP主要由心室肌合成，當心臟負荷增大或心室擴大時，心肌細胞受牽拉而合成并釋放BNP入血增加，血漿BNP含量升高，并與心功能損傷的嚴重程度呈顯著正相關(guān)，故血清BNP的檢測被推薦用于HF篩查、診斷和鑒別診斷、病情嚴重程度及預后評估［13-14］。本研究結(jié)果顯示，HF大鼠血清BNP含量、心肌細胞凋亡數(shù)量隨著嚴氏強心飲濃度的升高而逐漸降低，這提示嚴氏強心飲能夠有效抑制HF大鼠心肌細胞的凋亡，且呈一定劑量依賴性，提高HF大鼠的心臟功能。

表5 6組心肌組織凋亡因子比較（±s）Table 5 Comparison of myocardial tissue apoptosis factor in six groups（±s）

表5 6組心肌組織凋亡因子比較（±s）Table 5 Comparison of myocardial tissue apoptosis factor in six groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與嚴氏強心飲低劑量組比較，3）P＜0.05；與嚴氏強心飲中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the low dose Yanshiqiangxin decoction group,3)P＜0.05;compared with the mediumdose Yanshiqiangxin decoction group,4)P＜0.05.

組別正常組模型組嚴氏強心飲低劑量組嚴氏強心飲中劑量組嚴氏強心飲高劑量組培哚普利組n 10 8 9 9 9 8 Bcl-2 1.02±0.13 0.27±0.061）0.45±0.112）0.66±0.112）3）0.86±0.102）3）4）0.89±0.132）Bax 0.77±0.11 1.58±0.041）1.50±0.10 1.31±0.042）3）1.10±0.042）3）4）1.02±0.042）Bcl-2/Bax 0.23±0.02 0.03±0.011）0.05±0.02 0.09±0.022）3）0.16±0.052）3）4）0.15±0.032）

3.2 嚴氏強心飲改善HF大鼠心臟功能可能與PI3K/Akt/Caspase-9信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，隨著嚴氏強心飲給藥濃度升高PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達以及Bcl-2/Bax比值均逐漸升高，而Caspase-9、Caspase-3、Bax蛋白表達均逐漸降低。這提示嚴氏強心飲改善HF大鼠心臟功能可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/Caspase-9信號通路有關(guān)。PI3K/Akt信號通路的激活，可以通過直接或間接的形式抑制細胞凋亡，從而減緩心力衰竭的發(fā)展進程［15］。Caspase家族分為包括Caspase-9在內(nèi)的凋亡啟動因子和包括Caspase-3在內(nèi)的凋亡執(zhí)行因子兩類［16］，兩者都是Akt下游的靶蛋白，是各類細胞凋亡的最好途徑，其能夠破壞細胞骨架，裂解DNA，導致細胞凋亡［17］。因此，對Caspase-9和Caspase-3蛋白表達的調(diào)節(jié)，是有效抑制心肌細胞凋亡的關(guān)鍵。嚴氏強心飲可以激活PI3K/Akt信號通路，使Akt活化后，降低Caspase-9表達，抑制Caspase級聯(lián)反應，使下游的Caspase-3不被激活，實現(xiàn)調(diào)控細胞凋亡的啟動和執(zhí)行程序，抑制細胞凋亡，從而減緩心力衰竭的發(fā)展進程?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax之間的平衡是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵［18］，嚴氏強心飲可以激活PI3K，促使其下游的Akt發(fā)生磷酸化而被激活參與信號傳導，從而促進Bcl-2的釋放并抑制Bax的表達，增加HF大鼠心肌細胞抗凋亡能力，減少心肌細胞的凋亡數(shù)量。

4 小 結(jié)

嚴氏強心飲能夠有效降低HF大鼠血清BNP水平，減少心肌細胞凋亡數(shù)量，改善HF大鼠心臟功能，并能上調(diào)PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Caspase-9、Caspase-3、Bax蛋白表達，提示其保護心肌細胞凋亡的作用機制可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/Caspase-9信號通路有關(guān)。