高德興，賈沛芝，彭 軍，林 煒

福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122

炎性應(yīng)答是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的生物過程，炎性應(yīng)答的啟動(dòng)是應(yīng)對不同刺激的反應(yīng)［1-2］，是人體對微生物感染、免疫細(xì)胞浸潤、化學(xué)刺激以及組織損傷最有效的保護(hù)機(jī)制之一［3］。持續(xù)的損傷或刺激會(huì)導(dǎo)致炎性應(yīng)答的不可控制，從而誘導(dǎo)全身性炎癥，并促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)展，導(dǎo)致器官損傷［4］。模式識別受體Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）作為上游信號分子，與炎性應(yīng)答以及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程高度相關(guān)［5］，TLR4的激活能夠啟動(dòng)炎性應(yīng)答靶基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生炎性應(yīng)答［6-7］。有研究表明，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）具有明顯的促炎效應(yīng)，參與了炎性應(yīng)答過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它能夠造成損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMPs）和新抗原形成，固有免疫細(xì)胞被DAMPs激活并誘發(fā)固有免疫應(yīng)答，AngⅡ能夠被其中的TLR4識別，并觸發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)防御反應(yīng)［8-9］。小檗堿（berberine，BBR）又名黃連素，是從黃連中分離提取的一種天然生物堿，是黃連的主要藥物活性物質(zhì)，它由連接2個(gè)甲氧基的萘環(huán)和連接雙醚基環(huán)的苯相接而成，擁有較大的疏水層，能通過與髓樣分化蛋白-2（myeloid differentiation protein-2，MD-2）競爭性結(jié)合而阻斷脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）/TLR4復(fù)合體的形成，抑制TLR4信號介導(dǎo)的炎性應(yīng)答，是TLR4信號通路的天然阻斷劑，常被用于治療腸道感染、眼部感染、炎癥性腸病等炎癥性疾病。AngⅡ誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答可能是通過門戶蛋白TLR4激活網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下游級聯(lián)反應(yīng)，其中包括核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活以及氧化應(yīng)激損傷。因此，本課題組提出假說：BBR能夠通過抑制TLR4信號通路的激活進(jìn)而調(diào)控AngⅡ誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答。為了進(jìn)一步探討其相關(guān)的作用機(jī)制，本研究使用AngⅡ刺激巨噬細(xì)胞（ANA-1）誘導(dǎo)建立體外炎癥模型，驗(yàn)證AngⅡ是否能夠誘導(dǎo)TLR4及下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并基于TLR4信號通路分析BBR對AngⅡ誘導(dǎo)炎性應(yīng)答的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要藥物和細(xì)胞株

小檗堿（上海源葉科技有限公司）；AngⅡ粉末（美國APExBIO生物科技有限公司）；ANA-1細(xì)胞株（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）。

1.2 主要試劑

RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；澳洲胎牛血清（美國Gibco公司）；青霉素/鏈霉素混合液（美國Hyclone公司）；CCK-8細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測試劑盒（美國APExBIO生物科技有限公司）；RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（南京碧云天生物技術(shù)有限公司，規(guī)格5×）；Phosphatase抑制劑Cocktail I（美國Abcam公司）；PhosStop磷酸酶抑制劑（德國羅氏診斷有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；快速凝膠制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司）；TLR4抗體、JNK抗體、p38抗體、GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；MyD88抗體、Phospho-NF-κBp65（Ser536）抗體、NF-κB p65抗體、Phospho-JNK抗體、Phospho-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、Phospho-p38抗體、p38抗體、IRF3抗體、Phospho-IRF3抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；TLR4抑制劑（TAK-242）（美國MedChemExpress公司）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液（北京索萊寶科技有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（美國Hyclone公司）。

1.3 主要儀器

37℃CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；電泳儀、電泳槽、小型轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞分組與培養(yǎng)

2.1.1 細(xì)胞分組 BBR粉末溶解于DMSO溶液中，配制成20 mmol/L母液，按需用無血清1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為1、5、10μmol/L的工作液，并避光分裝放置于-20℃冰箱保存。AngⅡ粉末溶解于PBS溶液，配制成1 mmol/L母液，按需用無血清1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為1μmol/L的工作液，分裝放置于-80℃冰箱保存。ANA-1細(xì)胞株培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。將對數(shù)增長期的ANA-1細(xì)胞按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分為對照組、熒光抗體組、模型組、低劑量BBR組、中劑量BBR組、高劑量BBR組、抑制劑組。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) ①對照組：皿中加入2.5μL的DMSO；②熒光抗體組：皿中加入2.5μL的DMSO；③模型組：皿中加入濃度為1μmol/L的AngⅡ工作液；④低劑量BBR組：皿中加入濃度為1μmol/L的BBR工作液；⑤中劑量BBR組：皿中加入濃度為5μmol/L的BBR工作液；⑥高劑量BBR組：皿中加入濃度為10μmol/L的BBR工作液；⑦抑制劑組：皿中加入濃度為10μmol/L的TAK242工作液。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 細(xì)胞增殖與毒性檢測實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期ANA-1細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，低、中、高劑量BBR組分別加入1、5、10μmol/L工作液100μL干預(yù)24 h后，棄培養(yǎng)基，加入CCK-8溶液培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長下測吸光度（Absorbance，Abs）值（A值）。每個(gè)濃度至少做3個(gè)復(fù)孔。采用細(xì)胞增殖與毒性檢測實(shí)驗(yàn)方法（cell counting kit-8，CCK-8）檢測對照組，低、中、高劑量BBR組的細(xì)胞A值。

2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞膜上TLR4平均熒光強(qiáng)度 取對數(shù)生長期ANA-1細(xì)胞按2.5×105個(gè)/mL的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至匯合度達(dá)60%～70%，棄原培養(yǎng)基，改用無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，模型組用1μmol/L AngⅡ刺激15 min；模型＋小檗堿高劑量組用高劑量BBR預(yù)處理2 h后，用1μmol/L AngⅡ刺激15 min，棄上清，用PBS溶液將細(xì)胞吹打下來，制備成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清。熒光抗體組、模型組、模型＋小檗堿高劑量組均分別加入TLR4熒光抗體（預(yù)冷1×PBS配制）100μL，避光孵育15～30 min；之后于1 000 r/min離心機(jī)上離心3 min；最后用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR4的平均熒光強(qiáng)度（The mean fluorescence intensity，MFI）。

2.2.3 ELISA法檢測白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α的含量 取對數(shù)生長期ANA-1細(xì)胞以2.5×105個(gè)/mL的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，棄原培養(yǎng)基，改用無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，模型組加入1μmol/L AngⅡ處理細(xì)胞24 h；模型＋低劑量BBR組、模型＋中劑量BBR組、模型＋高劑量BBR組、模型＋抑制劑組加入不同濃度BBR或TAK 242預(yù)處理2 h后，用1μmol/L AngⅡ處理細(xì)胞24 h，收集培養(yǎng)基上清液備用。分別按順序加入標(biāo)準(zhǔn)品和各組樣本，作復(fù)孔。加酶聯(lián)親和物并均勻振蕩后置于37℃恒溫中1 h，然后棄上清，清洗后加入底物，避光保存15 min。在各孔中加入反應(yīng)終止液。采用ELISA法檢測白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。

2.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的水平 細(xì)胞培養(yǎng)及鋪板操作如“2.2.3”項(xiàng)所述，模型組加入1μmol/L AngⅡ處理細(xì)胞6 h；模型＋低劑量BBR組、模型＋中劑量BBR組、模型＋高劑量BBR組分別加入1、5、10μmol/L BBR預(yù)處理2 h；模型＋抑制劑組加入10μmol/L TAK242抑制劑預(yù)處理2 h。各組分別用1μmol/L AngⅡ處理細(xì)胞6 h，用Trizol法提取RNA，遵照cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增，采用實(shí)時(shí)定量PCR法（quantitativereal-time PCR，Q-PCR）檢測IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的水平。引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.2.5 Western blot法檢測TLR4信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 模型組加入1μmol/L AngⅡ處理細(xì)胞15、30、45 min以及12 h；模型＋低劑量BBR組、模型＋中劑量BBR組、模型＋高劑量BBR組分別加入1、5、10μmol/L BBR預(yù)處理2 h；模型＋抑制劑組加入10μmol/L TAK242抑制劑預(yù)處理2 h。各組分別用1μmol/L AngⅡ刺激15、30、45 min以及12 h，收集細(xì)胞用于Western blot檢測。將細(xì)胞用RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白質(zhì)定量法（bicinchoninic acid，BCA）測定蛋白濃度。各蛋白樣品均加入1/4總蛋白體積的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）蛋白上樣緩沖液，在100℃金屬鍋中變性5～10 min后，使用SDS-PAGE電泳法進(jìn)行凝膠電泳，每個(gè)孔上樣量30μL，電泳條件：80 V 30 min、100 V 75 min，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22μm聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，轉(zhuǎn)膜條件：100 V 90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉1～2 h后加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜。采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）常溫孵育1～2 h后，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。采用Western blot檢測p-p65、p65、p-IRF3、IRF3、p-ERK、ERK、p-p38、p38、JNK、p-JNK、TLR4、MyD88、p-IκBα、IκBα、AP-1蛋白的表達(dá)。

2.2.6 生化法檢測丙二醛含量和超氧化物歧化酶活力 模型組加入1μmol/L AngⅡ處理細(xì)胞12 h；模型＋低劑量BBR組、模型＋中劑量BBR組、模型＋高劑量BBR組分別加入1、5、10μmol/L BBR預(yù)處理2 h。各組分別用1μmol/L AngⅡ刺激15、30、45 min以及12 h，收集細(xì)胞上清用于檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）。按照MDA及SOD測定試劑盒說明書配制好上清混合液。將200μL上清液混合液分別加進(jìn)96孔板，做好標(biāo)記，使用酶標(biāo)儀檢測A值，波長為532 nm，按照說明書進(jìn)行MDA含量和SOD活力計(jì)算。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4組ANA-1細(xì)胞活力比較

與對照組比較，低、中、高劑量BBR組細(xì)胞活性均無明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3.2 4組TLR4 MFI比較

與熒光抗體組比較，模型組MFI明顯減弱；與模型組比較，模型＋高劑量BBR組MFI明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表2 4組ANA-1細(xì)胞活力比較（±s）Table 2 Comparison of the activity of ANA-1 cells in four groups（±s）

表2 4組ANA-1細(xì)胞活力比較（±s）Table 2 Comparison of the activity of ANA-1 cells in four groups（±s）

組別對照組低劑量BBR組中劑量BBR組高劑量BBR組n3 3 3 3細(xì)胞活性（吸光值）0.29±0.04 0.29±0.01 0.29±0.05 0.29±0.06

表3 4組TLR4平均熒光強(qiáng)度比較（±s）Table 3 Comparison of the mean fluorescence intensity of TLR4 in four groups（±s）

表3 4組TLR4平均熒光強(qiáng)度比較（±s）Table 3 Comparison of the mean fluorescence intensity of TLR4 in four groups（±s）

注：與熒光抗體組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the fluorescent antibody group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

組別對照組熒光抗體組模型組模型＋高劑量BBR組n3 3 3 3 MFI 43.37±17.55 1 069.69±92.39 677.14±79.721）923.70±102.102）

3.3 6組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平比較

與對照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平明顯升高；與模型組比較，模型＋低、中、高劑量BBR組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。此外，研究結(jié)果顯示，與模型組比較，模型＋抑制劑組、模型＋高劑量BBR組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表4 6組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平的比較（±s）Table 4 Comparison of mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s）

表4 6組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平的比較（±s）Table 4 Comparison of mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

組別對照組模型組高劑量BBR組模型＋低劑量BBR組模型＋中劑量BBR組模型＋高劑量BBR組n3 3 3 3 3 3 IL-1βmRNA 1.00±0.20 1.52±0.191）0.95±0.28 0.99±0.372）0.54±0.132）0.37±0.092）IL-6 mRNA 1.00±0.07 4.78±0.201）1.03±0.12 0.86±0.212）0.85±0.112）0.75±0.082）TNF-αmRNA 1.00±0.12 1.85±0.261）1.05±0.23 0.80±0.312）0.70±0.192）0.61±0.042）

表5 6組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平比較（±s）Table 5 Comparison of mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s）

表5 6組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平比較（±s）Table 5 Comparison of mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

組別對照組模型組抑制劑組模型＋抑制劑組高劑量BBR組模型＋高劑量BBR組n3 3 3 3 3 3 IL-1βmRNA 1.00±0.05 2.54±0.181）1.06±0.15 0.64±0.142）0.83±0.24 0.19±0.022）IL-6 mRNA 1.00±0.19 2.16±0.261）0.83±0.13 0.85±0.242）0.93±0.09 0.43±0.122）TNF-αmRNA 1.00±0.07 1.61±0.161）1.00±0.17 0.40±0.052）0.81±0.11 0.23±0.042）

3.4 6組IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

與對照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯升高；與模型組比較，模型＋低、中、高劑量BBR組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。此外，研究結(jié)果顯示，與模型組比較，模型＋高劑量BBR組及模型＋抑制劑組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表7。

表6 6組IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（±s） pg/mLTable 6 Comparison of content of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s） pg/mL

表6 6組IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（±s） pg/mLTable 6 Comparison of content of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s） pg/mL

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

組別對照組模型組高劑量BBR組模型＋低劑量BBR組模型＋中劑量BBR組模型＋高劑量BBR組n3 3 3 3 3 3 IL-1β 5.79±0.27 6.98±0.021）5.56±0.10 6.61±0.072）6.13±0.112）4.10±0.292）IL-6 13.63±0.21 32.65±1.061）13.26±0.69 10.62±0.292）4.13±0.282）3.33±0.132）TNF-α 105.48±0.79 429.34±7.791）105.96±0.62 111.13±0.372）90.99±0.792）73.67±0.992）

表7 6組IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（±s） pg/mLTable 7 Comparison of content of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s） pg/mL

表7 6組IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（±s） pg/mLTable 7 Comparison of content of IL-1β，IL-6 and TNF-αin six groups（±s） pg/mL

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

組別對照組模型組抑制劑組模型＋抑制劑組高劑量BBR組模型＋高劑量BBR組n3 3 3 3 3 3 IL-1β 5.36±0.21 6.66±0.071）4.52±0.37 4.36±0.322）5.39±0.24 5.14±0.032）IL-6 10.41±0.31 35.50±0.351）6.32±2.27 5.62±0.422）11.55±0.09 10.28±0.372）TNF-α 101.87±0.92 434.96±14.071）86.18±1.05 73.67±1.652）98.96±0.84 93.32±2.022）

3.5 6組AngⅡ干預(yù)后TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較

3.5.1 6組AngⅡ干預(yù)45 min TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較 與對照組比較，模型組干預(yù)45 min后p65、IRF-3蛋白的磷酸化表達(dá)明顯上調(diào)，模型＋低、中、高劑量BBR組干預(yù)45 min后p65、IRF-3蛋白的磷酸化表達(dá)明顯下調(diào)。見圖1。

3.5.2 6組AngⅡ干預(yù)15、30、45 min TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較 與對照組比較，模型組干預(yù)15 min后ERK、p38蛋白磷酸化表達(dá)明顯上調(diào)，干預(yù)30 min后JNK蛋白磷酸化表達(dá)明顯上調(diào)，干預(yù)45 min后p65、IRF-3蛋白磷酸化表達(dá)明顯上調(diào)。而模型＋高劑量BBR組、模型＋抑制劑組p65、IRF-3、ERK、p38、JNK蛋白磷酸化表達(dá)均明顯下調(diào)。見圖2。

圖1 6組干預(yù)45 min TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較Figure 1 Comparison of phosphorylation expression of TLR4-related protein after intervention for 45 min in six groups

圖2 6組AngⅡ干預(yù)15、30、45 min TLR4相關(guān)蛋白磷酸化的表達(dá)比較Figure 2 Comparison of phosphorylation expression of TLR4-related protein after intervention for 15,30,45 min in six groups

3.6 6組AngⅡ干預(yù)后TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較

3.6.1 6組AngⅡ干預(yù)12 h TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較 與對照組比較，模型組干預(yù)12 h后TLR4、MyD88、AP-1蛋白的表達(dá)以及p65、IκBα、JNK蛋白的磷酸化表達(dá)明顯上調(diào)。模型＋低、中、高劑量BBR組TLR4、MyD88、AP-1蛋白的表達(dá)以及p65、IκBα、JNK蛋白的磷酸化表達(dá)均明顯下調(diào)。見圖3。

圖3 6組干預(yù)12 h TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較Figure 3 Comparison of phosphorylation expression of TLR4-related protein after intervention for 12 h in six groups

3.6.2 5組AngⅡ干預(yù)12 h TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較 與對照組比較，模型組干預(yù)12 h后TLR4、p-p65的表達(dá)明顯上調(diào)，而模型＋高劑量BBR組、模型＋抑制劑組、模型＋抑制劑＋高劑量BBR組TLR4、p-p65蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)。見圖4。

圖4 5組干預(yù)12 h TLR4相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)比較Figure 4 Comparison of phosphorylation expression of TLR4-related protein after intervention for 12 h in five groups

3.7 5組MDA含量和SOD活力比較

與對照組比較，模型組MDA含量明顯上調(diào)，SOD活力明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型＋低、中、高劑量BBR組MDA含量均明顯下調(diào)，SOD活力明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表8。

表8 5組MDA含量和SOD活力比較（±s） nmol/mLTable 8 Comparison of MDA content and SOD activity in five groups（±s） nmol/mL

表8 5組MDA含量和SOD活力比較（±s） nmol/mLTable 8 Comparison of MDA content and SOD activity in five groups（±s） nmol/mL

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

組別對照組模型組模型＋低劑量BBR組模型＋中劑量BBR組模型＋高劑量BBR組n3 3 3 3 3 SOD 7.91±0.07 6.09±0.041）7.20±0.062）7.49±0.042）7.69±0.042）MDA 0.49±0.02 0.69±0.021）0.49±0.012）0.45±0.012）0.44±0.022）

4 討 論

4.1 BBR能有效抑制TLR4蛋白“內(nèi)吞”

由于配體的刺激作用，活化的TLR4分別通過招募MyD88接頭蛋白TRIF、TRAM后啟動(dòng)下游信號，同時(shí)使配體與TLR4復(fù)合體轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)，細(xì)胞膜表面的TLR4受體數(shù)量減少［10-11］。本研究結(jié)果顯示，與熒光抗體組比較，模型組MFI明顯減弱，這提示AngⅡ誘導(dǎo)了細(xì)胞膜上TLR4蛋白數(shù)量減少，即發(fā)生“內(nèi)吞”，這可能是因?yàn)锳ngⅡ與細(xì)胞表面TLR4結(jié)合，內(nèi)吞轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)內(nèi)。與模型組比較，模型+高劑量BBR組MFI明顯增強(qiáng)，這提示BBR能夠阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的TLR4蛋白“內(nèi)吞”。這可能與以下因素有關(guān)：AngⅡ能夠與TLR4的輔助蛋白MD2結(jié)合進(jìn)而招募TLR4，這種直接的相互作用類似于LPS與MD2的結(jié)合，導(dǎo)致AngⅡ-MD2-TLR4復(fù)合物的形成，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及接頭蛋白的募集［12］，但這一過程并不依賴于AT1R信號通路［13］。BBR可能通過競爭性抑制AngⅡ與MD2的結(jié)合來抑制細(xì)胞膜表面的TLR4減少，這一作用可能和BBR競爭性抑制LPS與MD2的結(jié)合類似。

4.2 BBR能有效抑制TLR4信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和IL-1β、IL-6、TNF-α的轉(zhuǎn)錄

研究顯示，TLR4的胞內(nèi)區(qū)信號主要通過2條途徑被激活，MyD88依賴非依賴途徑活化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［14-15］，最終MAPK、NF-κB以及IRF3信號通路被激活，調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答及促炎因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達(dá)，導(dǎo)致炎性應(yīng)答的發(fā)生發(fā)展［16-17］。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ誘導(dǎo)ANA-1細(xì)胞15、30、45 min能夠誘導(dǎo)ERK、p38、JNK、p65、IRF-3的磷酸化，而TAK242抑制劑的干預(yù)均能夠抑制上述蛋白的磷酸化水平，這提示了AngⅡ瞬時(shí)刺激可能會(huì)導(dǎo)致ERK、p38、JNK、p65、IRF-3蛋白磷酸化，即使在AngⅡ誘導(dǎo)12 h（滯后性效應(yīng)）后依然能夠促進(jìn)TLR4、MyD88、IκBα、AP-1的蛋白表達(dá)以及JNK的磷酸化。而模型＋高劑量BBR組、模型＋抑制劑組p65、IRF-3、ERK、p38、JNK蛋白的磷酸化表達(dá)均明顯下調(diào)，這提示BBR能夠有效抑制上述蛋白及磷酸化表達(dá)。IL-1β、IL-6、TNF-α是炎性應(yīng)答觸發(fā)后產(chǎn)生的細(xì)胞因子，當(dāng)巨噬細(xì)胞被外界刺激后，會(huì)產(chǎn)生大量促炎因子和早期炎性應(yīng)答標(biāo)記物，在組織損傷、微生物感染和免疫系統(tǒng)激活的條件下分泌和釋放［18-20］。有研究表明，抑制TLR4/MAPK以及NF-κB信號通路可以進(jìn)而抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α轉(zhuǎn)錄［21-22］。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ能夠誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平及含量明顯上調(diào)，而BBR、TLR4信號通路抑制劑TAK242均能夠明顯下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的上述促炎因子mRNA水平及含量。這可能與以下因素有關(guān)：①AngⅡ能夠誘導(dǎo)TLR4的活化，激活下游級聯(lián)反應(yīng)，其中包括激活MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白ERK、p38、JNK的磷酸化以及AP-1蛋白水平，并且能夠使IκBα蛋白與NF-κB解離并磷酸化，激活NFκB信號通路，從而調(diào)控了炎癥因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等）的轉(zhuǎn)錄。②BBR能夠通過TLR4信號通路抑制AngⅡ誘導(dǎo)的相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的轉(zhuǎn)錄，即BBR能夠通過TLR4信號通路抑制AngⅡ誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答。

4.3 BBR能有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)

TLR4信號通路的激活能夠刺激還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶［23］，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）轉(zhuǎn)化形成［24］。ROS水平的失衡激活NF-κB途徑，導(dǎo)致NF-κB的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，增加炎性應(yīng)答反應(yīng)程度［25］。本研究結(jié)果顯示，模型組MDA含量明顯上調(diào)，SOD活力明顯下降，說明AngⅡ能夠誘導(dǎo)ANA-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。而模型+低、中、高劑量BBR組MDA含量均明顯下調(diào)，SOD活力明顯上調(diào)，這提示，低、中、高劑量BBR能夠改善AngⅡ誘導(dǎo)的ANA-1細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度及抗氧化能力，降低AngⅡ造成的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)ANA-1細(xì)胞，進(jìn)而降低炎性應(yīng)答的發(fā)生。這可能與以下因素有關(guān)：BBR通過抑制TLR4信號通路的激活進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展。BBR抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，間接抑制了ROS激活NF-κB信號通路的作用，維持活性氧水平和抗氧化能力的動(dòng)態(tài)平衡，在炎性應(yīng)答中發(fā)揮了重要的作用。

5 小 結(jié)

BBR能夠通過抑制TLR4蛋白的“內(nèi)吞”，從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TLR4信號通路的異常激活，并且抑制下游NF-κB和MAPK信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平和含量，調(diào)控炎性應(yīng)答。此外，BBR還能夠改善AngⅡ誘導(dǎo)的ANA-1細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度的增加和抗氧化能力的減弱，降低AngⅡ造成的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)ANA-1細(xì)胞。AngⅡ誘導(dǎo)炎性應(yīng)答的發(fā)生，造成靶器官損傷，導(dǎo)致心腦血管疾病、胰島素抵抗、腎臟疾病、肺動(dòng)脈高壓等疾病病理發(fā)展過程。其具體作用機(jī)制可能是BBR可通過競爭性抑制TLR4信號通路的激活，減輕炎性應(yīng)答。這也許可以為臨床治療AngⅡ刺激產(chǎn)生的炎癥性疾病提供新思路，但需要進(jìn)一步通過大樣本臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)加以驗(yàn)證。此外，BBR對TLR4信號通路的抑制作用是否呈劑量依賴性也有待進(jìn)一步研究。