圖拉嘎，特木爾布和，張志強(qiáng)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011）

苜蓿屬（Medicago）為豆科一年生或多年生草本植物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、產(chǎn)量高、草質(zhì)優(yōu)良、適口性好、性價(jià)比高[1]。隨著苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，我國(guó)加強(qiáng)了國(guó)外苜蓿的引種工作[2]，使得眾多苜蓿品種應(yīng)運(yùn)而生，而不同品種花粉形態(tài)特征千差萬(wàn)別，表現(xiàn)出極為豐富的生物多樣性。

植物花粉的大小、形狀和萌發(fā)器官等形態(tài)特征，由母本植物的遺傳物質(zhì)控制，受外界環(huán)境條件影響很小，遺傳性較為穩(wěn)定[3]?；ǚ哿Ｌ卣麟S著植物種類的變化呈現(xiàn)不同形態(tài)[4-5]，在各種植物中表現(xiàn)穩(wěn)定[6-8]，具有為植物正確分類、判斷物種間親緣關(guān)系及遺傳變異特性提供佐證的功能[9]。此外，花粉遺傳上的保守性、穩(wěn)定性和可靠性，對(duì)研究植物的品種鑒定、物種分類、系統(tǒng)發(fā)育、起源與演化具有很大的作用[10]。WALKER 等[11]研究認(rèn)為，在被子植物中，除了木蘭亞綱植物的花粉，較為進(jìn)化的多孔（溝）型花粉均可能是從3 萌發(fā)孔溝花粉演化而來(lái)。賀學(xué)禮等[12]對(duì)7 種豆科植物花粉形態(tài)進(jìn)行研究，并根據(jù)花粉形態(tài)和紋飾特點(diǎn)將7 種豆科植物分為2 個(gè)類型，第1 種類型的花粉為近球形或扁球形，表面具穴狀紋飾；第2 種類型的花粉為長(zhǎng)球形，具網(wǎng)狀紋飾。早在20世紀(jì)60年代，我國(guó)學(xué)者對(duì)苜蓿屬植物花粉形態(tài)特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，苜蓿屬花粉一般為長(zhǎng)球形，極面觀為鈍三角形或三裂圓形，赤道面觀為橢圓形；極軸長(zhǎng)20～40 μm，赤道軸長(zhǎng)13～37 μm；具3 萌發(fā)孔溝，萌發(fā)孔溝有外突或無(wú)；表面紋飾較簡(jiǎn)單，在掃描電鏡下觀察多呈粗糙、小穴狀或稀網(wǎng)狀[13-14]。前人應(yīng)用電鏡掃描等技術(shù)對(duì)眾多植物花粉形態(tài)特征進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)不同種的花粉形態(tài)大小、表面紋飾以及壁的層次結(jié)構(gòu)均存在差異，認(rèn)為這些差異可作為鑒別種或品種的主要依據(jù)之一[15-16]。但是對(duì)苜蓿屬植物花粉形態(tài)電鏡掃描的研究，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，有關(guān)苜?；ǚ坌螒B(tài)的研究多集中在種的水平上，很少對(duì)苜蓿品種間花粉形態(tài)特征進(jìn)行對(duì)比研究[17]。對(duì)不同苜蓿品種花粉形態(tài)進(jìn)行比較研究能為探討苜蓿種和品種演化提供依據(jù)[18-19]。

本研究以內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)自選和整理登記的國(guó)家級(jí)7 個(gè)苜蓿品種為試驗(yàn)材料，對(duì)其花粉進(jìn)行電鏡掃描觀測(cè)、比較，區(qū)分不同苜蓿品種花粉形態(tài)特征，旨在為研究和挖掘苜蓿種質(zhì)資源、遺傳育種和變異進(jìn)化提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地位于呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)新校區(qū)牧草科技示范區(qū)（40°49′N，111°41′E），海拔1 059 m，年平均氣溫6.6～6.8 ℃，≥0 ℃積溫2 900～3 500 ℃。極端最高氣溫在7月下旬—8月可達(dá)到37 ℃。極端最低氣溫在1月，可達(dá)到-33 ℃。初霜期9月末，晚霜期5月中旬，無(wú)霜期135～145 d。土壤質(zhì)地為栗鈣土，pH 值為7.5～8.4。

1.2 材料

供試材料為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)自選和整理登記的國(guó)家級(jí)苜蓿品種（表1）：敖漢苜蓿（Medicago sativaL.cv.Aohan）、準(zhǔn)格爾苜蓿（Medicago sativaL.cv.Neimeng Zhungeer）、草原1 號(hào)雜花苜蓿（Medicago variaMartin.cv.Caoyuan No.1）、草原2 號(hào)雜花苜蓿（Medicago variaMartin.cv.Caoyuan No.2）、草原3 號(hào)雜花苜蓿（Medicago variaMartin.cv.Caoyuan No.3）、草原4 號(hào)紫花苜蓿（Medicago sativaL.cv.Caoyuan No.4）和花苜蓿（直立型扁蓿豆）［Medicago ruthenicus（L.）Sojak cv.Zhilixing］。本試驗(yàn)依據(jù)《中國(guó)植物志》的分類，將直立型扁蓿豆歸為苜蓿屬[20-21]。

表1 供試苜蓿品種

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)材料采集

2017年8月20日，以隨機(jī)區(qū)組排列方式，將試驗(yàn)材料種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科技示范區(qū)。每個(gè)品種種植9 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)種植面積為20 m2（10 m×2 m）。各苜蓿品種進(jìn)入盛花期時(shí)，選擇大小一致，旗瓣、翼瓣已張開(kāi)而龍骨瓣未張開(kāi)的小花，用牛角勺按一下小花龍骨瓣基部，這時(shí)花絲管下彎，花藥彈出，花粉留在勺上，將花粉裝入表面光滑、透氣性好的干燥紙袋，統(tǒng)一編號(hào)，并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行干燥處理，待進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.3.2 樣品處理

確定采集花粉標(biāo)本準(zhǔn)確無(wú)誤后，進(jìn)行粉碎、除雜，分離出純花粉。將雙面膠紙放于平坦的水平面，把分離出的純花粉樣品均勻撒在雙面膠紙上，之后使用IB-5 型離子濺射儀鍍膜。

1.3.3 樣品觀察

將經(jīng)過(guò)鍍膜的花粉放入日立S-530 掃描電子顯微鏡，進(jìn)行電鏡顯微投影。記載形態(tài)特征以及技術(shù)參數(shù)。每個(gè)品種隨機(jī)選擇20 ?；ǚ?，觀測(cè)花粉形狀，測(cè)量其花粉樣品極軸長(zhǎng)（P）與赤道軸長(zhǎng)（E），計(jì)算極赤比（P/E）及花粉粒大小，并描述花粉萌發(fā)孔溝和表面紋飾特征。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010 和Origin 2018 軟件制表，并進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒大小及形狀比較

2.1.1 花粉極軸長(zhǎng)比較

由表2 可知，不同苜蓿品種花粉極軸長(zhǎng)存在差異。敖漢苜蓿花粉極軸最長(zhǎng)為44.27 μm，與草原4 號(hào)紫花苜蓿、草原3 號(hào)雜花苜蓿、花苜蓿相比，差異顯著（P＜0.05）；準(zhǔn)格爾苜蓿、草原1 號(hào)雜花苜蓿、草原2 號(hào)雜花苜蓿間差異不顯著（P>0.05），但與草原3 號(hào)雜花苜蓿、花苜蓿相比均差異顯著（P＜0.05）；花苜蓿的花粉極軸長(zhǎng)最短，為35.48 μm，與除草原3 號(hào)雜花苜蓿外的其他品種相比均差異顯著（P＜0.05）。

表2 不同苜蓿品種花粉極軸長(zhǎng)的比較 單位：μm

2.1.2 花粉赤道軸長(zhǎng)比較

由表3 可知，不同苜蓿品種花粉赤道軸長(zhǎng)度存在差異。草原4 號(hào)紫花苜蓿赤道軸長(zhǎng)最長(zhǎng)，為26.39 μm，敖漢苜蓿次之，為25.69 μm，二者與草原3 號(hào)雜花苜蓿、花苜蓿相比均差異顯著（P＜0.05）；花苜蓿赤道軸長(zhǎng)最短，為20.56 μm，與除草原3 號(hào)雜花苜蓿外的其他品種相比均差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同苜蓿品種花粉赤道軸長(zhǎng)的比較 單位：μm

2.1.3 花粉大小比較

由表4 可知，不同苜蓿品種花粉大小存在差異。敖漢苜蓿花粉最大，為33.71 μm，與草原3 號(hào)雜花苜蓿和花苜蓿相比差異顯著（P＜0.05）；準(zhǔn)格爾苜蓿、草原4 號(hào)紫花苜蓿、草原1 號(hào)雜花苜蓿差異不顯著，但與草原3 號(hào)雜花苜蓿和花苜蓿相比均差異顯著（P＜0.05）?；ㄜ俎；ǚ圩钚?，為26.99 μm，與除草原3 號(hào)雜花苜蓿外的其他品種相比均差異顯著（P＜0.05）。根據(jù)花粉直徑，通常可將花粉粒大小分為6 個(gè)等級(jí)[22（]表5）。參試品種花粉直徑為26.99～33.71 μm，均屬于第3 等級(jí)，為中等大小。

表4 不同苜蓿品種花粉大小的比較 單位：μm

表5 花粉大小等級(jí) 單位：μm

2.1.4 花粉極赤比和形狀比較

由表6 可知，草原1 號(hào)雜花苜蓿花粉極赤比最大，為1.81，與草原4 號(hào)紫花苜蓿相比差異顯著（P＜0.05）；草原4 號(hào)紫花苜?；ǚ蹣O赤比最小，為1.54，與草原1 號(hào)雜花苜蓿、準(zhǔn)格爾苜蓿、敖漢苜蓿相比均差異顯著（P＜0.05）?；ǚ鄣男螤羁梢罁?jù)極軸長(zhǎng)與赤道軸長(zhǎng)的比值即極赤比進(jìn)行分級(jí)，一般分為5 級(jí)[22]（表7），7個(gè)苜蓿品種花粉極赤比為1.54～1.81。極赤比結(jié)合群體觀測(cè)，7 個(gè)苜蓿品種的花粉均屬長(zhǎng)球形（圖1a～圖7a）；由赤道面觀測(cè)，7 個(gè)苜蓿品種的花粉均為橢圓形（圖1b～圖7b）；由極面觀測(cè)，7 個(gè)苜蓿品種的花粉極面觀均為三裂圓形（圖1c～圖7c）。

表6 不同苜蓿品種花粉極赤比的比較

表7 花粉形狀分級(jí)

2.2 花粉萌發(fā)孔和表面紋飾比較

由圖1b～圖7b 和圖1c～圖7c 可知，7 個(gè)苜蓿品種的花粉均有3 條萌發(fā)孔溝，萌發(fā)孔溝細(xì)長(zhǎng)，邊緣較整齊，無(wú)明顯凸起。草原2 號(hào)雜花苜蓿部分花粉粒萌發(fā)孔溝中間部位呈微閉合狀態(tài)。

敖漢苜?；ǚ哿１砻婕y飾為穴狀紋飾，穴較小且較深，并伴有少量穿孔，赤道面觀分布較均勻，越趨于兩極紋飾越少；與其他品種相比，敖漢苜蓿極面觀紋飾數(shù)量較多（圖1d）。準(zhǔn)格爾苜?；ǚ哿１砻婕y飾多為穴狀紋飾，赤道面觀中部偶有腦紋狀紋飾（圖2d）。草原1 號(hào)雜花苜?；ǚ哿１砻婕y飾為淺穴狀，數(shù)量少，呈分散分布，但極面觀紋飾稀少（圖3d）。草原2 號(hào)雜花苜蓿花粉粒表面紋飾為穴狀，穴較小，數(shù)量多，且分布均勻，紋飾還伴有少量穿孔現(xiàn)象（圖4d）。草原3 號(hào)雜花苜蓿花粉粒表面紋飾多為穴狀，穴較小，少數(shù)花粉粒赤道面觀中部呈現(xiàn)出腦紋狀紋飾，草原4 號(hào)紫花苜蓿極面觀紋飾稀少（圖5d）。草原4 號(hào)紫花苜蓿花粉粒表面紋飾為淺穴狀，穴較小，與其他苜蓿品種相比，草原4 號(hào)紫花苜蓿極面觀紋飾較多（圖6d）?；ㄜ俎；ǚ哿１砻婕y飾為淺穴狀，穴小深度較淺，紋飾不明顯，相比其他品種花粉更為光滑，赤道面觀紋飾分布均勻，極面觀光滑無(wú)紋飾（圖7）。

圖1 敖漢苜?；ǚ坌螒B(tài)

圖2 準(zhǔn)格爾苜蓿花粉形態(tài)

圖3 草原1 號(hào)雜花苜?；ǚ坌螒B(tài)

圖4 草原2 號(hào)雜花苜?；ǚ坌螒B(tài)

圖5 草原3 號(hào)雜花苜?；ǚ坌螒B(tài)

圖6 草原4 號(hào)紫花苜蓿花粉形態(tài)

圖7 花苜?；ǚ坌螒B(tài)

3 討論

花粉形態(tài)特征是植物親緣關(guān)系基礎(chǔ)、植物分類以及栽培品種審定的重要依據(jù)。傳統(tǒng)的形態(tài)分類受環(huán)境影響較大，客觀性受到一定限制，而花粉的形態(tài)特征是由基因控制，受外界環(huán)境條件的影響較小，具有很強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。植物花粉形態(tài)特征是在長(zhǎng)期的自然環(huán)境條件下進(jìn)化形成，攜帶大量有關(guān)演化的信息，在品種分類以及品種間親緣關(guān)系的分析方面，孢粉學(xué)具有重要意義[23]。本研究結(jié)果表明，7 個(gè)苜蓿品種的花粉，在形態(tài)特征的多個(gè)方面表現(xiàn)出一定程度的差異。

本研究結(jié)果表明，除草原3 號(hào)雜花苜蓿和花苜蓿外的苜蓿品種花粉極軸長(zhǎng)均大于40 μm，這與馬劍敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)的苜蓿屬花粉極軸長(zhǎng)通常在20～40 μm 的結(jié)果略有差異；參試7 個(gè)苜蓿品種花粉赤道軸長(zhǎng)20.56～26.39 μm，與馬劍敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)的苜蓿屬花粉赤道軸長(zhǎng)為13～37 μm 的結(jié)果一致，與孫啟忠等[22]研究發(fā)現(xiàn)的赤道軸長(zhǎng)度為21.6～26.8 μm的結(jié)果略有差異；根據(jù)花粉粒大小的范圍，通常分為6 個(gè)等級(jí)，從本研究結(jié)果來(lái)看，參試7 個(gè)苜蓿品種花粉直徑大小為25～15 μm，均屬中等，敖漢苜蓿花粉直徑最大（33.71 μm），花苜蓿花粉直徑最?。?6.99 μm）；參試品種的花粉極赤比為1.54～1.81，屬于長(zhǎng)球形花粉，草原1 號(hào)雜花苜?；ǚ蹣O赤比最大（1.81），草原4 號(hào)紫花苜?；ǚ蹣O赤比最小（1.54）。極赤比大小很大程度上確定了花粉形狀，由于苜蓿品種遺傳特性的差異，各品種花粉形態(tài)表現(xiàn)各異[24]。敖漢苜蓿是內(nèi)蒙古地方品種、草原4 號(hào)紫花苜蓿是抗薊馬育成品種、花苜蓿是野生馴化品種，其花粉遺傳特性差異很大，該結(jié)果與以上提出的結(jié)論相符。

花粉粒的萌發(fā)器官、外壁紋飾等細(xì)微特征隨植物種類而不同，并在各種植物中表現(xiàn)穩(wěn)定[25]。具有萌發(fā)孔溝類型的萌發(fā)器官是被子植物特有的，本研究參試7 個(gè)苜蓿品種的花粉均具有3 條萌發(fā)孔溝，萌發(fā)孔溝細(xì)長(zhǎng)，邊緣較整齊，無(wú)明顯凸起，這與中國(guó)科學(xué)院植物研究所形態(tài)室孢粉組研究的中國(guó)植物花粉形態(tài)苜?；ǚ哿Ｊ? 萌發(fā)孔溝類型的結(jié)果一致[23]，草原2 號(hào)雜花苜蓿部分花粉粒萌發(fā)孔溝中間部位呈微閉合狀態(tài)。有研究表明，苜蓿屬花粉外壁以腦紋狀紋飾為主，穴狀紋飾為輔，經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)僅有準(zhǔn)格爾苜蓿、草原3 號(hào)雜花苜?；ǚ哿３嗟烂嬷胁颗加心X紋狀紋飾，其他花粉粒表面均呈現(xiàn)穴狀紋飾或者淺穴狀紋飾，與本研究結(jié)果略有差異。宛濤等[26]研究發(fā)現(xiàn)，草原2 號(hào)雜花苜?；ǚ哿１砻婢邷\穴狀紋飾，穴較小，并伴有一定數(shù)量的穿孔，極區(qū)和溝緣周圍較光滑，溝間區(qū)還有陰影狀斑痕，與本研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果表明，敖漢苜蓿、準(zhǔn)格爾苜蓿、草原2 號(hào)雜花苜蓿和草原3 號(hào)雜花苜?；ǚ哿１砻婕y飾屬穴狀紋飾，草原1 號(hào)雜花苜蓿、草原4 號(hào)紫花苜蓿花粉粒表面紋飾屬淺穴狀紋飾。

4 結(jié)論

7 個(gè)苜蓿品種的花粉粒形態(tài)特征具有一定程度的異同之處。7 個(gè)品種均有極面觀三裂圓形、赤道面觀橢圓形、具3 萌發(fā)孔溝等特征，而在花粉粒極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、大小、極赤比和表面紋飾等指標(biāo)上有顯著差異。花苜蓿和草原4 號(hào)紫花苜?；ǚ坌螒B(tài)相比其他品種差異明顯?；ㄜ俎；ǚ鄞笮∶黠@小于其他品種，且花粉表面的穴狀紋飾深度明顯淺于其他品種，草原4 號(hào)紫花苜蓿極赤比顯著小于其他品種，更顯膨潤(rùn)狀。