楊 帆，張艷芳，王錦華，趙 圓，趙令敏，張曉蒙，張 勇，霍秀文

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010011；2.烏蘭察布市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古集寧 012000；3.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古臨河 015000）

山藥（Dioscorea oppositaThunb.）是具有雙子葉植物特征的單子葉植物，為垂直向地生長的長圓柱形塊莖。山藥是典型的藥食同源性蔬菜，是食用蔬菜中的上品，也是最早列入《本草綱目》的中藥材之一[1-2]。山藥味甘性溫，有健脾和胃、生津益肺、美容養(yǎng)顏、增強(qiáng)抵抗力等功效[3]。山藥因其極高的食用和商業(yè)價值在國內(nèi)外市場備受歡迎。我國是山藥主要的起源中心之一，山藥種質(zhì)資源根據(jù)生態(tài)區(qū)域和生物學(xué)性狀被分為南、北方山藥群（以長江流域為界）[4-5]。近年來，山藥實施“南薯北移”的種植策略，南方優(yōu)質(zhì)山藥因氣候不同、不易貯藏等問題在北方難以完全表現(xiàn)其特點(diǎn)，甚至和北方山藥野生種形態(tài)相近。內(nèi)蒙古西部地區(qū)為我國山藥種植的新興重要產(chǎn)區(qū)，近年來，種質(zhì)資源廣泛交換，導(dǎo)致品種名稱混亂，給山藥新品種的選育帶來挑戰(zhàn)[6]。

基于遺傳標(biāo)記對作物遺傳多樣性和核心種質(zhì)的研究較多，但多數(shù)是研究基因的間接表達(dá)，如形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生化標(biāo)記，且易受環(huán)境等外在因素影響，難以精確分析[7]。分子標(biāo)記是在DNA 水平上對于生物體遺傳結(jié)構(gòu)的直接反映[8]，與前三類方法相比穩(wěn)定性好且不易受環(huán)境限制，結(jié)果準(zhǔn)確[9]。彭斌[10]利用SRAP 分子標(biāo)記對薯蕷及其5 種近緣種研究發(fā)現(xiàn)，野生薯蕷屬物種間存在有性繁殖的方式，并有非常豐富的基因流。郭文等[11]利用AFLP 標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了22 份薯蕷屬材料的DNA 指紋圖譜，為薯蕷屬植物品種改良提供了理論依據(jù)。KEDRA 等[12]利用ISSR 標(biāo)記對來自埃塞俄比亞的70 份山藥的遺傳多樣性作出了評估，揭示了山藥在屬水平上的高度變異。隨著種質(zhì)資源的大量收集，資源規(guī)模的擴(kuò)大使保存和分析工作成為難題。遺傳多樣性代表了植物對環(huán)境的適應(yīng)力[13]。核心種質(zhì)是以最少數(shù)量的遺傳資源最大限度地代表整個群體的遺傳多樣性，通過對部分代表性種質(zhì)的優(yōu)先評價，充分利用其中的優(yōu)良基因，可以大大提高種質(zhì)資源的保存和利用效率[14]。SSR 標(biāo)記是分子標(biāo)記中一種簡單快速、易于分析、相對穩(wěn)定的方法。目前，國內(nèi)外利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)展開了很多研究，崔洪宇等[15]、王郅琪等[16]、李瓊等[17]、DUAN 等[18]、SIMONE 等[19]分別基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了黃瓜、芝麻、大豆、馬鈴薯、番茄的遺傳多樣性，并將該技術(shù)用于品種鑒定并構(gòu)建核心種質(zhì)庫。本試驗利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，分析來源于我國各地的55 份山藥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，并基于聚類分析結(jié)果建立了山藥初級核心種質(zhì)庫，旨在為山藥種質(zhì)資源保存和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試55 份材料是近年來從我國山藥主產(chǎn)區(qū)引進(jìn)的種質(zhì)資源，種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)山藥種質(zhì)資源圃（表1）。在2021年8月取山藥種質(zhì)資源圃生長旺盛的山藥細(xì)嫩葉片，立即將提前標(biāo)記好的密封袋放入冰盒中，帶回實驗室儲存到-80 ℃冰箱備用。

表1 供試山藥材料編號及來源

1.2 DNA 提取及檢測

根據(jù)試劑盒（天根生化有限公司）說明書中的步驟，提取55 份山藥葉片基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計檢測DNA 純度和完整性后，將OD260nm/OD280nm1.7～1.9 的DNA 稀釋，并儲存到-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR分析

引物來源：在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜育種課題組前期高通量測序獲得的山藥轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中篩選40 組SSR 引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成。經(jīng)多次預(yù)試驗，篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的12 組引物。

采用篩選出的12 對特異性好的SSR 引物，以55 份山藥種質(zhì)DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：每20 μL 體系中含10 μL rTaq 酶、Forward primer 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、DNA 模板0.4 μL、超純水8.6 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、54～60 ℃復(fù)性30 s（退火溫度依據(jù)引物而定），72 ℃延伸1 min、循環(huán)40 次；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中175 V電壓下電泳2 h 左右，最后用硝酸銀染色并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)試驗所得電泳圖，選擇清晰、穩(wěn)定的條帶，在相同遷移位置上，統(tǒng)計擴(kuò)增條帶，有條帶記為“1”，沒有或者模糊條帶記為“0”，得到“0/1”矩陣，使用POPGENE32 軟件分析多態(tài)位點(diǎn)比率、平均等位基因數(shù)（Na）、平均有效等位基因數(shù)（Ne）、平均Nei′s 基因多樣性指數(shù)（He）、平均Shannon-Wiener 多樣性信息指數(shù)（I）。使用NTsys2.10e 軟件中的UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析，用Tree plot 功能繪制聚類圖，將數(shù)據(jù)用DCENTER 中心化后，采用EIGEN 系統(tǒng)進(jìn)行主坐標(biāo)分析[20]。

1.5 初級核心種質(zhì)庫的構(gòu)建及評價

對種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析后，依據(jù)聚類圖中的遺傳相似系數(shù)采用最小距離逐步抽樣法（LDSS）構(gòu)建初級核心種質(zhì)庫，抽樣比例為70%、50%、40%、30%、20%、10%，共抽樣6 次[21]。具體方法為觀察全部種質(zhì)的UPGMA 聚類圖，隨機(jī)刪除1 份遺傳相似系數(shù)較大的種質(zhì)組合，將剩余的種質(zhì)再次聚類分析，以此類推，直到篩選出對于原始群體保留率較高的核心種質(zhì)。每次抽樣選出的種質(zhì)，運(yùn)用NTsys2.10e 軟件對其進(jìn)行聚類分析；下一次抽樣在該聚類分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行，以此類推。每次抽樣后，均采用POPGENE32 軟件分別對構(gòu)建的初級核心種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，從而評價初級核心種質(zhì)的代表性[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥種質(zhì)的SSR 多態(tài)性分析

由圖1 可知，采用篩選出的12 對多態(tài)性高、條帶清晰、重復(fù)性好的SSR 引物，分別對55 份山藥材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所擴(kuò)增片段大多集中于250～750 bp。

圖1 引物SSR-214 對55 份山藥材料的PCR 擴(kuò)增電泳圖譜

由表2 可知，12 對引物擴(kuò)增條帶數(shù)為6～25，平均每對引物擴(kuò)增出10.70 個條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為6～24，平均10.50。12 對引物共擴(kuò)增出128 個位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為126 個，多態(tài)性比率占98.59%，表明本試驗檢測的55 份山藥資源遺傳多樣性十分豐富，種質(zhì)有一定的代表性，可用于后續(xù)分析。

表2 供試SSR 引物及其擴(kuò)增的多態(tài)性

2.2 SSR 標(biāo)記山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

由表3 可知，經(jīng)POPGENE32 軟件分析得到55 份試驗材料的遺傳多樣性指數(shù)，平均有效等位基因數(shù)（Na）為1.984 4，單個位點(diǎn)平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.420 4，有效等位基因比例為71.58%，平均Nei′s 基因多樣性指數(shù)（He）為0.265 0，單個樣品擴(kuò)增條帶平均Shannon-Wiener 多樣性信息指數(shù)（I）為0.417 2。根據(jù)POPGENE32 軟件分析結(jié)果可知，55 份山藥材料的遺傳相似系數(shù)在0.570～0.898，遺傳距離在0.107 1～0.548 0。

表3 55 份試驗材料的遺傳多樣性指數(shù)

2.3 山藥SSR 標(biāo)記聚類分析

采用NTsys2.10e 軟件中的UPGMA 法，對SSR引物擴(kuò)增出的128 條多態(tài)性條帶進(jìn)行聚類分析，得到聚類分析圖。由圖2 可知，種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.570～0.898，河北保定山藥（22 號）和山東嘉祥細(xì)毛長山藥-1（26 號）遺傳相似系數(shù)相對較大，為0.898，表明其親緣關(guān)系相近；而河南鐵棍山藥-6（14 號）和貴州安順山藥（43 號）、山東嘉祥細(xì)毛山藥-1（13 號）

和貴州山藥（47 號）遺傳相似系數(shù)相對較小，為0.570，表明這些材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

由圖2 可知，在遺傳相似系數(shù)為0.69 處可將55 份山藥種質(zhì)分為兩類，第1 類包括日本山藥-1（1 號）、河北雙胞山藥（8 號）等49 份種質(zhì)，占供試材料的89.09%。進(jìn)一步在遺傳相似系數(shù)為0.74 處可將第1 類大部分種質(zhì)分為5 個亞類，第1 亞類包括日本山藥-1（1 號）等27 份材料；第2 亞類包括江西南城淮山藥（34 號）等7 份材料；第3 亞類包括甘肅山藥（28 號）、山東嘉祥細(xì)毛山藥-3（40 號）和河南淮山藥（41 號）；第4 亞類包括廣東淮山藥（44 號）和云南播樂賴皮山藥（51 號）；第5 亞類包括河南山藥（11 號）等8 份材料。?？谏剿帲?5 號）與江西泰和山藥（33 號）在第1 類中被單獨(dú)聚類，沒有明顯的聚類關(guān)系。第2 類包括西施山藥（5 號）、河南溫縣鐵棍山藥（17 號）、陜西鐵棍山藥（31 號）、河南鐵棍山藥-5（20 號）、山東嘉祥細(xì)毛山藥-1（13 號）和河南鐵棍山藥-6（14 號）共6 份材料。

圖2 55 份試驗材料基于SSR 標(biāo)記的聚類分析

2.4 山藥初級核心種質(zhì)庫的構(gòu)建

通過觀察55 份山藥材料的UPGMA 聚類圖，用最小距離逐步抽樣法（LDSS）構(gòu)建核心種質(zhì)庫，抽樣比例為70%、50%、40%、30%、20%、10%，共抽樣6 次。每次抽樣后構(gòu)建的山藥核心種質(zhì)遺傳多樣性情況見表4。

由表4 可知，每次抽樣后遺傳多樣性參數(shù)雖然總體變化不大，但各個指標(biāo)均有變化。隨著抽樣比例的減少，等位基因數(shù)目（Na）不斷減少，在第4 次（抽樣比率為30%）抽樣后明顯減少。有效等位基因數(shù)目（Ne）在6 次抽樣中不斷緩慢增長。Nei′s 基因多樣性指數(shù)（He）在前5 次抽樣中均有少許增長，在第6 次抽樣時明顯減少。Shannon-Wiener 多樣性信息指數(shù)（I）緩慢增長，在第4 次抽樣后達(dá)到最高值，在第5 次抽樣（抽樣比例為20%）后出現(xiàn)下降的趨勢，第6 次（抽樣比例為10%）明顯下降。多態(tài)位點(diǎn)和多態(tài)位點(diǎn)率從第2 次（抽樣比例為50%）抽樣后呈現(xiàn)下降趨勢。經(jīng)過以上分析，第4 次和第5 次抽樣材料比其他抽樣材料更有代表性，雖然在第5 次抽樣時有效等位基因數(shù)目和Nei′s 基因多樣性指數(shù)均大于第4 次抽樣，但在第4 次抽樣時等位基因數(shù)目、Shannon-Wiener 多樣性信息指數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)和多態(tài)位點(diǎn)率與第5 次相比更接近原始群體，且本試驗所選山藥材料不能涵蓋全部，所以核心種質(zhì)庫數(shù)目太少將降低對原始群體的代表性。綜上所述，確定抽樣比例為30%時構(gòu)建的種質(zhì)庫為SSR分子標(biāo)記的初級核心種質(zhì)庫，圖3 為本試驗構(gòu)建的基于SSR分子標(biāo)記的山藥初級核心種質(zhì)聚類圖。

表4 山藥初級核心種質(zhì)遺傳多樣性

圖3 抽樣4 次構(gòu)建的山藥初級核心種質(zhì)SSR分子標(biāo)記聚類圖

2.5 主坐標(biāo)分析

利用NTsys2.10e 軟件對構(gòu)建的山藥初級核心種質(zhì)庫和留存的備用種質(zhì)進(jìn)行主坐標(biāo)分析，驗證其代表性。由圖4 可知，55 份山藥材料初級核心種質(zhì)在原始群體中分布較分散，基本沒有重疊現(xiàn)象，說明該初級核心種質(zhì)有良好的代表性，可以代表原始群體的遺傳多樣性。

圖4 山藥初級核心種質(zhì)與留存種質(zhì)的主坐標(biāo)分布圖

3 討論與結(jié)論

SSR分子標(biāo)記因檢出率高、操作簡便、引物通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已在植物遺傳多樣性等方面被廣泛應(yīng)用。高玉坤等[23]利用SSR分子標(biāo)記和表型性狀分析了65 個馬鈴薯品種遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)表型性狀容易受環(huán)境因素和人工識別誤差影響，與之相比SSR 標(biāo)記的結(jié)果更為精確。而張燕梅等[24]用劍麻SSR 引物成功在中美麻和絲蘭麻等近緣屬中擴(kuò)增出條帶，證明SSR 引物具有較高通用性。SSR分子標(biāo)記研究山藥遺傳多樣性是可行的。本試驗利用12 對SSR 引物對55 份山藥種質(zhì)DNA 擴(kuò)增條帶進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶126 條，多態(tài)位點(diǎn)率為98.43%，表明山藥種質(zhì)在分子水平上具有豐富的多態(tài)性。

本試驗供試山藥材料的128 條擴(kuò)增條帶平均有效等位基因數(shù)為1.420 4，有效等位基因比例為71.58%，Nei′s 基因多樣性指數(shù)為0.265 0，Shannon-Wiener 多樣性信息指數(shù)為0.417 2，遺傳相似系數(shù)為0.570～0.898。上述指標(biāo)表明了55 份山藥材料豐富的遺傳多樣性。通過聚類分析，河北保定山藥（22 號）和山東嘉祥細(xì)毛長山藥-1（26 號）親緣關(guān)系相對較近，遺傳相似系數(shù)為0.898，從表型性狀上看二者存在一定差別，但在一些優(yōu)良特性上可能有相同的遺傳特性而被種植戶和學(xué)者廣泛引種，這與陳占勇等[25]按山藥花粉形態(tài)分類得到的結(jié)果一致。河南鐵棍山藥-6（14 號）和貴州安順山藥（43 號）、山東嘉祥細(xì)毛山藥-1（13 號）和貴州山藥（47 號）遺傳相似度最小，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。本試驗在遺傳相似系數(shù)為0.69 處可將55 份山藥種質(zhì)分為兩大類群，第1 類包括日本山藥-1（1 號）等49 份材料，第2 類包括西施山藥（5 號）等6 份材料。在遺傳相似系數(shù)為0.74 處可進(jìn)一步將第1 類群大部分種質(zhì)分為5 個亞類。海口山藥（55 號）與江西泰和山藥（33 號）在第1 類群中沒有明顯聚類關(guān)系，分別自成一類。依據(jù)田間觀察的形態(tài)特征[26]，本試驗供試山藥材料中52 份種質(zhì)可歸于普通山藥，剩余第1 類群中的海口山藥（55 號）和第4 亞類的廣東淮山藥（44 號）、云南播樂賴皮山藥（51 號）應(yīng)屬于田薯，說明形態(tài)特征上相似的3 份田薯材料在其SSR分子水平上有一定的差異，而廣東淮山藥和云南播樂賴皮山藥表現(xiàn)出較高的遺傳相似度（0.840），但其在形態(tài)特征上存在差異，這與劉向宇等[21]利用ISSR分子標(biāo)記方法對山藥種質(zhì)資源聚類分析結(jié)果相似。本試驗所選的3 份山東嘉祥細(xì)毛山藥和6 份河南鐵棍山藥雖然都各屬于同一種，但在分子水平上顯現(xiàn)出了一定差異，山東嘉祥細(xì)毛山藥-1（13 號）與山東嘉祥細(xì)毛山藥-3（40 號）親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.594，而與河南鐵棍山藥-6（14 號）聚為一類，相似程度較高；河南鐵棍山藥-6（14 號）與河南鐵棍山藥-3（18 號）親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)同為0.625。從本試驗構(gòu)建的初級核心種質(zhì)聚類結(jié)果（圖5）看，日本山藥-1（1 號）與河北麻山藥-2（30 號）、內(nèi)蒙古羅家營山藥（29 號）與河北安平白山藥（36 號）親緣關(guān)系相近，但并未根據(jù)來源地聚為一類；西施山藥（5 號）與?？谏剿帲?5 號）分別單獨(dú)聚類，為較特殊種質(zhì)。上述情況可能是3 種原因造成的：由于山藥材料栽植環(huán)境不同，為適應(yīng)環(huán)境其基因發(fā)生突變導(dǎo)致個體之間出現(xiàn)了差異；不同地區(qū)頻繁品種交流導(dǎo)致品種間出現(xiàn)混雜現(xiàn)象；也可能是本試驗采用的SSR分子標(biāo)記較少，未能反映較完整的情況，具體原因有待研究。

構(gòu)建核心種質(zhì)庫是目前研究種質(zhì)資源的重點(diǎn)，李自超等[27]研究認(rèn)為，核心種質(zhì)應(yīng)是動態(tài)變化的，取樣策略很關(guān)鍵，應(yīng)據(jù)具體物種而定。本試驗采用最小距離逐步抽樣法構(gòu)建核心種質(zhì)。觀察聚類分析圖多次抽樣并分析其遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)除多態(tài)性比率較抽樣前明顯降低外，其余指標(biāo)變化較小，Nei′s 基因多樣性指數(shù)（He）和Shannon-Wiener 多樣性信息指數(shù)（I）在第5 次和第4 次抽樣后達(dá)到最高值。第4 次抽樣的比率為30%，Nei′s 基因多樣性指數(shù)、Shannon-Wiener 多樣性信息指數(shù)分別為0.278 7 和0.433 1，高于Nybom 基于RAPD 和ISSR 等顯性標(biāo)記統(tǒng)計的多種植物種群水平的遺傳多樣性平均值（0.22）[28]，且多態(tài)位點(diǎn)比率和等位基因數(shù)的保留率均達(dá)到抽樣前的90%以上，符合核心種質(zhì)資源代表性為70%～80%的要求[29]，綜合種質(zhì)庫數(shù)目分析后最終確定抽樣4 次為初級核心種質(zhì)，包含17 份山藥材料，海口山藥（55 號）、西施山藥（5 號）可在今后的山藥育種工作中作為重要種質(zhì)加以利用。同時本試驗構(gòu)建的初級核心種質(zhì)可為山藥種質(zhì)資源的管理、利用以及新品種的選育提供指導(dǎo)。