韓 麗，李立軍，趙 舉，張艷麗，尹春艷，，沙 松

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3.呼倫貝爾農(nóng)墾集團(tuán)三河農(nóng)牧場(chǎng)有限公司，內(nèi)蒙古三河 022256）

土壤是土地生產(chǎn)力的基礎(chǔ)，地下環(huán)境的差異影響著地上群落?！巴寥澜】怠庇蒁ORAN 等[1]最先提出，強(qiáng)調(diào)土壤具有較高水平的質(zhì)地和可持續(xù)能力[2-3]。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)指標(biāo)在過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間被用來(lái)判斷土壤質(zhì)量?jī)?yōu)劣[4]，隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物學(xué)指標(biāo)漸漸進(jìn)入人們視野，研究表明，微生物多樣性較高的土壤能為地上植株帶來(lái)更高的生產(chǎn)力，對(duì)環(huán)境脅迫也具有一定的抵抗能力[5-6]。土壤微生物種類(lèi)繁多，但細(xì)菌和真菌在土壤微生物中占據(jù)重要地位。土壤真菌作為重要的分解者，參與土壤養(yǎng)分循環(huán)和轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而改善土壤肥力以及土壤質(zhì)量[7]。

內(nèi)蒙古農(nóng)牧交錯(cuò)帶是我國(guó)北方重要的陸地生態(tài)系統(tǒng)，耕地和草地兩種土地利用方式構(gòu)成其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境[8-10]。在脆弱敏感的生態(tài)環(huán)境下，土壤質(zhì)量提升顯得尤為關(guān)鍵。通過(guò)對(duì)兩種土地利用方式下的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究，可以在一定程度上了解和明確關(guān)鍵物種，對(duì)提高微生物多樣性及土壤質(zhì)量、改善生產(chǎn)力具有重要意義[11]。然而，相關(guān)研究均在森林[12]、草原[13]、山地[14]等單一生態(tài)系統(tǒng)或局域樣地水平上進(jìn)行。對(duì)于大尺度范圍下的耕地和草地兩種土地利用方式下，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性變化尚不明確。因此，本研究通過(guò)采集多區(qū)域農(nóng)田與相鄰草地土壤樣品，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析其土壤真菌多樣性，進(jìn)一步明確內(nèi)蒙古農(nóng)田與草地兩種生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)長(zhǎng)期演化的土壤真菌結(jié)構(gòu)及多樣性分布特征，進(jìn)而從土壤微生物角度出發(fā)，為內(nèi)蒙古農(nóng)牧交錯(cuò)帶土壤微生物多樣性研究以及土壤質(zhì)量提升提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)主要為內(nèi)蒙古農(nóng)牧交錯(cuò)帶，包括大興安嶺北麓、大興安嶺南麓、西遼河平原、燕山丘陵區(qū)、陰山北麓、土默川平原、黃土高原和河套平原8 個(gè)有大面積農(nóng)田與草地分布的生態(tài)區(qū)。全樣帶氣候條件復(fù)雜，橫跨半濕潤(rùn)、半干旱和干旱氣候帶，以溫帶大陸性季風(fēng)氣候?yàn)橹?，樣帶以干旱農(nóng)田和溫帶草原區(qū)為主，從東到西主要的土壤類(lèi)型有黑鈣土、風(fēng)沙土、栗鈣土、草甸土、棕鈣土。

1.2 土壤樣品的采集

于2019年7—8月作物生長(zhǎng)旺盛期，采集不同地區(qū)農(nóng)田土壤與相鄰自然草地土壤。由于大興安嶺南北麓區(qū)域跨度較大，在南麓和北麓各設(shè)1 個(gè)樣地，以縮小經(jīng)緯跨度間的差異。農(nóng)田均選自當(dāng)?shù)刂髟宰魑锴颐娣e超過(guò)2 hm2的樣區(qū)，在每個(gè)樣區(qū)設(shè)4 個(gè)1 m×1 m 的樣方，草地土壤設(shè)置4 個(gè)30 cm×30 cm的樣方。每個(gè)樣方內(nèi)根據(jù)植株根系大小，去除地表板結(jié)的部分，采用對(duì)角線取樣法采集根層0～20 cm 處土壤樣品，保存于滅菌的密封袋中，置于冰袋中冷藏迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱，供土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析。樣地基本信息見(jiàn)表1。所選不同研究區(qū)采樣點(diǎn)均無(wú)明顯坡度變化。

1.3 高通量測(cè)序

使用OMEGA 試劑盒，提取微生物組樣本總DNA，同時(shí)采用熒光分光光度計(jì)，在260 nm 和280 nm 處分別測(cè)定DNA 吸光值，檢測(cè)DNA 濃度，并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量。針對(duì)樣本采用18S rRNA 基因ITS-V1 區(qū)引物（正向：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；反向：GCTGCGTT CTTCATCGATGC）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，并對(duì)DNA 進(jìn)行純化（磁珠純化）與定量。

上機(jī)測(cè)序前，需要對(duì)文庫(kù)在LabChip 上進(jìn)行質(zhì)檢，合格的文庫(kù)只有單一峰值，且無(wú)接頭。在熒光定量系統(tǒng)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，合格的文庫(kù)濃度應(yīng)在3 nmol/L 以上。將合格的各上機(jī)測(cè)序文庫(kù)梯度稀釋后，根據(jù)所需測(cè)序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，使用NovaSeq 測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序原始數(shù)據(jù)運(yùn)用QIIME2 平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，利用DADA2 進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾、降噪、拼接、嵌合體去除與聚類(lèi)。利用QIIME2 平臺(tái)和R 語(yǔ)言軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到每個(gè)ASV 對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息。然后進(jìn)行稀釋曲線分析，比較農(nóng)田和草地土壤在門(mén)級(jí)別分類(lèi)水平下真菌群落組成差異，基于ASV 聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)的共有分析，使用未抽平的ASV 表，進(jìn)行隨機(jī)森林分析及巢式分層交叉檢驗(yàn)。運(yùn)用R 語(yǔ)言軟件基于UniFrac 距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）。農(nóng)田與草地土壤真菌多樣性（包括Shannon-Wiener、Simpson 多樣性指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)）差異運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行區(qū)域間單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤真菌物種組成分析

2.1.1 土壤樣品測(cè)序結(jié)果

所有已鑒別的土壤真菌隸屬7 門(mén)20 綱43 目76 科123 屬123 種，根據(jù)樣品覆蓋率指數(shù)結(jié)果繪制稀釋曲線（圖1），可以看出各地區(qū)農(nóng)田與草地土壤樣品OTU 隨著測(cè)序片段增加而迅速增加，達(dá)到峰值后保持穩(wěn)定，表明測(cè)序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本包含的物種。

圖1 農(nóng)田與草地土壤真菌物種稀釋曲線

2.1.2 門(mén)水平下真菌群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)農(nóng)田土壤真菌群落組成（圖2a），相對(duì)豐度排在前十的真菌門(mén)分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān) 子 菌 門(mén)（Basidiomycota）、 被 孢 霉 門(mén)（Mortierellomycota）、油壺菌門(mén)（Olpidiomycot）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）、毛霉菌門(mén)（Mucoromycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、 捕蟲(chóng)霉亞菌門(mén)（Zoopagomycota）、芽枝霉菌門(mén)（Blastocladiomycota）、羅茲菌門(mén)（Rozellomycota）；其中，子囊菌門(mén)相對(duì)豐度E 區(qū)最高，為81.58%；擔(dān)子菌門(mén)在B 區(qū)豐度達(dá)36.44%；被孢霉門(mén)在G 區(qū)豐度最高，為11.17%。這3 個(gè)菌門(mén)在不同區(qū)域均有分布，而油壺菌門(mén)僅在A區(qū)和H 區(qū)分布，且在A 區(qū)豐度高達(dá)41.58%，這與土壤地上植被有很大關(guān)系，可見(jiàn)，油菜等油料作物多有油壺菌門(mén)的存在。其他菌門(mén)在B、G、H 區(qū)豐度分別為12.56%、12.12%、12.20%。

從草地土壤真菌群落分布來(lái)看（圖2b），相對(duì)豐度前十的菌門(mén)分別為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、被孢霉門(mén)、壺菌門(mén)、球囊菌門(mén)、油壺菌門(mén)、毛霉菌門(mén)、羅茲菌門(mén)、芽枝霉菌門(mén)、捕蟲(chóng)霉亞菌門(mén)；與農(nóng)田土壤不同的是，草地土壤中比重較小的菌門(mén)排序有所改變。子囊菌門(mén)在G 區(qū)最高，為76.58%；擔(dān)子菌門(mén)在H 區(qū)最高，達(dá)48.12%；被孢霉門(mén)在D 區(qū)最高，達(dá)24.85%。農(nóng)田土壤子囊菌門(mén)和被孢霉門(mén)總豐度高于草地土壤，而草地土壤擔(dān)子菌門(mén)總豐度高于農(nóng)田土壤，且其他菌門(mén)在各地區(qū)土壤間相對(duì)豐度均表現(xiàn)為草地高于農(nóng)田。

圖2 農(nóng)田與草地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度

2.2 土壤真菌多樣性分析

2.2.1 土壤真菌α 多樣性分析

由表2 可知，樣品覆蓋率均為0.99，結(jié)合稀釋曲線（圖1）以及區(qū)域分布范圍（表1）可知，測(cè)序結(jié)果基本能夠反映各區(qū)域真菌群落分布情況。Chao1 指數(shù)反映了物種豐富度，Shannon-Wiener 指數(shù)和Simpson 指數(shù)共同決定著微生物均勻度，Simpson 指數(shù)適用于簡(jiǎn)單群落；Shannon-Wiener 指數(shù)更適用于復(fù)雜群落。不同區(qū)域農(nóng)田真菌α 多樣性指數(shù)顯示（表2），B 區(qū)農(nóng)田土壤Chao1 指數(shù)顯著（P＜0.05）高于其他區(qū)，為926.53，而H 區(qū)顯著（P＜0.05）高于A、C、D、E、F、G 區(qū)，其余區(qū)域間差異不顯著（P＞0.05），為359.84～509.29；Shannon-Wiener 指數(shù)和Simpson 指數(shù)表現(xiàn)出A 區(qū)顯著低于（P＜0.05）其他區(qū)域的趨勢(shì)。從草地土壤真菌多樣性指數(shù)來(lái)看，B、F 區(qū)Chao1 指數(shù)顯著高于其他區(qū)域，分別為1 088.41、1 041.50，D區(qū)最低，為324.39；Shannon-Wiener 指數(shù)在區(qū)域間有顯著差異（P＜0.05），分布在4.82（H 區(qū)）～7.32（B 區(qū)）；Simpson 指數(shù)H 區(qū)草地土壤低于其他區(qū)域，在其余區(qū)域間差異不顯著（P＞0.05）。綜合各區(qū)域多樣性指數(shù)，農(nóng)田土壤多樣性指數(shù)在區(qū)域間由高到低為B>H>F>E>G>D>C>A；草地土壤多樣性指數(shù)在區(qū)域間由高到低為B>F>G>H>E>C>A>D，說(shuō)明大興安嶺南麓與河套平原農(nóng)田土壤真菌多樣性較高，大興安嶺南麓與土默川平原草地土壤真菌多樣性較高。

表2 真菌群落α 多樣性指數(shù)特征

將不同區(qū)域土壤樣品分為農(nóng)田和草地兩種土地利用類(lèi)型后，對(duì)各樣區(qū)多樣性指數(shù)進(jìn)行平均，土壤Chao1 指數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)和Simpson 指數(shù)表現(xiàn)出一致規(guī)律，平均值均為草地土壤大于農(nóng)田土壤，說(shuō)明草地土壤物種數(shù)目明顯高于農(nóng)田土壤。

2.2.2 土壤真菌群落β 多樣性分析

農(nóng)田土壤PCoA 分析顯示（圖3a），第一、二主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為17.4%、13.4%，兩個(gè)主成分共解釋了總變異的30.8%。各樣品在由PCo1 與PCo2 組成的二維圖上呈現(xiàn)明顯的空間差異：PCo1將A 區(qū)土壤與其他區(qū)域土壤明顯分為兩區(qū)，PCo2 將A、B、C、D 區(qū)土壤與E、F、G、H 區(qū)土壤明顯分開(kāi)。從草地土壤PCoA 分析來(lái)看（圖3b），第一、二主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為11.8%、8.9%，兩個(gè)主成分共解釋了總變異的20.8%。PCo1 將A、D、E、H 區(qū)土壤與B、C、F、G 區(qū)土壤明顯分開(kāi)，PCo2 將C、E、H 區(qū)土壤與A、D、F 區(qū)土壤明顯分開(kāi)。農(nóng)田土壤在群落相似度上呈現(xiàn)出組間差異，組內(nèi)差異較小；草地土壤組內(nèi)差異相比農(nóng)田土壤變異率更大，組間差異無(wú)明顯分布規(guī)律，各群落間差異較大，僅B、C、F、G 4 個(gè)區(qū)域草地土壤真菌群落較為相似。

圖3 農(nóng)田與草地土壤真菌群落主成分分析

2.3 土壤真菌物種差異分析

2.3.1 不同區(qū)域土壤OTU 水平分析

由圖4 可知，不同區(qū)域間OTU 數(shù)差異明顯。農(nóng)田土壤（圖4a）共有OTU 數(shù)為43，草地土壤（圖4b）共有OTU 數(shù)為17；對(duì)各地區(qū)進(jìn)行比較，農(nóng)田中B 區(qū)土壤OTUs 最多為1 706，各區(qū)域農(nóng)田土壤OTUs 從高到低依次為B>H>F>G>E>A>C>D；草地土壤OTUs 在B 區(qū)最高達(dá)1 802，各區(qū)域從高到低依次為B>F>E>D>A>H>G>C。整體來(lái)看，草地土壤真菌類(lèi)群相對(duì)豐富，農(nóng)田土壤真菌類(lèi)群相對(duì)較少，草地土壤較農(nóng)田土壤組間差異更大；B 區(qū)土壤相比其他區(qū)域來(lái)說(shuō)物種更為豐富。

圖4 農(nóng)田、草地土壤真菌OTU 分類(lèi)花瓣圖

2.3.2 不同區(qū)域土壤真菌隨機(jī)森林分析

圖5 為各區(qū)域中門(mén)水平下物種的豐度分布。從上到下，物種對(duì)模型的重要性依次遞減，可以認(rèn)為這些重要性靠前的物種是組間差異的標(biāo)志物種。決定農(nóng)田土壤真菌群落差異的重要物種依次為擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)、子囊菌門(mén)、壺菌門(mén)、被孢霉門(mén)、球囊菌門(mén)、毛霉菌門(mén)，這些菌門(mén)重要值由0.148 至0.074 依次降低（圖5a）。草地土壤中的差異物種重要值在0.067～0.135（圖5b），從大到小依次為擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)、球囊菌門(mén)、被孢霉門(mén)、子囊菌門(mén)、羅茲菌門(mén)、壺菌門(mén)、毛霉菌門(mén)。擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)和子囊菌門(mén)是農(nóng)田土壤真菌組間差異的標(biāo)志物種（重要值>0.12），而草地土壤真菌組間差異的標(biāo)志物種（重要值>0.12）分別為擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)、球囊菌門(mén)和被孢霉門(mén)。

圖5 農(nóng)田與草地物種差異熱圖

3 討論

有研究表明，真菌相比細(xì)菌數(shù)量類(lèi)群要少，但真菌在土壤微環(huán)境中的作用十分重要[15]。從內(nèi)蒙古農(nóng)牧交錯(cuò)帶土壤真菌群落結(jié)構(gòu)來(lái)看，各區(qū)域群落組成無(wú)顯著規(guī)律，但在不同作物及不同土地利用方式上體現(xiàn)出顯著差異，SHANG 等[16]的研究也表明，在群落演替過(guò)程中，土壤微生物群落組成和多樣性受植物多樣性和土壤理化性質(zhì)的顯著影響。農(nóng)田與草地土壤的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和被孢霉門(mén)，這與其他農(nóng)田或草地真菌群落構(gòu)成的研究相似[17-19]，說(shuō)明內(nèi)蒙古農(nóng)牧交錯(cuò)帶土壤真菌群落在門(mén)水平下，菌群豐度在不同生境類(lèi)型及同一生境不同區(qū)域間均有差異，其相對(duì)豐度受不同生態(tài)類(lèi)型以及不同作物種類(lèi)的影響較大[20]，群落構(gòu)成反映出土壤真菌種類(lèi)集中于已知的幾個(gè)大類(lèi)群，草地土壤其他菌門(mén)豐度總是高于農(nóng)田土壤，因此，對(duì)草地土壤真菌資源開(kāi)發(fā)研究?jī)r(jià)值高于農(nóng)田土壤。在油菜田中發(fā)現(xiàn)，油壺菌門(mén)占據(jù)很高的豐度，但在油菜綠肥還田的研究中[21]，油壺菌門(mén)并未出現(xiàn)在真菌群落優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中，說(shuō)明油壺菌門(mén)僅存在于油料作物生長(zhǎng)季，并不能在綠肥中體現(xiàn)。在兩種土地利用方式下，農(nóng)田土壤子囊菌門(mén)和被孢霉門(mén)總豐度高于草地，子囊菌門(mén)在真菌群落中存在數(shù)量最多，大多數(shù)為腐生菌，含有纖維素和木質(zhì)素分解酶，可以將養(yǎng)分有效地分解為易吸收物質(zhì)[22]。一些研究表明，被孢霉門(mén)多數(shù)存在于健康土壤中，屬于有益真菌[23-24]?？梢?jiàn)，施肥為農(nóng)田土壤提供大量養(yǎng)分供其分解，可提高土壤有益真菌的豐度。馬欣等[25]在黃土高原的研究表明，農(nóng)田土壤擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于紫花苜蓿土壤，是因?yàn)閭鹘y(tǒng)耕作措施提高了農(nóng)田土壤中的木質(zhì)素含量，從而增加了擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度。本研究中草地土壤擔(dān)子菌門(mén)總豐度高于農(nóng)田，農(nóng)田翻耕等措施并未提高木質(zhì)素等的分解率，而草地土壤的擾動(dòng)較小，土壤中富集大量凋落物，一定程度上提高了擔(dān)子菌門(mén)的豐度。

本研究表明，草地土壤真菌多樣性指數(shù)高于農(nóng)田土壤。此前，有研究證明，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)相比草地生態(tài)系統(tǒng)受人為干擾大，導(dǎo)致其土壤微生物多樣性低于草地土壤[26-28]。但在一些研究中存在相反結(jié)論，認(rèn)為農(nóng)業(yè)實(shí)踐頻繁干擾有助于保持土壤微生物多樣性和系統(tǒng)的抗逆性[29]。綜合比較各區(qū)域土壤真菌多樣性發(fā)現(xiàn)，大興安嶺南麓農(nóng)田和草地土壤多樣性均表現(xiàn)較高。長(zhǎng)期耕作環(huán)境對(duì)微生物群落組成會(huì)有影響，但不會(huì)影響群落功能，且農(nóng)田和草地還存在一種微妙的關(guān)聯(lián)[30]，這使得各區(qū)域農(nóng)田與草地真菌多樣性高低表現(xiàn)出相同趨勢(shì)。從土壤群落分布可以看出，農(nóng)田土壤主要受到作物類(lèi)型與地理位置影響，呈明顯差異。而草地土壤真菌群落變異率較大，分布較松散，PAN 等[31]研究同樣證實(shí)，草地真菌網(wǎng)絡(luò)連通性較低。復(fù)雜的土壤環(huán)境導(dǎo)致草地真菌群落的分布差異，多種因素調(diào)控其群落變化[32]。擔(dān)子菌門(mén)和油壺菌門(mén)均為兩種生態(tài)系統(tǒng)的標(biāo)志差異物種，而子囊菌門(mén)是影響農(nóng)田的重要真菌；球囊菌門(mén)和被孢霉門(mén)是造成草地土壤差異的重要真菌，這些核心類(lèi)群在維持群落功能方面發(fā)揮著重要作用。真菌群落與土壤環(huán)境密切相關(guān)，對(duì)土壤因子與菌種的關(guān)系進(jìn)一步探究，能間接反映土壤質(zhì)量，采取措施能有效提高土壤微生物多樣性。

4 結(jié)論

內(nèi)蒙古農(nóng)牧交錯(cuò)帶農(nóng)田和草地土壤優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)均為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、被孢霉門(mén)；農(nóng)田土壤子囊菌門(mén)和被孢霉門(mén)總豐度高于草地土壤，草地土壤擔(dān)子菌門(mén)總豐度高于農(nóng)田，且各區(qū)域草地未知菌門(mén)的豐度均高于農(nóng)田。土壤α 多樣性指數(shù)分析表明，草地土壤多樣性指數(shù)高于農(nóng)田土壤。大興安嶺南麓農(nóng)田和草地土壤多樣性指數(shù)均較高。土壤β 多樣性指數(shù)分析表明，農(nóng)田土壤受地上植株和地理位置影響明顯；而草地土壤組內(nèi)變異率較大，組間無(wú)明顯分布規(guī)律。隨機(jī)森林分析表明，擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)和子囊菌門(mén)（重要值>0.12）是農(nóng)田土壤真菌組間差異的標(biāo)志物種，而草地土壤真菌組間差異的標(biāo)志物種（重要值>0.12）分別為擔(dān)子菌門(mén)、油壺菌門(mén)、球囊菌門(mén)和被孢霉門(mén)。