薛慶麗，李延玲，郭瑞霞

河北省邯鄲市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北邯鄲 056601

肺癌是成人中最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO) 2020年統(tǒng)計，肺癌新增病例數(shù)和死亡人數(shù)仍然是處于高速增長狀態(tài)[1]。非小細胞肺癌是肺癌的主要類型，約占肺癌總數(shù)的85%。大多數(shù)肺癌患者在首次確診時已經(jīng)處于疾病晚期，失去手術(shù)的機會[2]。早發(fā)現(xiàn)、早治療仍然是提高肺癌患者遠期生存的關(guān)鍵。黃祥奇等[3]研究得出，循環(huán)腫瘤細胞(CTC)在非小細胞肺癌中的檢出率較高，并且與臨床病理有一定關(guān)系，可為非小細胞肺癌篩查提供一種參考手段，也可作為臨床分期的一個潛在附加指標。CTC是指自發(fā)地或因醫(yī)源性原因存在于外周血液中的腫瘤細胞[4]。朱洪斌等[5]研究結(jié)果顯示，上皮細胞轉(zhuǎn)化序列2(ECT2)通過改變組織架構(gòu)激活腫瘤通道和DNA損壞參與腫瘤進程。ECT2已被證實在多種惡性腫瘤中表達異常，如胃癌、乳腺癌、骨癌等，但是，其在肺癌患者血液中的表達情況及與患者臨床病理資料之間的關(guān)系尚未闡明。ECT2主要參與鳥嘌呤核苷酸交換，誘導(dǎo)細胞有絲分裂和增殖[6]。謝景臣等[7]研究表明，微小核糖核酸-411(miR-411)表達在肺癌中顯著上調(diào)，通過生存分析，他們發(fā)現(xiàn)具有較高miR-411表達水平的患者與較差的總體存活率相關(guān)。此外，姜貽乾等[8]研究表明，miR-411的表達通過靶向腫瘤抑制基因FOXOI促進肺癌的細胞增殖。目前臨床中鮮見CTC、ECT2、miR-411聯(lián)合檢測診斷非小細胞肺癌的相關(guān)研究，所以本研究旨在探討非小細胞肺癌患者CTC及肺癌組織中ECT2、miR-411的表達及各指標的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年2月至2021年2月在本院進行肺切除術(shù)的非小細胞肺癌患者53例。53例非小細胞肺癌患者中男28例， 女25例；年齡22～79歲，平均(49.89±9.70)歲；有吸煙史33例，無吸煙史20例；病程0.8～3.0年；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)19～27 kg/m2；病理分期:按國際TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期19例，Ⅲ期13例；腫瘤最大徑：≤ 2 cm 28例，>2 cm 25例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21 例。全部非小細胞肺癌患者病例均經(jīng)病理證實，并且有細胞學(xué)診斷和影像學(xué)診斷證明。選擇同期在本院進行氣管鏡活檢或者CT引導(dǎo)穿刺術(shù)診斷為肺良性病變的患者52例。52例肺良性病變患者中男 29例， 女23例；年齡23～80歲，平均(52.57±12.20)歲；病程0.7～3.0年；BMI 20～27 kg/m2；有吸煙史33例，無吸煙史19例；結(jié)核瘤29例，炎性假瘤17例，機化肺炎6例。非小細胞肺癌和肺良性病變患者的性別、年齡、病程、BMI、吸煙情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。本研究所有患者及其家屬均知情同意。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準。

納入標準：(1)非小細胞肺癌符合《NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》[9]中相關(guān)診斷標準，且病理及臨床診斷為非小細胞肺癌；(2)肺良性病變通過氣管鏡活檢或CT引導(dǎo)穿刺術(shù)等病理及臨床診斷排除惡性腫瘤；(3)氣管鏡活檢、CT引導(dǎo)穿刺術(shù)或者手術(shù)前未接受任何放射治療和化學(xué)治療。

排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)精神異常；(3)妊娠期、哺乳期女性；(4)進行肺癌切除手術(shù)前接受放射治療、化學(xué)治療以及生物學(xué)療法。

1.2方法

1.2.1采集肺組織 非小細胞肺癌患者均接受肺癌切除術(shù)治療，術(shù)中標本離體后，橫切腫瘤組織，分別取 1 cm×1 cm× 1 cm 的癌中心組織，以及距離腫瘤邊緣 5 cm 以上的離體癌旁正常肺組織(1 cm×1 cm×1 cm)。組織切取后放入液氮中冷凍并一直保存在液氮中待用。肺良性病變患者通過氣管鏡活檢，CT引導(dǎo)穿刺術(shù)取的標本后也放入液氮中冷凍并一直保存在液氮中待用。

1.2.2熒光定量PCR檢測miR-411表達量 分別取0.1 cm×0.1 cm非小細胞肺癌組織標本及其配對的癌旁組織和肺良性病變肺組織在組織勻漿器研碎后，利用Trizol提取RNA的方法分別提取3種組織標本的總RNA，利用酶標儀(Beckman公司生產(chǎn))測定其水平。將總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn))說明書反轉(zhuǎn)為 cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30 ℃ 20 min，35 ℃ 30 min，75 ℃ 10 min。使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物。正向引物序列為5′-UAGUAGACCGUAUAGCGUACG-3′，反向引物序列為5′-GAACTGCGTGGAGCTCCACCTT-3′，內(nèi)參為U6序列。利用熒光定量PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))，設(shè)置擴增條件:95 ℃ 30 s、85 ℃ 35 s、75 ℃ 20 s,40個循環(huán)，分析各樣品的循環(huán)閾值(Ct值)；其余步驟按試劑盒說明書[miRcute 增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)]進行操作。采用2-ΔΔCt方法計算miR-411的相對表達量。

1.2.3免疫印跡技術(shù)檢測ECT2表達量 分別取非小細胞肺癌組織及其配對的癌旁組織和肺良性病變組織在勻漿器研碎，利用蛋白提取試劑盒(Solarbio)提取各個組織的總蛋白，并將總蛋白溶于SDS凝膠加樣緩沖液，4 ℃，13 000×g離心15 min，取上清液作為上樣樣品，同時以β-actin作為內(nèi)參樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后，取出凝膠并用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡3次。通過轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)染完成后將NC膜放入膜染色液中50 s后，在50%甲醇中脫色，然后用雙蒸水洗，保存，與顯色結(jié)果作對比。被轉(zhuǎn)印到膜上的靶抗原與抗體反應(yīng)、與酶標第二抗體反應(yīng)，用酶相應(yīng)的蛋白信號進行檢測，具體步驟按照說明書進行操作。然后分析ECT2在各肺組織中的表達量。

1.2.4CTC測定 分別采集非小細胞肺癌患者和肺良性病變患者的外周血 10 mL，將其置于專門的CTC采集管中，并進行標記。將 7.5 mL血液標本加入 Cell Tracks Auto Prep 錐形管當中，繼續(xù)加入 6.5 mL 稀釋的1×hCTC緩沖液，均勻搖晃后進行離心操作。CTC檢測試劑盒購自賽特公司，嚴格按照試劑盒說明書檢測CTC。

2 結(jié) 果

2.1miR-411、ECT2在不同肺組織中表達水平的比較 非小細胞肺癌組織miR-411、ECT2表達水平均高于癌旁組織、肺良性病變肺組織(P<0.05)。癌旁組織miR-411、ECT2表達水平均低于肺良性病變肺組織(P<0.05)。見表1。

表1 miR-411、ECT2在不同肺組織中表達水平的比較

2.2CTC在非小細胞肺癌患者和肺良性病變患者血液中的數(shù)量 53例非小細胞肺癌患者每7.5 mL血液CTC數(shù)量為(7.90±0.64)個，明顯高于肺良性病變患者的(1.00±0.73)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3CTC及肺組織miR-411、ECT2水平在不同臨床病理特征的非小細胞肺癌患者中的差異 不同性別、年齡(≤50、>50歲)、腫瘤最大徑(≤2 cm、>2 cm)的非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量及肺癌組織miR-411、ECT2表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。臨床分期Ⅲ期的非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量及肺癌組織miR-411、ECT2表達水平均高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05)；低分化非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量及肺癌組織miR-411、ECT2表達水平均低于高分化患者(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量及肺癌組織miR-411、ECT2表達水平均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者(P<0.05)。見表2。

2.4miR-411、ECT2、CTC對非小細胞肺癌的診斷價值 ROC曲線分析顯示，CTC、ECT2、miR-411單項及聯(lián)合檢測診斷非小細胞肺癌的曲線下面積(AUC)分別為0.542、0.531、0.589、0.748。見表3。

表2 miR-411、ECT2及CTC在不同臨床病理特征的非小細胞肺癌患者中的表達

續(xù)表2 miR-411、ECT2及CTC在不同臨床病理特征的非小細胞肺癌患者中的表達

表3 miR-411、ECT2、CTC診斷非小細胞肺癌的效能分析

2.5非小細胞肺癌患者CTC與肺癌組織miR-411、ECT2水平的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，CTC與肺癌組織ECT2水平呈正相關(guān)(r=0.773，P=0.001)；肺癌組織miR-411與ECT2水平呈正相關(guān)(r=0.779，P=0.001)；CTC與肺癌組織miR-411水平呈正相關(guān)(r=0.667，P=0.001)。

3 討 論

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第1位[10]。引起非小細胞肺癌的主要因素有吸煙(最重要的高危因素)、職業(yè)環(huán)境(長期處在工業(yè)廢氣中易引起)、電離輻射、既往肺部慢性感染(如肺結(jié)核、支氣管擴張，但是較為少見)、遺傳因素(家族聚集、遺傳易感性以及免疫功能降低，代謝、內(nèi)分泌失調(diào)等均有可能)、大氣污染(石油、煤、內(nèi)燃機等燃燒產(chǎn)生的有毒物質(zhì))[11]。非小細胞肺癌是肺癌的主要類型，按照組織病理學(xué)分型主要為腺癌和鱗癌，但是患者在確診的時候大多已經(jīng)是晚期，失去了手術(shù)的最佳時期[12]。

CTC是從腫瘤組織中脫離出來的腫瘤細胞，通過血管內(nèi)壁進入血液循環(huán)，進行遠處播散和轉(zhuǎn)移[13]。近年的多項研究表明，干細胞特性的CTC具有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力，是肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸、肺癌等惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要始動因素，在臨床分期中具有潛在應(yīng)用價值，可預(yù)測多種實體瘤的預(yù)后[14-15]。本研究顯示，非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量明顯高于肺良性病變患者。非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量與患者的臨床分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。臨床分期高、分化程度低的非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量高于臨床分期低、分化程度高的患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，CTC診斷非小細胞肺癌的AUC為0.589，可以作為診斷非小細胞肺癌的指標。

ECT2蛋白C端含有2個結(jié)構(gòu)域，即具有催化活性的DH結(jié)構(gòu)域和行使功能的PH結(jié)構(gòu)域[16]。研究表明，ECT2是一種鳥嘌呤核苷酸解離交換因子(RhoGEF)，能促進結(jié)合狀態(tài)的GDP解離以及GTP對CDP的替換，從而激活細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的Ras相似物CTP酶，影響惡性轉(zhuǎn)型以及腫瘤細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面[17-18]。本研究結(jié)果顯示，非小細胞肺癌患者肺癌組織中ECT2水平高于其配對的癌旁組織和肺良性病變肺組織中的ECT2水平。ECT2水平與非小細胞肺癌患者臨床分期有關(guān)，臨床分期高的患者ECT2水平高于臨床分期低的患者。同樣，ECT2在非小細胞肺癌組織中的水平在不同分化程度、淋巴是否轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者中有差異。分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者肺癌組織 ECT2表達水平高于分化程度高、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。

miRNA在細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡起著重要作用，miRNA可作為腫瘤抑癌基因，亦可作為腫瘤啟動子[19]。本研究結(jié)果顯示，非小細胞肺癌組織中miR-411水平高于其配對癌旁組織和肺良性病變肺組織，在不同臨床分期、不同分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者中存在差異。ROC曲線分析顯示，miR-411 可用于非小細胞肺癌的診斷。miR-411參與了非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可以作為臨床血清腫瘤標志物[20]。

綜上所述，miR-411、ECT2在非小細胞肺癌組織中的水平均高于其配對癌旁組織和肺良性病變肺組織，非小細胞肺癌患者CTC數(shù)量明顯高于肺良性病變患者，CTC及非小細胞肺癌組織中miR-411、ECT2水平在不同臨床分期、不同分化程度、是否淋巴轉(zhuǎn)移的患者中有差異，本研究為臨床非小細胞肺癌早期診斷提供臨床依據(jù)。但是本研究樣本量較少，還需進一步研究。