張雅靜 綜述，李劭昱 審校

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科,新疆烏魯木齊 830011

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)主要利用質(zhì)譜圖中的特征峰對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定和分類。MALDI-TOF MS由基質(zhì)輔助激光解吸離子源和飛行時(shí)間質(zhì)量探測(cè)器組成，即MALDI+TOF。其原理為標(biāo)本與基質(zhì)混合點(diǎn)于金屬靶板上并出現(xiàn)結(jié)晶析出的現(xiàn)象，激光照射結(jié)晶后，基質(zhì)獲得能量發(fā)生汽化、降解并與標(biāo)本吸附解離，基質(zhì)和標(biāo)本間進(jìn)行電荷轉(zhuǎn)移，標(biāo)本分子獲得質(zhì)子成為離子，于電場(chǎng)之中，標(biāo)本離子飛速運(yùn)動(dòng)、聚焦，最終進(jìn)入飛行時(shí)間探測(cè)器，離子的質(zhì)荷比和飛行時(shí)長(zhǎng)的平方之比為常數(shù)，根據(jù)飛行時(shí)長(zhǎng)能夠探測(cè)到不同質(zhì)荷比的離子，用最終獲得的質(zhì)譜圖區(qū)分和鑒別不同微生物。目前，MALDI-TOF MS在微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域已取得較好的應(yīng)用效果。CLARK等[1]提出，MALDI-TOF MS可以用于革蘭陽(yáng)性細(xì)菌(葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、乳球菌、芽孢桿菌、棒狀桿菌、李斯特菌等)、革蘭陰性細(xì)菌(腸桿菌等)，以及厭氧菌、分枝桿菌等多種細(xì)菌的鑒定。BLOSSER等[2]發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS可用于鑒定臨床相關(guān)諾卡菌。SALI等[3]用MALDI-TOF MS檢出了布魯菌。LI等[4]也探討了MALDI-TOF MS對(duì)于厭氧菌的快速檢測(cè)。此外它也可以用于細(xì)菌分型、細(xì)菌毒力檢測(cè)、微生物亞種水平鑒別以及耐藥檢測(cè)等。

1 MALDI-TOF MS鑒定常規(guī)標(biāo)本中的病原菌

MALDI-TOF MS可對(duì)血培養(yǎng)、尿液、痰液等標(biāo)本中的病原菌進(jìn)行早期鑒定，便于臨床及時(shí)救治細(xì)菌感染患者，使患者體內(nèi)微生物恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。

1.1血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的鑒定 ALTUN等[5]用MALDI-TOF MS鑒定固體培養(yǎng)基短期培養(yǎng)后的血流感染病原菌，發(fā)現(xiàn)僅需2.5 h培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)鑒定準(zhǔn)確率便可達(dá)到58.3%，5.5 h后鑒定準(zhǔn)確率能達(dá)82.3%，結(jié)果表明MALDI-TOF MS在鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性方面較有優(yōu)勢(shì)，不需要很長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，從而節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。K?CK等[6]通過(guò)相同方法鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本，與傳統(tǒng)方法相比，所耗時(shí)長(zhǎng)由15 h縮短到了3 h。ZHOU等[7]開(kāi)發(fā)了一種“內(nèi)部”(IH)方案，用MALDI-TOF MS直接進(jìn)行血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中病原菌的鑒定，對(duì)于單菌種培養(yǎng)，有94.4%可以準(zhǔn)確鑒定到種和屬，其中厭氧菌的鑒定準(zhǔn)確率達(dá)80%；對(duì)于多菌種培養(yǎng)，若采用標(biāo)準(zhǔn)模式，能夠準(zhǔn)確鑒定出血培養(yǎng)多種陽(yáng)性菌株中的單一菌種，若采用混合法，52.9%的標(biāo)本可被準(zhǔn)確檢出兩種病原菌。FLORIO等[8]利用MALDI-TOF MS提出了一種快速鑒定多菌種血培養(yǎng)中病原菌的方法，即將病原菌先在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行短期的選擇培養(yǎng)，然后用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，總鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)85.7%。在含有兩種不同病原菌的血培養(yǎng)中，其鑒定準(zhǔn)確率達(dá)100%；在含有兩種以上病原菌的血培養(yǎng)中，其鑒定出兩種病原菌的準(zhǔn)確率達(dá)86%。相比于常規(guī)方法，鏈球菌及腸球菌的鑒定時(shí)長(zhǎng)縮短到4.2 h，葡萄球菌的鑒定時(shí)長(zhǎng)縮短到8.7 h，革蘭陰性菌的鑒定時(shí)長(zhǎng)縮短到11.1 h。WANG等[9]將標(biāo)本前處理后用MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶，此過(guò)程可以控制在1 h內(nèi)，并且總鑒定準(zhǔn)確率達(dá)94.5%，其中革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌的鑒定準(zhǔn)確率分別為96.9%、94.5%。可見(jiàn)MALDI-TOF MS大大解決了常規(guī)方法耗時(shí)長(zhǎng)、工作效率低的問(wèn)題，能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定出血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的病原菌。

1.2尿路感染標(biāo)本的鑒定 HAIKO等[10]用U-si-MALDI-TOF(尿液短孵化MALDI-TOF)方法鑒定尿液中的病原菌，革蘭陰性菌的鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)86%，其中大腸埃希菌的檢測(cè)周轉(zhuǎn)時(shí)間縮短到了4～6 h，為尿路感染標(biāo)本的檢測(cè)做出了很大貢獻(xiàn)。LI等[11]發(fā)現(xiàn)將流式細(xì)胞儀篩查、MALDI-TOF MS及VITEK 2 Compact的鑒定和藥敏分析相結(jié)合可以用于尿路感染的快速確診，細(xì)菌的總檢出率為86.42%，革蘭陰性菌的檢出率為88.59%，其中腸桿菌的鑒定準(zhǔn)確率達(dá)94.83%，并且整個(gè)過(guò)程僅需7～9 h。ILKI等[12]同樣將尿液經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行菌量篩選后用MALDI-TOF MS進(jìn)行病原菌鑒定，可檢測(cè)出91.8%的菌株，革蘭陰性菌的總鑒定準(zhǔn)確率為95.8%，其中大腸埃希菌的鑒定準(zhǔn)確率為90.0%，肺炎克雷伯菌的鑒定準(zhǔn)確率為87.0%。SUN等[13]通過(guò)UF-5000i流式細(xì)胞儀篩選出尿路感染標(biāo)本后用MALDI-TOF MS直接進(jìn)行尿液病原菌的鑒定，鑒定準(zhǔn)確率達(dá)94.7%，并且能將時(shí)間控制在1 h內(nèi)。因此，用MALDI-TOF MS鑒定尿路感染標(biāo)本時(shí)，不僅能夠縮短標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間(TAT)，而且能獲得十分可靠的結(jié)果，其中對(duì)革蘭陰性菌的鑒定尤為準(zhǔn)確，使尿路感染患者及早得到救治。

1.3呼吸道感染標(biāo)本的鑒定 MEDIAVILLA-GRADOLPH等[14]用MALDI-TOF Bruker鑒定呼吸道感染標(biāo)本來(lái)源的分枝桿菌，其中非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的鑒定準(zhǔn)確率達(dá)98.4%。LPEZ-FABAL等[15]用MALDI-TOF MS Vitek檢測(cè)呼吸道感染標(biāo)本來(lái)源的分離株，檢出了100%的卡他莫拉菌、86%的肺炎鏈球菌、79%的流感嗜血桿菌，該方法不僅鑒定準(zhǔn)確率優(yōu)于常規(guī)方法，而且能夠正確定義存在爭(zhēng)議的鑒定結(jié)果。FERNNDEZ-ESGUEVA等[16]利用MALDI-TOF MS(檢測(cè)儀器是布魯克·道爾頓公司的產(chǎn)品)直接鑒定MGIT液體培養(yǎng)基中的分枝桿菌，避免了瓊脂平板培養(yǎng)的時(shí)間消耗，加快了檢測(cè)進(jìn)度，并且鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到98.06%，證明了該質(zhì)譜可以用于診斷分枝桿菌導(dǎo)致的呼吸道感染?？梢?jiàn)MALDI-TOF MS在呼吸道感染標(biāo)本的鑒定方面比傳統(tǒng)的常規(guī)方法更加省時(shí)并且準(zhǔn)確率更高，更利于臨床工作的開(kāi)展。

2 MALDI-TOF MS檢測(cè)細(xì)菌的耐藥性

MALDI-TOF MS對(duì)細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)大致可以歸納為不借助抗菌藥物的直接檢測(cè)和借助抗菌藥物的間接檢測(cè)。

2.1直接檢測(cè)

2.1.1直接檢測(cè)耐藥菌的特征峰 耐藥菌與敏感菌的質(zhì)譜圖存在著一定水平的差異，例如特征峰強(qiáng)度的改變(增高或降低)、峰的缺失或增加、峰值坐標(biāo)空間位置的移動(dòng)，據(jù)此創(chuàng)建的耐藥菌菌譜庫(kù)可以直接用于耐藥菌的檢測(cè)。

2.1.1.1耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢測(cè) 胡燕燕等[17]實(shí)驗(yàn)得出區(qū)分MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)最主要的特征峰為3 279、6 485、6 555、3 299 m/z 處的峰，MRSA組3 299 m/z處的質(zhì)譜峰高于MSSA組，而3 279、6 485、6 555 m/z處的質(zhì)譜峰低于MSSA組。mecA基因可以介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)甲氧西林耐藥，其位于葡萄球菌盒染色體mec(SCCmec盒)上，所以MRSA基因組中的Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ型SCCmec盒上可編碼一種小肽(PSM-mec)，該小肽可被MALDI-TOF MS檢測(cè)到。RHOADS等[18]用MALDI-TOF MS篩選MRSA時(shí)發(fā)現(xiàn)了2 415 m/z處的特征峰并利用反義RNA技術(shù)確定了該峰為PSM-mec，進(jìn)而表明了MRSA的存在，雖然該峰并不是MRSA的特有峰，但從某種意義上說(shuō)，這啟發(fā)了一種新的檢測(cè)思路。KIM等[19]基于MALDI-TOF MS并根據(jù)mecA和SCCmec分型，鑒定出了21個(gè)峰在MRSA和MSSA間有明顯差異，并將特定的峰值進(jìn)行組合，這些組合峰為MRSA的鑒定提供了更充分的依據(jù)。WANG等[20]在2 415、2 455、2 545、3 035、3 895、5 005、5 525、6 425、6 435、6 595 m/z左右的MRSA特征峰的基礎(chǔ)上，又發(fā)現(xiàn)了一種現(xiàn)象，即在2 435 m/z附近MRSA的特征峰較MSSA多,在5 285、6 905 m/z附近MSSA的特征峰較MRSA多，MALDI-TOF MS基于這些特征峰的檢測(cè)使得MRSA和MSSA更加便于區(qū)分。MALDI-TOF MS對(duì)于MRSA的檢測(cè)，告別了常規(guī)方法的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，為未來(lái)臨床上MRSA的檢測(cè)提供了更多的便利。

2.1.1.2耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)的檢測(cè) 吳薇等[21]基于MALDI-TOF MS發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)差異峰存在于VRE與萬(wàn)古霉素敏感腸球菌(VSE)之間，分別為3 516.14、3 644.12 m/z，可以用于VRE的初篩。陸文香等[22]用MALDI-TOF MS(檢測(cè)儀器為德國(guó)布魯克公司的產(chǎn)品)檢測(cè)出2 194.94、3 022.15、3 167.47、4 058.08 m/z的質(zhì)譜峰是用于區(qū)分VRE和VSE的最主要特征峰，且靈敏度、特異度均高于80%，使得對(duì)VRE和VSE的鑒別更加明確。同年，HUANG等[23]用MALDI-TOF MS檢測(cè)VRE，靈敏度及特異度均在90%以上，與ChromID VRE產(chǎn)色瓊脂培養(yǎng)基檢測(cè)相比，TAT縮短到了29 h并且檢測(cè)成本較低。 MALDI-TOF MS對(duì)于耐藥菌特征峰的檢測(cè)，結(jié)果可靠、省時(shí)、節(jié)省成本，是一種檢測(cè)VRE的好方法。

2.1.2直接檢測(cè)耐藥菌所產(chǎn)酶 β-內(nèi)酰胺酶包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、廣譜酶、碳青霉烯酶[A類如KPC酶，B類為金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL，簡(jiǎn)稱金屬酶)，D類如OXA酶]、頭孢菌素酶(Amp C酶)等，可以水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物從而造成菌株耐藥。耐藥脆弱擬桿菌的DNA包含cfiA基因，可編碼一種MBL。NAGY等[24]用MALDI-TOF MS得出cfiA陽(yáng)性和cfiA陰性的脆弱擬桿菌在4 000～5 500 m/z的質(zhì)譜峰存在著差異，即cfiA基因陰性菌株位于4 711、4 817 m/z處的峰，在cfiA基因陽(yáng)性菌株中分別漂移到了4 688、4 826 m/z處，于是可以區(qū)分cfiA陽(yáng)性菌株與cfiA陰性菌株，從而篩選出產(chǎn)MBL的菌株。ESPINOSA等[25]用MALDI-TOF MS發(fā)現(xiàn)39 800 m/z左右的峰僅出現(xiàn)在產(chǎn)CMY-2型Amp C酶的菌株中，并且靈敏度和特異度均為100%，可以用于此類產(chǎn)酶菌的檢測(cè)。CHANG等[26]用MALDI-TOF MS檢測(cè)到了鮑曼不動(dòng)桿菌的ADC型Amp C酶，對(duì)應(yīng)40 279 m/z左右的質(zhì)譜峰，靈敏度和特異度分別為96%、73%。ROCCO等[27]用MALDI-TOF MS成功檢出了肺炎克雷伯菌的p019蛋白即對(duì)應(yīng)11 109 m/z處的質(zhì)譜峰，該峰幾乎存在于所有產(chǎn)KPC酶的菌株中，靈敏度、特異度分別為95.7%、100.0%，可以作為產(chǎn)KPC酶菌株的相關(guān)峰，與常規(guī)方法相比，TAT縮短到了24 h。FIGUEROA-ESPINOSA等[28]用MALDI-TOF MS測(cè)得28 544 m/z的峰僅存在于產(chǎn)KPC-2酶的菌株中，靈敏度、特異度均為100%，可將其作為產(chǎn)KPC-2酶菌株的特征峰。這些研究說(shuō)明用MALDI-TOF MS檢測(cè)細(xì)菌所產(chǎn)酶的靈敏度、特異度均很高，并且可以起到縮短TAT的作用，進(jìn)而為產(chǎn)酶菌的鑒定提供了一種新方法。

2.1.3直接檢測(cè)耐藥菌的細(xì)胞組分 (1)外膜蛋白。外膜蛋白可以調(diào)節(jié)抗菌藥物進(jìn)出細(xì)菌，其缺失或減少是耐藥菌的耐藥機(jī)制之一。OmpC、OmpF是大腸埃希菌主要的外膜蛋白，HU等[29]報(bào)道，用MALDI-TOF MS檢測(cè)大腸埃希菌時(shí)并未發(fā)現(xiàn)37 000、38 000 m/z處的質(zhì)譜峰，即代表該菌株屬于大腸埃希菌EC1-EC3、EC6-EC8菌株，因?yàn)檫@類菌株不能表達(dá)外膜蛋白OmpC、OmpF。OmpK35、OmpK36是肺炎克雷伯菌主要的膜孔蛋白，PINTO等[30]通過(guò)MALDI-TOF MS發(fā)現(xiàn)膜孔蛋白OmpK36對(duì)應(yīng)于38 700 m/z的峰，此次，對(duì)膜孔蛋白OmpK35的檢測(cè)并不足，但是MALDI-TOF MS憑借節(jié)省時(shí)間這一大優(yōu)勢(shì)，足以替代十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)應(yīng)用于快速鑒定膜孔蛋白OmpK36缺少的肺炎克雷伯菌，為后期的抗菌治療提供針對(duì)性的依據(jù)。該研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)外膜蛋白OmpA對(duì)應(yīng)于36 000 m/z的峰，OmpA也是大腸埃希菌具有的一種外膜蛋白。涂海健等[31]用MALDI-TOF MS檢測(cè)出了外膜蛋白OmpK35，其對(duì)應(yīng)于37 200 m/z的峰，而SDS-PAGE并不能將其檢出，這更說(shuō)明了MALDI-TOF MS在檢測(cè)細(xì)菌外膜蛋白方面更勝一籌。通過(guò)直接檢測(cè)細(xì)菌的外膜蛋白，將MALDI-TOF MS用于耐藥菌的篩選，使得耐藥菌的檢測(cè)路徑更加多樣化。(2)脂多糖。脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞外壁的重要組分，其結(jié)構(gòu)之一為脂質(zhì)A。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素的耐藥性多與脂多糖的修飾有關(guān)，例如脂質(zhì)A的磷酸乙醇胺(pETN)修飾和4-氨基-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)修飾。DORTET等[32]開(kāi)發(fā)了一種基于MALDI-TOF MS的MALDIxin試驗(yàn)，即用于檢測(cè)對(duì)多黏菌素耐藥的革蘭陰性菌，在這類菌中發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)A的pETN修飾，即在天然脂質(zhì)A質(zhì)譜峰(1 796 m/z)的基礎(chǔ)上增加了123 m/z。該團(tuán)隊(duì)又對(duì)MALDIxin試驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化，即增加了溫和酸水解步驟，不僅發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)A的pETN修飾，還快速鑒定出被L-Ara4N修飾的脂質(zhì)A，因此優(yōu)化后的MALDIxin試驗(yàn)可以更好地用于多黏菌素耐藥菌的檢測(cè)[33]。MALDI-TOF MS可以通過(guò)直接檢測(cè)脂多糖從而鑒定出因脂多糖的修飾而產(chǎn)生耐藥的細(xì)菌，可見(jiàn)，這種質(zhì)譜方法能夠依據(jù)細(xì)菌的耐藥機(jī)制針對(duì)性地對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。

2.2間接檢測(cè)

2.2.1根據(jù)抗菌藥物的改變 細(xì)菌產(chǎn)生的酶可以使抗菌藥物發(fā)生諸多改變，如水解、脫羧、乙?；?，從而造成菌株耐藥，MALDI-TOF MS常?？梢愿鶕?jù)抗菌藥物的改變將耐藥菌檢測(cè)出來(lái)。攜帶KPC-2、NDM-1和VIM-1/2、IMP-1/2酶的菌株可以將厄他培南完全降解。BURCKHARDT等[34]用MALDI-TOF MS發(fā)現(xiàn)當(dāng)這類產(chǎn)酶菌存在時(shí)，476、498、521 m/z的厄他培南峰及其鈉加合物峰完全消失，在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)了450 m/z的水解產(chǎn)物峰。HRABAK等[35]將美羅培南與攜帶KPC-2/3、OXA-48/162、VIM-1和NDM-1酶的腸桿菌科細(xì)菌以及攜帶NDM-1酶的鮑曼不動(dòng)桿菌共孵育，用MALDI-TOF MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)383、405、427 m/z的美羅培南完整峰消失的同時(shí)出現(xiàn)了358.5、380.5 m/z的脫羧產(chǎn)物峰，用于產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的鑒定。SPARBIER等[36]將氨芐西林與大腸埃希菌DH5α共孵育時(shí)，用microflex LT(檢測(cè)儀器為德國(guó)布魯克公司的產(chǎn)品)可以檢測(cè)到350.1、372.1、394.1 m/z的氨芐西林峰及其鈉加合物峰，但與產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌共孵育時(shí)，這3個(gè)峰均降低的同時(shí)出現(xiàn)了367.9、389.9、411.8、324.0 m/z的水解及脫羧產(chǎn)物峰。JOHANSSON等[37]將厄他培南與產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌共孵育，與BURCKHARDT等[34]用MALDI-TOF MS測(cè)得的峰值相近，并未發(fā)現(xiàn)476、498、520、542 m/z的厄他培南完整峰，但新增了472、494、516、538 m/z的水解產(chǎn)物峰。LASSERRE等[38]借助產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌(CPE)提出了一種基于MALDI-TOF MS計(jì)算MS比值的方法，即抗菌藥物水解產(chǎn)物的峰值/(抗菌藥物水解產(chǎn)物的峰值+抗菌藥物的峰值)，當(dāng)MS比值≥0.82時(shí)，該菌判定為CPE。CALDERARO等[39]將美羅培南與CPE共孵育，與HRABAK等[35]用MALDI-TOF MS測(cè)得的結(jié)果相近，并未發(fā)現(xiàn)384、406、428 m/z處的美羅培南完整峰，但出現(xiàn)了358、380、402、424 m/z的水解產(chǎn)物峰及脫羧產(chǎn)物峰，憑借美羅培南質(zhì)譜峰的改變能夠快速檢測(cè)出CPE，同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)了不同酶降解抗菌藥物的能力不同，產(chǎn)KPC酶的菌株在30 min后便可將美羅培南完全降解，而產(chǎn)MBL的菌株則需在1 h后才能將美羅培南完全降解。馮麗娜等[40]將亞胺培南與CPE共孵育時(shí)，發(fā)現(xiàn)(300.00±0.55)m/z的亞胺培南峰完全消失,因此，MALDI-TOF MS也可以借助亞胺培南將CPE檢出。AAC(6′)-Ⅰb酶是一種重要的氨基糖苷乙酰基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶，其突變體AAC(6′)-Ⅰb-cr酶能夠使氨基糖苷類抗菌藥物和氟喹諾酮類抗菌藥物失去活性。PARDO等[41]通過(guò)MALDI-TOF MS發(fā)現(xiàn)當(dāng)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生AAC(6′)-Ⅰb-cr酶時(shí)，乙酰化的改變會(huì)使抗菌藥物的相對(duì)分子質(zhì)量增加42 000，可以用于此類產(chǎn)酶菌的鑒定。OVIAO等[42]用MALDI-TOF MS檢測(cè)大腸埃希菌對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星的乙?；淖儠r(shí)，也得到了相似的結(jié)果，+相對(duì)分子質(zhì)量43 000峰可以用于鑒定產(chǎn)AAC(6′)-Ⅰb-cr酶的腸桿菌科細(xì)菌，此過(guò)程在1 h內(nèi)即可完成。MALDI-TOF MS操作簡(jiǎn)便、高效，可以將其應(yīng)用于不同產(chǎn)酶菌的檢測(cè)中。

2.2.2根據(jù)有無(wú)抗菌藥物時(shí)細(xì)菌的質(zhì)譜差異 抗菌藥物會(huì)抑制敏感菌的生長(zhǎng)，使其濃度大大降低，質(zhì)譜峰強(qiáng)度變?nèi)?，而?duì)耐藥菌無(wú)抑制作用，因而耐藥菌的質(zhì)譜峰強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)，根據(jù)有無(wú)抗菌藥物時(shí)質(zhì)譜峰的ROC曲線下面積(AUC)可以判斷細(xì)菌是否耐藥。JUSTESEN等[43]利用一種基于MALDI-TOF MS的細(xì)菌藥敏測(cè)試方法，即MALDI Biotyper藥敏試驗(yàn)快速測(cè)定法(MBT-ASTRA)，將脆弱擬桿菌分別置于含及不含抗菌藥物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，最終根據(jù)AUC計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)率(RG)，RG值為含抗菌藥物的AUC與不含抗菌藥物的AUC的比值，以界定細(xì)菌耐藥與否，RG<0.4判定為敏感菌株，RG>0.4則判定為耐藥菌株。根據(jù)這個(gè)方法，研究者可以通過(guò)將不同抗菌藥物與細(xì)菌相結(jié)合的方式來(lái)鑒定細(xì)菌的藥物敏感或耐藥。

2.2.3同位素標(biāo)記聯(lián)合抗菌藥物共孵育 用同位素對(duì)培養(yǎng)基中的某種特定氨基酸進(jìn)行標(biāo)記，當(dāng)加入抗菌藥物時(shí)只有耐藥菌可以利用經(jīng)標(biāo)記的氨基酸順利生長(zhǎng)并合成新的蛋白質(zhì)，使得質(zhì)譜峰的位置發(fā)生偏移或出現(xiàn)新的質(zhì)譜峰，通過(guò)MALDI-TOF MS可以從諸多菌株中鑒別出耐藥菌，目前這種聯(lián)合法已用于對(duì)MRSA的檢測(cè)中。SPARBIER等[44]將試驗(yàn)菌株同時(shí)置于“正?！?正常賴氨酸)、“重”(13C615N2標(biāo)記的賴氨酸)以及“重+抗菌藥物”(13C615N2標(biāo)記的賴氨酸+苯唑西林)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用MALDI-TOF MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)耐藥菌的“重+抗菌藥物”譜與“重”譜十分相似，而敏感菌的“重+抗菌藥物”譜更接近“正?！弊V，從而可以用于MRSA的鑒定。DEMIREV等[45]用大腸埃希菌來(lái)檢驗(yàn)同位素標(biāo)記的性能，將大腸埃希菌置于未標(biāo)記和13C標(biāo)記的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并成功檢測(cè)了其對(duì)鏈霉素的耐藥性。JUNG等[46]將銅綠假單胞菌置于“正?！薄?3C615N2標(biāo)記的賴氨酸”以及“13C615N2標(biāo)記的賴氨酸+抗菌藥物”培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用MALDI-TOF MS檢測(cè)了其對(duì)美羅培南、環(huán)丙沙星和妥布霉素的敏感性。所以將同位素標(biāo)記結(jié)合抗菌藥物運(yùn)用到MALDI-TOF MS對(duì)耐藥菌的檢測(cè)中也是一種鑒定病原菌的好方法，但前提是需要已知培養(yǎng)基中含有某種特定的氨基酸，這個(gè)過(guò)程可能有些煩瑣。

2.2.4內(nèi)標(biāo)聯(lián)合抗菌藥物共孵育 內(nèi)標(biāo)為分子量穩(wěn)定且與細(xì)菌蛋白的分子量有明顯差異的蛋白質(zhì)，將細(xì)菌與抗菌藥物共孵育、裂解并加入內(nèi)標(biāo)，通過(guò)MALDI-TOF MS測(cè)得質(zhì)譜峰的分布情況可以將敏感菌與耐藥菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。LANGE等[47]利用MALDI-TOF MS對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗菌藥物存在時(shí)敏感菌質(zhì)譜圖主要包含內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜峰，而耐藥菌除內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜峰外，不論在有或沒(méi)有抗菌藥物存在的條件下均可呈現(xiàn)多個(gè)細(xì)菌質(zhì)譜峰，于是可以很好地用于耐藥菌的檢測(cè)。

3 小 結(jié)

如今MALDI-TOF MS在常規(guī)標(biāo)本病原菌的鑒定和細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)方面取得了較好的發(fā)展，在未來(lái)它同樣具備很大的潛力，需要研究者不斷地優(yōu)化、發(fā)掘。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立符合自己實(shí)驗(yàn)室的MALDI-TOF MS檢測(cè)體系，規(guī)范標(biāo)本前處理、基質(zhì)選擇等，縮短TAT，為臨床提供準(zhǔn)確的檢驗(yàn)報(bào)告，指導(dǎo)細(xì)菌感染患者的救治。但MALDI-TOF MS的應(yīng)用目前也存在許多不足：(1)MALDI-TOF MS在臨床微生物檢測(cè)的運(yùn)用上并沒(méi)有普及化，眾多檢驗(yàn)科室因各種原因?qū)ALDI-TOF MS檢測(cè)儀器閑置。(2)雖然MALDI-TOF MS檢測(cè)過(guò)程中相比常規(guī)方法節(jié)約成本，但其儀器成本并不低，這也是其無(wú)法做到臨床普及化的原因之一。(3)由于是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于蛋白含量較少的細(xì)菌，其標(biāo)本制備難度較大；對(duì)細(xì)菌的純度要求較高，這對(duì)難培養(yǎng)細(xì)菌的檢測(cè)造成了困擾。(4)對(duì)于親緣性相近的菌株不能很好地區(qū)分。(5)質(zhì)譜庫(kù)無(wú)法做到完整和統(tǒng)一，需要實(shí)驗(yàn)室各自建立適合自己的質(zhì)譜庫(kù)，這將是一個(gè)浩大的工程，可行性較差。(6) 目前MALDI-TOF MS只能分別檢測(cè)細(xì)菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性，不能同時(shí)進(jìn)行藥敏分析。(7)MALDI-TOF MS只能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性檢測(cè)，也就是說(shuō)只能檢測(cè)菌株的存在與否，無(wú)法通過(guò)它得知病原菌的具體含量。