鄧盾　唐嘉虹　王永飛　馬現(xiàn)永

鄧盾（1985-），博士，副研究員，加拿大麥吉爾大學(xué)訪問學(xué)者，主要從事微生物降解養(yǎng)殖環(huán)境有害物質(zhì)研究工作，在黃曲霉毒素生物降解、養(yǎng)殖臭氣生物防控及養(yǎng)殖廢棄物無害化處理等方面取得了一系列進(jìn)展。目前已主持國家自然科學(xué)基金、廣東省自然科學(xué)基金、廣州市科技計劃等項(xiàng)目7項(xiàng)。以第一作者或通訊作者在《Journal of Hazardous Materials》《Chinese Journal of Catalysis》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報》《微生物學(xué)通報》等國內(nèi)外期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文25篇（SCI收錄12篇）;以第一完成人獲得授權(quán)國家發(fā)明專利4項(xiàng)，國際發(fā)明專利1項(xiàng);獲得廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣獎一等獎1項(xiàng)、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技進(jìn)步獎二等獎1項(xiàng);擔(dān)任全國飼料行業(yè)質(zhì)量安全監(jiān)督專家，以及廣東省、廣州市、河源市、清遠(yuǎn)市和南雄市農(nóng)村科技特派員。

摘要：【目的】從土壤樣品中篩選能降解黃曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁，AFB₁）的菌株，并研究其對AFB1的降解性質(zhì)及抑制黃曲霉菌能力，評估其作為微生物降解AFB₁制劑的潛力，為進(jìn)一步開發(fā)AFB₁脫毒劑提供參考依據(jù)。【方法】以香豆素為唯一碳源，篩選出1株高效的AFB₁降解菌，通過16S rRNA基因測序得知菌株所屬種屬，并利用高效液相色譜確定菌株降解AFB1的特性，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化該菌株降解AFB₁的效率，共培養(yǎng)分析其對黃曲霉菌的抑制作用，最后利用SOS顯色反應(yīng)評估菌株對AFB₁的脫毒效果?！窘Y(jié)果】通過液相色譜檢測，獲得1株菌株GDAAS003對AFB₁的降解率相對較高，其16s rRNA基因序列與鏈霉菌Streptomyces cerasinus SR3-134（LC128347.1）的相似性高達(dá)100%，菌株降解AFB₁的活性物質(zhì)主要存在于上清液中，可能為胞外酶。GDAAS003上清液降解AFB₁的最佳pH為8.0的磷酸鹽緩沖液，最適反應(yīng)溫度為30 °C。經(jīng)優(yōu)化，菌株GDAAS003上清液對50 ng/mL AFB₁96 h的降解率可達(dá)90.50%，對100 ng/mL AFB1 96 h的降解率為75.68%。對降解產(chǎn)物的遺傳毒性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明菌株GDAAS003降解AFB₁的產(chǎn)物未表現(xiàn)出毒性，同時GDAAS003能抑制玉米中黃曲霉菌合成AFB₁?！窘Y(jié)論】鏈霉菌GDAAS003既能以較高的降解效率降解AFB₁，又能抑制黃曲霉菌的生長，其在食品和飼料行業(yè)中有較大的商業(yè)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B₁;鏈霉菌;生物降解;SOS顯色反應(yīng)

中圖分類號： S859.87? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0596-11

AFB1 degrading bacteria： Isolation，identification，optimization of its degradation conditions and toxicity evaluation of its degradation products

DENG Dun TANG Jia-hong WANG Yong-fei MA Xian-yong

（1 Institute of Animal Science， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding/Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China， Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition/Guangdong Engineering Technology Research

Center of Animal Meat Quality and Safety Control and Evaluation， Guangzhou， Guangdong? 510640， China;

2Department of Bioengineering，Jinan University， Guangzhou， Guangdong? 510632， China）

Abstract：【Objective】In order to solve the problem of aflatoxin B₁（AFB₁） contamination in feed and food，an AFB₁-degrading strain was screened from soil samples and its capacities for degradation of AFB₁and inhibition of Aspergillus flavus growth were studied. 【Method】Using coumarin as the sole carbon source，an efficient AFB₁degrading strain was selected. The species of the strain were identified by 16S rRNA gene sequencing and its degradation characteristics of AFB₁were studied by High performance liquid chromatography（HPLC）. The degradation efficiency of GDAAS003 on AFB₁was optimized by single factor experiment，and the inhibition effect of GDAAS003 on A. flavus growth was analyzed by co-culture. Finally，the SOS-Chromotest was used to evaluate the detoxification of AFB₁by the strain. 【Result】Through HPLC detection，a highly efficient AFB₁-degrading strain was selected. 16S rRNA analysis showed that the sequence of GDAAS003 was 100% homologous to that of Streptomyces cerasinus SR3-134（LC128347.1），and that the AFB₁degradation activity was extracellular and enzymatic. The results showed that the optimum pH of supernatants to degrade AFB₁was 8.0 in Na2HPO4/NaH2PO4 buffer and that the optimum temperature was 30 °C. Under the optimized condition，the degradation rate of 50 and 100 ng/mL AFB₁in 96 h of strain supernatant was 90.50% and 75.68%，respectively. Moreover，the genotoxicity test results of the degradation products showed that the degradation products did not show genotoxicity. In addition，GDAAS003 could inhibit AFB₁synthesis by A. flavus in maize. 【Conclusion】Streptomyces GDAAS003 not only degraded AFB₁with high efficiency，but also inhibited the growth of A. flavus. It has a great application prospect in the food and feed industries.B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

Key words： aflatoxin B₁; Streptomyces sp.; biodegradation; SOS Chromotest

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（C31802103）; Low Carbon Agriculture and Carbon Neutralization Research Center， GDAAS Project（XTXM202204）; Guangzhou Livelihood Science and Technology Project（201903010083）; Agricultural Competitive Industry Discipline Team Building Project of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（202118TD）

0 引言

【研究意義】霉菌毒素（Mycotoxins）是由霉菌在谷物生長繁殖過程中或飼料生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，霉菌毒素污染范圍廣，毒性強(qiáng)。由于被污染的糧食和飼料無法食用，因而每年均有大量受霉菌污染的糧食和飼料被浪費(fèi)。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計，每年全世界約有25%的農(nóng)作物受到霉菌毒素的污染，其中2%的糧食因此無法食用。在一些產(chǎn)品中霉菌毒素檢出的污染率高達(dá)90%，其中嚴(yán)重污染高達(dá)15%～25%（殷傳振，2015）。霉菌毒素已對人體和動物健康構(gòu)成了嚴(yán)重危害，其中黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是危害最大的一類。目前已知的黃曲霉毒素有20余種，主要由香豆素環(huán)和呋喃環(huán)組成。不同的黃曲霉毒素毒性有所不同，其毒性由強(qiáng)至弱依次為AFB₁>AFM₁>AFG₁>AFB₂>AFM₂>AFG₂，在這些物質(zhì)中AFB1的毒性和致癌性最強(qiáng)，其結(jié)構(gòu)中含有8，9-環(huán)氧基團(tuán)，與DNA結(jié)合能力強(qiáng)，從而抑制轉(zhuǎn)錄，引起癌癥的發(fā)生（謝曉鵬等，2013）。AFB₁還會導(dǎo)致畸形和生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病，因此1993年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素歸為I類人類致癌物（李智高等，2019）。如何控制黃曲霉毒素污染對于減少農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失和保障食品安全均十分重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，AFB₁的脫毒方法主要包括物理法、化學(xué)法和生物降解法。其中，物理脫毒方法有吸附法（Lewis et al.，2005）、超聲法（Raters and Matissek，2008）、加熱法（Haque et al.，2020）等，化學(xué)脫毒方法有臭氧氧化法（Bovo et al.，2015）、氨化法（Liu et al.，2019）等。但這些方法不僅效率較低，成本不符合商業(yè)化的要求，還會破壞營養(yǎng)和礦物質(zhì)元素吸收，要求脫毒劑需具有更高的降解效率和生物安全性（Zorlugenc et al.，2008）。近年來微生物降解為霉菌毒素脫毒提供了一種新思路。研究表明一些真菌和細(xì)菌能有效去除AFB₁。在真菌降解AFB₁的研究中，最著名的是假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens），其合成的胞內(nèi)黃曲霉毒素解毒酶，在pH 6.0和28 ℃條件下比酶活為7.09 nmol/（mg·min）（Weng et al.，1994）。此外，平菇（Pleurotus ostreatus）（Liu et al.，2001）、云芝（Trametes versicolor）（Elias-Orozco et al.，2002）、白腐真菌（Phanerochaete sordida）（Verheecke et al.，2016）等真菌也有降解AFB₁的能力。但真菌不易培養(yǎng)，且降解AFB1的時間長，限制了其在食品和飼料工業(yè)中的應(yīng)用。細(xì)菌中可降解AFB₁的種屬很多，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）（王寧等，2008）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（Alberts et al.，2009）、龐帝桿菌（Pontibacter）（Farzaneh et al.，2012）、紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）（周露等，2014）、枯草芽孢桿菌（B. subti-lis）（Dellafiora et al.，2017）、梭形賴氨桿菌（Lysinibacillus fusiformis）（Xu et al.，2017）、施氏假單胞菌（P. stutzeri）（Shu et al.，2018）等均具有降解AFB₁的能力。但出于安全性考慮，部分菌株不能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際中如銅綠假單胞桿菌（Rao et al.，2017），還有部分菌株受降解效率的制約（Alberts et al.，2006），影響其應(yīng)用。因此，篩選高效安全的AFB₁降解菌株是急待解決的問題。鏈霉菌是研究者考慮的微生物之一。Cserháti等（2013）研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌AS1對黃曲霉菌有競爭和拮抗作用，并能控制花生中AFB₁的污染。Sangare等（2014）比較了8種不同鏈霉菌作為抗AFB₁和AFB2生防劑的可能性，提出鏈霉菌作為微生態(tài)制劑具有較高的生物安全性。Eshelli等（2015）比較了Streptomyces lividans TK24和S. aureofaciens ATCC10762對AFB₁的降解作用，發(fā)現(xiàn)這2種菌的上清液對AFB₁分別有86%和88%的降解率（24 h）。Harkai等（2016）系統(tǒng)比較了124株鏈霉菌對AFB₁的降解作用，通過SOS-Chromotest試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10種鏈霉菌能緩解AFB₁引起的細(xì)胞毒性，其活性物質(zhì)主要存在于上清液中，但其AFB₁降解效率（1.0%～88.3%）差異很大。研究表明，鏈霉菌中含有一種特殊的低電位輔因子F420，這種輔因子有利于AFB₁中雙鍵的還原（Yang et al.，2014）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前能用于生產(chǎn)實(shí)踐中的鏈霉菌制劑很少，尤其是具有降解AFB₁功能的防控菌株，亟待開發(fā)具有較高生物安全邊際和較高降解效率的鏈霉菌制劑。【擬解決的關(guān)鍵問題】從土壤中分離篩選出具有AFB₁降解能力的菌株，通過AFB₁降解試驗(yàn)評估其降解能力，并采用SOS-Chromotest試驗(yàn)評估其代謝產(chǎn)物的遺傳毒性，為進(jìn)一步開發(fā)AFB1脫毒劑提供參考依據(jù)。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試劑：AFB₁標(biāo)準(zhǔn)品購自上海佰曄生物科技中心，蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉（SDS）購自生工生物工程（上海）股份有限公司;色譜級乙腈和甲醇購自上海阿拉丁試劑有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，SOS-Chromo Test Kit購自加拿大環(huán)境生物檢測產(chǎn)品有限公司。AFB₁在使用前配制成貯備液的形式：5 mg標(biāo)準(zhǔn)品加入50 mL色譜甲醇中，制成500 ng/mL AFB₁貯備液。

培養(yǎng)基：MSM培養(yǎng)基：參照閔勇等（2016）的方法配制，稱取KH₂PO₄0.5 g、NH₄NO₃2.0 g、CaCO₃2.0 g、MgSO₄·7H2O 0.5 g、FeSO4 20 mg，用超純水定容至1 L，調(diào)pH至7.0，加瓊脂粉20 g，121 ℃下高壓滅菌20 min后，加入香豆素0.1 g;LB培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，用超純水定容至1 L，調(diào)pH至7.2，121 °C下高壓滅菌20 min;馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）：稱取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加超純水浸沒馬鈴薯，沸水煮30 min，紗布過濾馬鈴薯浸出液，加葡萄糖20 g，超純水定容至1 L，pH自然，121 °C下高壓滅菌20 min。

1. 2 菌株分離、純化與鑒定

香豆素具有氧雜萘鄰?fù)Y(jié)構(gòu)，且致毒性遠(yuǎn)小于AFB₁，因此常利用香豆素為唯一碳源進(jìn)行AFB₁降解菌株的篩選。將采集到的廣州市天河區(qū)五山街道雞籠山附近森林土壤樣品梯度稀釋后，接種于含有0.01%香豆素的MSM培養(yǎng)基中，挑出單菌落在LB培養(yǎng)基中分離純化，使用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁菌株，提取細(xì)菌的DNA。使用27F：5'-GAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'和1492R：5'-GTTACCTTGTTACGACT-3'擴(kuò)增16S rRNA。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，進(jìn)行32個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，委托北京擎科生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行比對。將純化的菌株使用LB固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，挑單克隆菌落于MSM液體培養(yǎng)基中，加入AFB₁至終濃度為100 ng/mL，200 r/min反應(yīng)24 h，并測定剩余的AFB₁濃度，篩選出降解能力較強(qiáng)的菌株。

1. 3 AFB1檢測方法

向1.0 mL AFB₁反應(yīng)體系中加入5.0 mL乙腈和水的混合液（乙腈∶水=84∶16，體積比）及1.0 mL正己烷，充分振蕩混勻，靜置1 h。制備液相樣品：通過注射器吸入200 μL靜置后的溶液，經(jīng)0.22 μm聚偏氟乙烯濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，再利用高效液相色譜—光化學(xué)衍生—熒光檢測法（HPLC-PHR-FLD）檢測AFB₁含量。色譜條件：色譜柱為XBridgeTM C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm），進(jìn)樣量20 μL，流動相為甲醇∶水∶乙腈=35∶10∶55（體積比），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，熒光激發(fā)光波長360 nm，發(fā)射光波長440 nm（Adebo et al.，2016）。

1. 4 分離菌株降解AFB₁性質(zhì)

1. 4. 1 AFB₁降解活性部位 挑單克隆菌株接種于LB培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min搖床振蕩過夜培養(yǎng)，制備AFB₁降解菌株上清液、細(xì)胞內(nèi)容物和細(xì)胞碎片的反應(yīng)樣品。上清液反應(yīng)樣品：取10.0 mL菌液于4 ℃、12000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾待用。細(xì)胞內(nèi)容物反應(yīng)樣品：離心后的菌體經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，再離心，取菌體加入10.0 mL PBS重懸后，冰浴超聲波15 min（400 W，超聲波5 s，間隔5 s），破胞后的液體于4 °C、12000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾待用。細(xì)胞碎片反應(yīng)樣品：上述破胞離心后得到的沉淀用10.0 mL PBS重懸浮起來待用。反應(yīng)體系：分別取400 μL上述3種待用液和100 μL AFB₁貯備液于15 mL玻璃管中，補(bǔ)無菌水至1.0 mL。在玻璃管中進(jìn)行生物降解試驗(yàn)，分別測定其對AFB₁的降解作用，整個反應(yīng)體系為1.0 mL，后置于37 ℃避光反應(yīng)24 h，HPLC測定AFB₁的剩余量。使用LB培養(yǎng)基作上清液組的對照，PBS作細(xì)胞裂解液組的對照。反應(yīng)結(jié)束后，如1.3所述，使用甲醇和乙腈作為溶劑，提取未反應(yīng)的AFB₁。

1. 4. 2 蛋白酶K和變性處理對分離菌株上清液降解AFB₁的影響 為確定熱處理或蛋白酶K對AFB₁降解能力的影響，在開始AFB₁降解反應(yīng)之前，用不同方法處理上清液之后再加入AFB₁貯備液。37 °C、170 r/min搖床振蕩過夜培養(yǎng)降解菌株，菌液離心去沉淀，取上清液過0.22 μm濾膜后備用。3組變性處理具體方法如下：（1）加入蛋白酶K處理。1 mg/mL蛋白酶K加入到上清液中，37 oC處理1 h，加入0.4 mL AFB₁貯備液至1.6 mL經(jīng)蛋白酶K處理的上清液中，反應(yīng)在15 mL玻璃管中進(jìn)行;（2）加入1% SDS（w/v）處理。1% SDS加入到上清液中，37 oC處理6 h，加入0.4 mL AFB₁貯備液至1.6 mL經(jīng)SDS處理的上清液中，反應(yīng)在15 mL玻璃管中進(jìn)行;（3）加熱處理。將上清液煮沸30 min，用濾膜過濾，向1.6 mL過濾的上清液中加入0.4 mL AFB₁貯備液，反應(yīng)在15 mL玻璃管中進(jìn)行。分別在30 ℃黑暗中放置24 h，以無菌LB培養(yǎng)基和未經(jīng)處理的上清液作對照。反應(yīng)結(jié)束后，如1.3所述，使用甲醇和乙腈作為溶劑，提取未反應(yīng)的AFB₁。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

1. 4. 3 溫度對分離菌株上清液降解AFB₁的影響 為研究溫度對上清液降解效率的影響，使用過濾滅菌的上清液進(jìn)行AFB₁降解溫度條件的優(yōu)化。將反應(yīng)體系分別置于4、10、20、30、37和50 oC處理24 h，反應(yīng)中將緩沖液與上清液按照4∶1混合，取400 μL混合液加入100 μL AFB₁貯備液（500 ng/mL），補(bǔ)無菌水至1.0 mL，以15 mL玻璃管為反應(yīng)容器，置于不同溫度下避光反應(yīng)24 h。

考慮到變性蛋白等因素會對AFB₁產(chǎn)生非特異性吸附，除AFB₁外所有成分在不同溫度下處理24 h后，12000 r/min離心5 min，棄上清液，收集變性蛋白，加入1.0 mL無菌水和AFB₁，在不同溫度下反應(yīng)24 h，以排除非特異性吸附。

1. 4. 4 pH對分離菌株上清液降解AFB₁的影響 為研究pH對上清液降解效率的影響，使用過濾除菌的上清液進(jìn)行AFB₁降解的pH條件優(yōu)化。使用50 mmol/L不同pH的緩沖液研究pH對降解率的影響，其中檸檬酸鹽緩沖液pH為4.0～6.0，磷酸鹽緩沖液pH為6.0～8.0，Tris鹽酸緩沖液pH為8.0～9.0。反應(yīng)中將酶液與緩沖液按照4∶1混合，取400 μL混合液加入100 μL AFB₁貯備液，補(bǔ)無菌水至1.0 mL，以15 mL玻璃管為反應(yīng)容器。置于最適反應(yīng)溫度下避光反應(yīng)24 h。按照1.4.3的方法計算非特異性吸附的AFB₁含量。

1. 4. 5 金屬離子對分離菌株上清液降解AFB1的影響 為防止金屬離子在堿性條件下形成沉淀，使用pH 6.5的緩沖液配制50 mmol/L的Cu²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺和Fe²⁺（分別為CuCl₂、MgCl₂、FeCl₃、ZnCl₂、CaCl₂、MnCl₂和FeCl₂）金屬離子溶液，過濾滅菌。反應(yīng)中將上清液與金屬離子溶液按照4∶1混合，取400 μL混合液加入100 μL AFB1貯備液，補(bǔ)無菌水至1.0 mL，以15 mL玻璃管為反應(yīng)容器。置于最適反應(yīng)溫度下避光反應(yīng)24 h，以LB培養(yǎng)基和未經(jīng)處理的分離菌株作對照。反應(yīng)結(jié)束后，如1.3所述，使用甲醇和乙腈作為溶劑，提取未反應(yīng)的AFB1。

1. 4. 6 反應(yīng)時間和濃度對分離菌株上清液降解AFB₁的影響 在最適的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH條件下，比較50、100、250、500和1000 ng/mL 5個AFB₁濃度下的AFB₁降解效率，分別避光反應(yīng)12、24、48、72和96 h。反應(yīng)結(jié)束后，如1.3所述，使用甲醇和乙腈作為溶劑，提取未反應(yīng)的AFB₁。

1. 5 SOS顯色反應(yīng)試驗(yàn)

參照Fata等（2017）的方法，使用SOS顯色試劑盒對AFB₁和降解產(chǎn)物的遺傳毒性進(jìn)行評估。將大腸桿菌PQ37按照1∶100接種于LB培養(yǎng)液37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜（8～12 h），用10%二甲基亞砜（DMSO，內(nèi)含0.85%氯化鈉）溶液將細(xì)菌懸浮液稀釋到OD600值為0.05～0.06。陽性參照物為直接遺傳毒性化合物4-硝基喹啉氧化物（4NQO，10 μg/mL），LB培養(yǎng)基為空白。

試驗(yàn)比較3個樣品的遺傳毒性，分別為未降解的AFB₁（陽性對照）、大腸桿菌K12降解的AFB₁（陰性對照）和分離菌株上清液降解的AFB₁。3組反應(yīng)體系中AFB₁的初始濃度均為100 μg/L，反應(yīng)體系10.0 mL，反應(yīng)時間48 h，最終濃縮收到1.0 mL甲醇中，取10 μL與等體積的肝臟微粒體酶（SOS顯色反應(yīng)試劑盒中的S9組分）混合，用于后續(xù)毒性評估試驗(yàn)。取以上3種被測化合物、4NQO和LB培養(yǎng)基各10 μL，加入96孔微型板中，加入100 μL OD600=0.05的大腸桿菌K12突變體PQ37，將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h;隨后將100 μL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）和對硝基苯磷酸鹽（pNPP）加到孔板中，將96孔板進(jìn)一步孵育1.5 h;再使用酶標(biāo)儀于405和620 nm處測量β-半乳糖苷酶（β-Gal）和堿性磷酸酶（AP）的底物相對濃度，根據(jù)公式計算出指示遺傳毒性的誘導(dǎo)因子（Induce factor，IF）：

IF=?A_{405 nc}×A_{620 t}/A_{405 t}×A_{620 nc}

式中，nc為空白對照，t為測試樣品。IF≥1.5被認(rèn)為具有遺傳毒性。

1. 6 分離菌株對黃曲霉菌Aspergillus flavus CGMC C3.4409的抑制效果

將AFB₁產(chǎn)生菌株A. flavus CGMCC3.4409和分離菌株分別接種于PDB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，30 ℃下170 r/min培養(yǎng)48 h備用。向培養(yǎng)皿中加入5 g干燥玉米粉和10.0 mL無菌水充分混勻，分別接入1.0 mL分離菌株上清液、滅活的上清液作為對照組;接入1.0 mL未滅活的分離菌株上清液和1.0 mL A. flavus CGMCC3.4409菌液，1.0 mL滅活的分離菌株上清液和1.0 mL A. flavus CGMCC3.4409菌液作為保護(hù)組;接入1.0 mL LB培養(yǎng)基和1.0 mL A. flavus CGMCC 3.4409菌液作為感染組。所有處理組樣品于30 ℃避光靜置反應(yīng)72 h后，加入5.0 mL甲醇振蕩搖勻20 min并靜置20 min，取分離菌株的上清液過濾后，用HPLC檢測AFB₁含量，通過繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=9.6×10⁷X+1146929計算比較分離菌株上清液對A. flavus CGMCC3.4409的抑制效果。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

1. 7 安全注意事項(xiàng)

AFB1是一種致癌化合物，在使用AFB₁時，為安全起見，戴上手套、護(hù)目鏡和一次性口罩。此外，用于標(biāo)準(zhǔn)品和溶液配制的玻璃器皿在清洗前用3%次氯酸鈉水溶液浸泡以消除AFB₁殘留。與AFB₁有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和分析工作受到避光保護(hù)。

1. 8 統(tǒng)計分析

AFB₁降解率（%）=（對照組AFB₁含量-實(shí)驗(yàn)組AFB₁含量）/對照組AFB₁含量×100

所有試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，采用GraphPad Prism 5.0處理分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)和作圖，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 AFB₁降解菌株的分離鑒定結(jié)果

試驗(yàn)選用香豆素平板富集、分離菌株，最終成功分離出多株菌株。通過液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)其中一株菌株GDAAS003對AFB₁的降解率相對較高。根據(jù)16s rRNA測序結(jié)果，構(gòu)建GDAAS003的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1），顯示菌株GDAAS003與鏈霉菌Streptomyces cerasinus SR3-134（LC128347.1）屬于同一分支，核苷酸一致性高達(dá)100%，由此判斷菌株GDAAS003為鏈霉菌，將其命名為S. cerasinus GDAAS003。

2. 2 AFB₁降解活性物質(zhì)存在部位

比較菌株GDAAS003上清液、細(xì)胞內(nèi)容物和細(xì)胞碎片對AFB₁的生物降解作用，結(jié)果如圖2所示，菌株GDAAS003不同部位的AFB1降解率在3.83%～53.67%，其中GDAAS003上清液對AFB₁的降解能力最強(qiáng)，極顯著高于細(xì)胞內(nèi)容物（5.70%）和細(xì)胞碎片（3.83%）的降解率（P<0.01，下同）。由此確定該菌對AFB₁的降解活性物質(zhì)主要存在于胞外上清液中。

2. 3 蛋白酶K和變性處理對菌株GDAAS003上清液降解AFB₁活性的影響

通過不同方法處理后，降解菌株GDAAS003的上清液對AFB₁的降解結(jié)果如圖3所示。由圖可知，物理變性（加熱）、化學(xué)變性（SDS）和生物變性（蛋白酶K）均會影響菌株GDAAS003上清液對AFB₁的降解率，其中經(jīng)加熱處理的上清液對AFB₁的降解率為2.83%，較未處理的上清液極顯著降低50.84%;經(jīng)SDS處理的上清液對AFB₁的降解率為11.07%，較未處理的上清液極顯著降低42.67%;經(jīng)蛋白酶K處理的上清液對AFB₁的降解率為15.7%，較未處理的上清液極顯著降低37.97%?？梢?組處理均明顯抑制上清液對AFB₁的降解活性。綜合以上現(xiàn)象判斷，菌株GDAAS003降解AFB₁的反應(yīng)可能為酶促反應(yīng)，上清液中對AFB₁起主要降解作用的活性物質(zhì)很有可能是胞外酶蛋白。

2. 4 菌株GDAAS003上清液降解AFB₁條件的優(yōu)化

2. 4. 1 溫度對上清液降解AFB₁活性的影響 不同溫度條件下，菌株GDAAS003的上清液對AFB₁的降解結(jié)果如圖4所示。溫度在4～50 ℃范圍內(nèi)遞增時，上清液的AFB₁降解率呈先升高后降低的變化趨勢，在30 oC時達(dá)最大值，為59.76%，而在4 ℃時降解率最低，為21.21%。同時，研究發(fā)現(xiàn)不同熱處理下上清液產(chǎn)生的沉淀也會發(fā)生一定程度的降解AFB₁作用，當(dāng)溫度從4 ℃升至37 ℃時，變化差異不顯著（P>0.05），且降解率（1.07%～2.22%）較小;但當(dāng)溫度達(dá)50 ℃時，會使上清液中產(chǎn)生較多的白色沉淀，測得的AFB₁降解率達(dá)10.17%，推測變性蛋白對AFB₁產(chǎn)生了部分吸附作用。但與上清液的總AFB₁降解率相比，變性蛋白對AFB₁的作用相對較小。綜合以上現(xiàn)象可知，菌株GDAAS003上清液降解AFB₁的最適反應(yīng)溫度為30 ℃。

2. 4. 2 pH對上清液降解AFB₁活性的影響 不同pH條件下，菌株GDAAS003的上清液對AFB₁的降解結(jié)果如圖5所示。pH在4.0～8.0的范圍內(nèi)，AFB₁降解率隨之顯著增加（P<0.05，下同），在pH 8.0時達(dá)最大值（65.33%）;pH從8.0進(jìn)一步上升到9.0時，AFB₁降解率顯著降低;pH 4.0的降解率最低，僅為0.83%。此外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)變性蛋白對AFB₁的降解作用非常微弱;隨著pH的變化，降解率為0.16%～3.93%，降解率未呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。綜合以上現(xiàn)象可知，菌株GDAAS003上清液降解AFB₁的最佳pH條件為8.0的磷酸鹽緩沖液。

2. 4. 3 金屬離子對上清液降解AFB₁活性的影響 7種金屬離子分別參與反應(yīng)的條件下，菌株GDAAS003的上清液對AFB₁的降解結(jié)果如圖6所示。除Mg2+外，其他6種金屬離子對上清液的AFB₁降解活性均有不同程度的抑制作用，其中抑制作用最強(qiáng)的是Ca2+。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

2. 4. 4 反應(yīng)時間和濃度對AFB₁降解率的影響 比較0～96 h菌株GDAAS003上清液對50～1000 ng/mL AFB₁的降解效率，結(jié)果（圖7）顯示，0～24 h降解率增加最快，其中初始濃度為50 ng/mL的反應(yīng)體系在24 h時降解率可達(dá)65.33%。但隨著AFB₁初始濃度的升高，上清液對AFB₁的降解效率不斷降低，當(dāng)濃度增至1000 ng/mL時，24 h降解率降至16.47%;隨著反應(yīng)時間的延長，AFB₁降解率均逐漸增大。菌株GDAAS003上清液對100 ng/mL AFB₁在96 h的降解率為75.68%，對50 ng/mL AFB₁在96 h的降解率可達(dá)90.50%;當(dāng)濃度增至500 ng/mL時，上清液在96 h時的降解率仍可達(dá)54.12%，說明菌株GDAAS003對高濃度AFB₁也有較強(qiáng)的降解能力。

2. 5 SOS毒性評估試驗(yàn)結(jié)果

SOS毒性評估試驗(yàn)以大腸桿菌PQ37為試驗(yàn)菌，其基因中融合有操縱子sfiA和lacZ基因，當(dāng)有遺傳毒

性化合物存在時，可誘導(dǎo)大腸桿菌K12中的SOS修復(fù)系統(tǒng)，誘導(dǎo)β-Gal同時表達(dá)，因此可通過比較β-Gal活性和代表大腸桿菌K12細(xì)胞活性的AP活性，得出該化合物的遺傳毒性。各處理組在降解AFB₁后經(jīng)一系列混合液活化，進(jìn)行SOS顯色試驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示。從3組反應(yīng)數(shù)據(jù)對比可明顯看出，未降解AFB₁陽性對照組的IF最大，IF=2.21≥1.5，表明具有遺傳毒性。大腸桿菌K12降解AFB₁的IF略低于未降解AFB₁陽性對照組，IF=2.13≥1.5，也具有遺傳毒性。而菌株GDAAS003的上清液處理組的IF（1.31）明顯小于1.5，可見在菌株GDAAS003的上清液中檢測不出遺傳毒性。

2. 6 菌株GDAAS003對黃曲霉菌的抑制效果

由圖9可看出，接種A. flavus CGMCC3.4409的感染組長滿了黃綠色的黃曲霉菌，接入GDAAS003上清液可明顯抑制A. flavus CGMCC3.4409的生長。通過HPLC檢測（圖10），發(fā)現(xiàn)接入GDAAS003上清液的樣品中AFB₁含量為1.03 mg/kg，而接入滅活上清液的樣品中AFB₁含量為1.27 mg/kg，接種A. flavus CGMCC3.4409的樣品AFB₁含量最高，為2.52 mg/kg;同時不論是滅活前還是滅活后的GDAAS003上清液均不能在玉米粉培養(yǎng)物中產(chǎn)生AFB₁。由此可知，GDAAS003上清液既能抑制黃曲霉菌的生長，又可減少黃曲霉菌感染樣品中的AFB₁含量。

3 討論

如何利用微生物降解霉菌毒素一直是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中比較關(guān)注的科學(xué)問題。盡管已知能降解霉菌毒素的微生物種類很多，但能應(yīng)用的菌株卻很少，因此必須擴(kuò)大菌種篩選范圍來獲得更多地高效降解霉菌毒素的微生物菌株。放線菌是一類非常重要的農(nóng)業(yè)微生物，因其可生產(chǎn)大量活性物質(zhì)，如抗生素、抗真菌、抗病毒和抗癌藥物;同時鏈霉菌還常被用于工業(yè)酶生產(chǎn)（水解酶、轉(zhuǎn)移酶和酯酶）等。鏈霉菌對產(chǎn)生霉菌毒素的真菌的拮抗作用已得到了一些試驗(yàn)證實(shí)。Sakuda等（1996）發(fā)現(xiàn)Streptomyces（MRI142）菌株產(chǎn)生一種活性物質(zhì)Aflastatin A，能有效阻止寄生曲霉產(chǎn)生黃曲霉素的生物合成。Yekkour等（2012）從撒哈拉土壤中分離獲得一些鏈霉菌菌株，發(fā)現(xiàn)其可緩解由鐮刀菌（Fusarium culmosum）引起的大麥幼苗病癥。本研究通過富集培養(yǎng)，從土壤中分離得到了1株AFB₁高效降解菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA鑒定為S. cerasinus GDAAS003。該菌株也能有效控制產(chǎn)黃曲霉毒素真菌A. flavus CGMCC3.4409的生長，不論是滅活前還是滅活后的GDAAS003上清液均能減少AFB₁合成量，說明GDAAS003上清液中含有一些阻止AFB₁合成的代謝物質(zhì)。

El-Sharkawy和Abul-Hajj（1987）研究發(fā)現(xiàn)一些鏈霉菌不僅能阻止黃曲霉毒素的生長，還能降解AFB₁。在本研究中，S. cerasinus GDAAS003同樣具有類似的功能。通過對其降解AFB₁活性物質(zhì)存在部位分析，發(fā)現(xiàn)降解AFB₁的活性物質(zhì)主要存在于上清液中，且降解AFB1的活性物質(zhì)對蛋白酶K和溫度均十分敏感，推測S. cerasinus GDAAS003上清液中降解AFB₁的物質(zhì)很有可能是胞外酶。經(jīng)測定S. cerasinus GDAAS003上清液在最適pH和最適溫度下對100 ng/mL AFB₁96 h的降解率為75.68%;對50 ng/mL AFB₁96 h的降解率為90.50%;甚至對1000 ng/mL AFB₁96 h的降解率也超36.00%。這個降解率與一些具有脫毒功能的鏈霉菌相比較有一定優(yōu)勢，例如S. spiroverticillatus K128和S. violaceoruber K136等菌株對1 μg/mL AFB₁5 d的降解率僅分別為1.26%和4.79%（Harkai et al.，2016）。文獻(xiàn)報道的其他AFB₁降解菌株的降解率，如Streptomyces sp T1-4-1（24 h，65%）（陳曉飛等，2011）、 Myxococcus fulvus ANSM068（48 h，71.89%）（Zhao et al.，2011）、B. shackletonii L7（72 h，77.9%）（Liang et al.，2017）、P. stutzeri HAI2（72 h，72.5%）（宋茂鵬等，2021）等，只與本研究菌株S. cerasinus GDAAS003降解100 ng/mL AFB₁的能力相當(dāng)。B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014

降解產(chǎn)物的遺傳毒性是評估其生物安全性的指標(biāo)。SOS反應(yīng)利用大腸桿菌K12的突變體PQ37作為檢測致突變物質(zhì)的菌株（Krifaton et al.，2011）。一般認(rèn)為，AFB₁通過細(xì)胞色素P450（CYP）介導(dǎo)的反應(yīng)產(chǎn)生活性代謝物AFB₁8，9-環(huán)氧化物，從而產(chǎn)生遺傳毒性效應(yīng)。本研究中，S. cerasinus GDAAS003降解AFB₁的產(chǎn)物對大腸桿菌PQ37的遺傳毒性明顯低于對照。之前已證明，用黃曲霉毒素降解酶處理AFB₁會改變呋喃環(huán)的雙鍵，從而改變分子的熒光和致突變性（Lapalikar et al.，2012），盡管還需后續(xù)進(jìn)一步鑒定降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，但本研究結(jié)果表明GDAAS003降解AFB₁的產(chǎn)物致突變性已明顯降低。以上結(jié)果表明，S. cerasinus GDAAS003不僅可以合成降解AFB₁的胞外酶，還能分泌抑制黃曲霉菌生長的次生代謝產(chǎn)物，是一類具有開發(fā)潛力的防控黃曲霉菌感染的生物防控菌劑，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過富集培養(yǎng)，從土壤中分離得到1株AFB₁高效降解菌株S. cerasinus GDAAS003，其對大腸桿菌PQ37不具備遺傳毒性;不僅能分泌AFB₁降解酶，還能抑制黃曲霉菌生長，在黃曲霉毒素防控方面具有一定的開發(fā)價值和應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）B0031262-05E6-44AD-BCB7-C8C8C8903014