劉迪　歐陽艷飛　徐鵬　甄軍波　劉琳琳　張利超　遲吉娜

摘要：【目的】分析柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR的分布及序列特征，為開發(fā)多態(tài)性良好的、功能基因相關(guān)的SSR標記提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳圆煌瑴囟忍幚淼牟窈N子為材料，經(jīng)高通量轉(zhuǎn)錄組測序后，使用Trinity對測序結(jié)果進行de novo組裝，并利用MISA對組裝得到的Unigenes進行SSR位點搜索，最后統(tǒng)計分析SSR的分布及序列特征?！窘Y(jié)果】從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝獲得244194條Unigenes，其N50值為1036 bp，平均長度791 bp，總長度193138105 bp。從Unigenes序列中共檢測到50303個SSR位點，去除20405個復(fù)合型SSR位點，以29898個單一型SSR位點為后續(xù)分析對象。轉(zhuǎn)錄組SSR的出現(xiàn)頻率為12.24%，平均分布距離6.46 kb，主要重復(fù)基元類型為二核苷酸，共17105個，占SSR總數(shù)的57.21%，其次為三核苷酸和單核苷酸，分別占SSR總數(shù)的20.75%和20.46%，四核苷酸～六核苷酸重復(fù)基元數(shù)量均較少。轉(zhuǎn)錄組SSR中，共有97種重復(fù)基元，其中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元分別以AT/AT和ATC/GAT為主，分別占SSR總數(shù)的33.33%和3.98%;重復(fù)次數(shù)5～10次的SSR位點數(shù)量最多，共27942個，占SSR總數(shù)的93.46%。轉(zhuǎn)錄組SSR序列長度存在明顯差異（12～76 bp），平均長度15.28 bp?！窘Y(jié)論】柴胡轉(zhuǎn)錄組的SSR位點出現(xiàn)頻率較高，類型較豐富，具有開發(fā)出高多態(tài)性SSR分子標記的潛力，將其用于柴胡的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價及分子標記輔助育種等研究。

關(guān)鍵詞： 柴胡;轉(zhuǎn)錄組;SSR;分布;序列特征

中圖分類號： S567.79? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0676-08

Analysis of SSR distribution and sequence characteristics of Bupleurum chinense DC. transcriptome

LIU Di OUYANG Yan-fei XU Peng ZHEN Jun-bo LIU Lin-lin ZHANG Li-chao CHI Ji-na

（1Cotton Research Institute，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Cotton Biology and Genetic Breeding in Huanghuaihai Semiarid Area，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shijiazhuang， Hebei 050051， China; 2Chengde Chinese Herbal Medicine Green Ecological Planting Technology Service Center，

Chengde， Hebei? 067000， China）

Abstract：【Objective】The SSR locus information and sequence characteristics in the transcriptome of Bupleurum chinense DC. were analyzed， so as to provide the basis for the development of functional gene-related SSR markers with good polymorphism. 【Method】 The processed seeds of B. chinense were used as materials to perform high-throughput transcriptome sequencing. Trinity was used to assemble the sequencing results for De Novo assembly. The unigenes obtained were searched for the presence of SSR sites by MISA software and then the SSR data was statistically analyzed. 【Result】 244194 unigenes were assembled from B. chinense DC. The transcriptome data had an N50 value of 1036 bp， an average length of 791 bp and a total length of 193138105 bp. A total of 50303 SSR loci were identified from the unigene sequences， among which 20405 were complex SSR loci and 29898 SSR loci were actually analyzed. The frequency of SSR accounted for 12.24% of all unigenes with an average distribution distance of 6.46 kb. The major repeat motifs were dinucleotide （17105）， accounting for 57.21% of all SSRs，followed by trinucleotide and mononucleotide （20.75% and 20.46%，respectively）. The proportion of tetranucleotide repeat units to hexanucleotide repeat units was low. 97 kinds of repeat motifs were found in the B. chinense DC. transcriptome. The main repeat motif types in dinucleotide were AT/AT and in trinucleotide were ATC/GAT，which accounted for 33.33% and 3.98% of the total SSR， respectively. The types of SSR repeat units with 5 to 10 repeats had the highest proportion， with a total of 27942， accounting for 93.46% of the total SSRs. The sequence length ranged from 12 bp to 76 bp， with an average length of 15.28 bp. 【Conclusion】 The SSR loci in the B. chinense transcriptome have high frequency and diversity， and it is possible to develop SSR primers with high polymorphism， which can be used in the analysis of B. chinense genetic diversity， germplasm resource evaluation and molecular marker-assisted breeding.CBA22FE2-C5D6-49B5-95BB-86A3709C1060

Key words： Bupleurum chinense DC.; transcriptome; SSR; distribution; sequence characteristics

Foundation items：National System of Chinese Medicinal Materials Industry （CARS-21）;Hebei Technical Innovation System of Traditional Chinese Medicine Industry（HBCT2018060201）;Fundamental Research Funds of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences （2018070203）

0 引言

【研究意義】柴胡（Bupleurum chinense DC.）為傘形科柴胡屬多年生草本植物，其根為最常見的大宗藥材之一，具有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣的功效。全世界柴胡屬植物種類繁多，約有150種，我國有柴胡屬植物42種、17變種和7變型（Pan，2006）?！吨腥A人民共和國藥典》2020版規(guī)定中藥柴胡為柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根（國家藥典委員會，2020），但由于我國各省區(qū)均有柴胡屬植物如竹葉柴胡、馬爾康柴胡、馬尾柴胡等種植，在其產(chǎn)地也作柴胡入藥，使得柴胡種源混亂、臨床藥效難以保證（黃涵簽等，2017;石麗霞等，2020）。因此，柴胡不同品種的區(qū)分和鑒別顯得尤為重要。目前DNA分子標記是鑒定種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要技術(shù)。根據(jù)柴胡轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析柴胡SSR的分布及組成特征，以期開發(fā)出多態(tài)性高的SSR引物，對柴胡的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價及分子標記輔助育種等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】柴胡的研究主要集中在抗腫瘤作用（劉丹和王佳賀，2018）、化學(xué)成分（顏美玲等，2018）、基因表達量分析（楊林林等，2019）、復(fù)種模式（Liu et al.，2021）等方面，關(guān)于SSR分子標記的研究及應(yīng)用較少。SSR分子標記是一類由1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成的長度一般不超過200 bp的簡單重復(fù)序列，在遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位克隆、品種鑒定、分子標記輔助育種等方面應(yīng)用較廣，是現(xiàn)階段應(yīng)用最廣泛的分子標記技術(shù)之一（He et al.，2003;Wang et al.，2013）。SSR分子標記已在多種藥用植物如黃芩（齊琳潔，2015）、苦參（段永紅等，2018）、杭白芷（劉倩倩等，2018）、黃芪（劉亞令，2019）、重樓（王海明等，2019）等的遺傳多樣性研究及育種中得以應(yīng)用。目前，有關(guān)柴胡SSR分子標記的研究及應(yīng)用方面報道較少。Sui等（2010）構(gòu)建了北柴胡cDNA文庫，對隨機挑選的3000多個克隆進行5′端單反應(yīng)測序，并利用測序結(jié)果分析得到86個SSR位點。戰(zhàn)晴晴等（2010）從30條ISSR引物和44對SSR引物中分別篩選出28條和14對多態(tài)性引物，構(gòu)建了首張北柴胡遺傳圖譜，該圖譜包含13個連鎖群、80個位點，為北柴胡性狀基因定位等打下基礎(chǔ)。吳素瑞等（2015）從50對柴胡SSR引物中篩選出9對多態(tài)性高的引物，獲得了供試種質(zhì)的SSR特征譜帶數(shù)據(jù)，將所有種質(zhì)分為四大類，證實SSR分子標記可用于柴胡種質(zhì)鑒別。朱楚然等（2019）對三島柴胡進行了基因組Survey測序，并對所獲得的基因組序列進行了SSR分析，檢測到91377條SSR序列，對其中33條SSR序列進行擴增，篩選獲得21對有效擴增引物。【本研究切入點】目前可供使用的柴胡SSR分子標記較少，且鮮見轉(zhuǎn)錄組SSR的分布及序列特征分析方面的研究報道。雖然杜江等（2015）對柴胡轉(zhuǎn)錄組進行全面分析，但對于SSR方面并未深入分析及驗證?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于高通量測序獲得的柴胡轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，深度挖掘轉(zhuǎn)錄組SSR位點，并對其在轉(zhuǎn)錄組中的分布及序列特征分析進行統(tǒng)計分析，為開發(fā)大量多態(tài)性良好的SSR分子標記，并用于柴胡遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價及分子標記輔助育種等研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為柴胡（Bupleurum chinense DC.）室溫（15～20 ℃）保存種子及4 ℃和-20 ℃低溫凍融處理12 d的種子，每種處理的種子設(shè)置3個重復(fù)，共計9個樣本，放入液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 轉(zhuǎn)錄組測序

將處理過的柴胡種子送至邁維代謝生物科技有限公司，提取總RNA，并進行文庫構(gòu)建及測序工作。測序平臺為Illumina HiSeq X Ten高通量測序平臺。

1. 3 序列拼接及SSR位點搜索

使用Trinity對柴胡轉(zhuǎn)錄組測序Clean reads進行de novo組裝，并使用微衛(wèi)星標記識別工具（MicroSAtellite Identification tool，MISA）（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對組裝得到的所有Unigenes進行SSR位點檢測，搜索參數(shù)為單核苷酸最少重復(fù)10次，二核苷酸最少重復(fù)6次，三核苷酸～六核苷酸均最少重復(fù)5次。

1. 4 統(tǒng)計分析

以柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的重復(fù)單元的類型、出現(xiàn)頻率、SSR分布的平均距離及其基元組成來分析柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR的分布及其序列特征。SSR位點的平均分布距離和出現(xiàn)頻率相關(guān)計算公式：SSR位點的平均分布距離（kb）=總Unigenes的長度/檢測到的SSR的總數(shù);SSR的出現(xiàn)頻率（%）=SSR數(shù)量/Unigenes的總序列數(shù)量。

1. 5 SSR引物設(shè)計及驗證

根據(jù)SSR兩端互補序列，使用Primer 3.0設(shè)計批量引物，引物設(shè)計參數(shù)：退火溫度為57～63 ℃，上、下游引物退火溫度相差小于5 ℃;擴增產(chǎn)物長度為100～300 bp;引物GC含量為36%～67%;引物長度為18～22 bp。隨機挑選20對引物進行PCR驗證，引物由金唯智生物科技有限公司合成。CBA22FE2-C5D6-49B5-95BB-86A3709C1060

2 結(jié)果與分析

2. 1 柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率和分布距離分析結(jié)果

經(jīng)Trinity對柴胡轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行組裝，共獲得244194條Unigenes序列，其N50值為1036 bp，平均長度791 bp，總長度193138105 bp，GC含量45.39%。依照檢索條件檢索重復(fù)單元長度為1～6 bp的SSR，共鑒定出50303個SSR位點，只以其中的29898個單一型SSR位點為分析對象，其余的20405個復(fù)合型SSR位點不作分析。分析發(fā)現(xiàn)，柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR的出現(xiàn)頻率為12.24%（表1），平均分布距離6.46 kb，即平均6.46 kb就出現(xiàn)1個SSR位點，說明柴胡轉(zhuǎn)錄組中含有大量SSR位點，為后期SSR引物的開發(fā)利用提供參考。

2. 2 柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的基元類型分析結(jié)果

由表1可知，柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR位點重復(fù)類型豐富，存在單核苷酸～六核苷酸重復(fù)基元類型，但重復(fù)基元類型之間數(shù)量差異較大，其中，主要重復(fù)基元類型為二核苷酸，數(shù)量最多，有17105個，占SSR總數(shù)的57.21%，其次為三核苷酸和單核苷酸，分別占SSR總數(shù)的20.75%和20.46%;四核苷酸～六核苷酸重復(fù)基元數(shù)量均較少;在柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR中，六核苷酸重復(fù)基元的分布距離最高，為5518.23 kb，但出現(xiàn)頻率最低，僅為0.01%;二核苷酸重復(fù)基元的分布距離最低，僅為11.29 kb，但出現(xiàn)頻率最高，為7.00%?？傮w來說，不同重復(fù)基元類型的SSR出現(xiàn)頻率和分布距離主要受SSR數(shù)量影響，重復(fù)基元數(shù)越多，其出現(xiàn)頻率越高，分布距離越小。

2. 3 柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)基元堿基組成分析

在柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR位點中，共有97種基元（已考慮堿基互補、移碼等因素），單核苷酸～六核苷酸出現(xiàn)的重復(fù)基元分別為2、4、10、29、25和27種（表2）。從出現(xiàn)頻率來看，單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元為優(yōu)勢的3種重復(fù)基元，其不同SSR基元比例如圖1所示。單核苷酸重復(fù)基元以A/T為主，共6063個，占SSR總數(shù)的20.28%，占單核苷酸重復(fù)基元數(shù)的99.08%。二核苷酸重復(fù)基元以AT/AT為主，共9964個，占總SSR總數(shù)的33.33%，占二核苷酸重復(fù)基元數(shù)的58.25%，其次為AC/GT（5072個）、AG/CT（1995個）和CG/CG（74個），分別占SSR總數(shù)的16.96%、6.67%和0.25%，分別占二核苷酸重復(fù)基元數(shù)的29.65%、11.66%和0.43%。三核苷酸重復(fù)基元以ATC/GAT為主，共1189個，占SSR總數(shù)的3.98%，占三核苷酸重復(fù)基元數(shù)的19.17%，其次是AAG/CTT （1158個）和AGC/GCT（1044個），分別占SSR總數(shù)的3.87%和3.49%，分別占三核苷酸重復(fù)基元數(shù)的18.67%和16.83%，以ACG/CGT（147個）占SSR總數(shù)的比列最低，僅為0.49%，分別占三核苷酸重復(fù)基元數(shù)的2.37%。四核苷酸重復(fù)基元以TATG/CATA （143個）為主，占SSR總數(shù)的0.48%。五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)頻率均不高，僅為個位數(shù)，占總SSR的比例也很低。

2. 4 柴胡轉(zhuǎn)錄組中不同基元重復(fù)次數(shù)分析結(jié)果

柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR中，重復(fù)次數(shù)5～10次的SSR位點數(shù)量最多，共27942個，占SSR總數(shù)的93.46%，其中，重復(fù)次數(shù)為6次的SSR位點數(shù)最高，為7869個，占SSR總數(shù)的26.32%;其次是重復(fù)次數(shù)為7次的SSR位點，共4764個，占SSR總數(shù)的15.93%（圖2）。單核苷酸重復(fù)類型中重復(fù)次數(shù)最多的是10次，共4201個，而二核苷酸～六核苷酸重復(fù)類型的重復(fù)次數(shù)多集中在5～9次，其中三核苷酸重復(fù)基元中重復(fù)次數(shù)最多的是5次，共3783個，且隨著各基元重復(fù)次數(shù)的增加SSR數(shù)量逐漸降低（圖2）。

2. 5 柴胡轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)序列長度分析結(jié)果

SSR重復(fù)序列長度是影響SSR多樣性的重要因素，當長度<12 bp時SSR多態(tài)性極低（Temnykh，2001）。因此，本研究對序列長度≥12 bp的SSR進行分析，結(jié)果（圖3）顯示，柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR序列長度存在較大差異，長度范圍12～76 bp，平均長度15.28 bp，其中，序列長度12～20 bp的SSR數(shù)量最多，共計22656個，占SSR（≥12 bp）總數(shù)的達95.28%，且序列長度12 bp的SSR數(shù)量最多，共6262個，占SSR（≥12 bp）總數(shù)的20.94%;序列長度為21～30 bp的SSR數(shù)量為1033個，占SSR（≥12 bp）總數(shù)的4.34%;序列長度>30 bp的SSR數(shù)量為90個，占SSR（≥12 bp）總數(shù)的0.38%。不同重復(fù)類型的SSR位點中，四核苷酸的重復(fù)序列長度范圍最廣，為20～76 bp，平均長度為24.73 bp（表1）。

2. 6 柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR引物的設(shè)計及驗證

為能更好地使用挖掘的柴胡SSR位點，本研究對29898個SSR位點進行批量設(shè)計引物，為了驗證設(shè)計引物的有效性，隨機選取合成了包括二核苷酸重復(fù)基元～六核苷酸重復(fù)基元的20對引物（表3），分別對甘肅柴胡和冀柴1號進行擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，有14對引物能擴增出清晰且單一條帶，引物有效擴增率為70%（圖4），其中，10對SSR引物擴增產(chǎn)物長度與預(yù)期相符，4對SSR引物擴增產(chǎn)物長度超過預(yù)期，表明設(shè)計的引物大部分真實可用，且設(shè)計的引物在兩種柴胡之間可通用，可用于柴胡種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性等方面的研究。

3 討論

近年來，隨著高通量技術(shù)快速發(fā)展，測序成本逐漸降低，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)涵蓋數(shù)據(jù)量越來越大，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究應(yīng)用越來越廣。本研究從柴胡轉(zhuǎn)錄組測序獲得的244194條Unigenes中共鑒定出單核苷酸重復(fù)基元～六核苷酸重復(fù)基元6種類型29898個SSR位點，SSR的出現(xiàn)頻率為12.24%，平均分布距離6.46 kb。與其他藥用植物相比，柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR的出現(xiàn)頻率低于半夏（13.47%）（王森等，2014）、野三七（16.86%）（李翠婷等，2014）、金釵石斛（15.78%）（李清等，2017）、穿心蓮（32.36%）（李俊仁等，2018），但明顯高于杜仲（2.90%）（黃海燕等，2013）和金鐵鎖（8.54%）（葉鵬等，2019），存在物種間差異的原因除與物種自身有關(guān)外，還可能與SSR搜索標準、轉(zhuǎn)錄組中Unigene數(shù)量和長度等有關(guān)。CBA22FE2-C5D6-49B5-95BB-86A3709C1060

絕大多數(shù)植物的SSR位點主要重復(fù)基元為二核苷酸和三核苷酸，但不同物種中常見重復(fù)基元類型有所不同（王東等，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡SSR中主要重復(fù)基元類型為二核苷酸，有17105個，占SSR總數(shù)的57.21%;其次為三核苷酸，占SSR總數(shù)的20.75%，四核苷酸～六核苷酸所占比例均較小，表明低級基元SSR的多態(tài)性普遍高于高級基元（Dreisigacker et al.，2004）。前人研究發(fā)現(xiàn)，杜仲（黃海燕等，2013）、黨參（王東等，2014）和野三七（李翠婷等，2014）的主要重復(fù)基元類型均為二核苷酸，而金鐵鎖（葉鵬等，2019）和款冬（賀潤麗等，2019）的主要重復(fù)基元則為三核苷酸。GC含量對于基因的結(jié)構(gòu)和功能具有重要影響，是序列的重要特征之一。GC重復(fù)基元在多數(shù)植物中出現(xiàn)頻率均較低（Sun et al.，2013），如野三七中僅有1個（李翠婷等，2014），黨參中僅有5個（王東等，2014），霍山石斛中有73個（洪克前等，2020），本研究從柴胡SSR中鑒定出GC重復(fù)基元74個，僅占SSR總數(shù)的0.25%，且二核苷酸重復(fù)以AT/AT為主，占SSR總數(shù)的33.33%;三核苷酸重復(fù)以ATC/GAT為主，占總SSR的3.98%，表明柴胡SSR中A/T為優(yōu)勢重復(fù)基元。

SSR重復(fù)序列長度由基元重復(fù)次數(shù)和堿基數(shù)量決定，是影響SSR多態(tài)性的重要因素（Temnykh，2001）。柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR中，重復(fù)次數(shù)5～10次的SSR位點數(shù)量最多，為27942個，占SSR總數(shù)的93.46%，表明柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR多態(tài)性較高。前人研究表明，當SSR序列長度<12 bp時，多態(tài)性極低，長度為12～20 bp的SSR多態(tài)性中等，長度>20 bp的多態(tài)性較高（Temnykh，2001）。本研究柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR中，序列長度12～20 bp的SSR數(shù)量最多，共計22656個，占SSR（≥12 bp）總數(shù)的達95.28%;序列長度20 bp以上的SSR數(shù)量占SSR總數(shù)的4.72%，共1123個，其中，多態(tài)性較高的低級重復(fù)基元（二核苷酸和三核苷酸）共897個，占79.9%，可用于后續(xù)SSR引物的開發(fā)。本研究設(shè)計的20對引物中，有14對引物能擴增出清晰且單一條帶，引物有效擴增率為70%，其中有4對SSR引物擴增產(chǎn)物長度超過預(yù)期，原因可能為基因組相對轉(zhuǎn)錄組具有內(nèi)含子，導(dǎo)致其長度變長，也可能是組裝錯誤所導(dǎo)致（Xiang et al.，2015）。

4 結(jié)論

柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率較高，類型較豐富，具有開發(fā)出高多態(tài)性SSR分子標記的潛力，將其用于柴胡的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價及分子標記輔助育種等研究。

參考文獻：

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（責(zé)任編輯 陳 燕）CBA22FE2-C5D6-49B5-95BB-86A3709C1060