賀瑩，陳杰

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000）

核桃，又稱胡桃，是人們熟知的一種天然堅(jiān)果，在中國的種植面積廣，產(chǎn)量大，栽培種植歷史長[1]。核桃粕是核桃加工的副產(chǎn)物，含有一定量的核桃多酚和蛋白質(zhì)，核桃蛋白質(zhì)的總含量約占核桃粕干重的30%～70%，具有較高的利用價值[2]。如今，工業(yè)生產(chǎn)中多以蛋白質(zhì)為主要原材料，通過酶水解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)水解法等方法制備多肽。其中，微生物發(fā)酵有許多優(yōu)點(diǎn)，它可以利用原料中的各種營養(yǎng)物質(zhì)，可利用自身的酶將蛋白質(zhì)水解為多肽，并且對于多肽的提取機(jī)械化要求低，因此生物發(fā)酵現(xiàn)已發(fā)展為生物研究的熱點(diǎn)之一[3]。固態(tài)發(fā)酵法是微生物發(fā)酵中的一部分，具有發(fā)酵成本低、能直接實(shí)現(xiàn)較大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、產(chǎn)生的污染物較少、對原料利用率高等眾多優(yōu)點(diǎn)[4]。目前核桃活性肽的生理活性研究還不夠深入，還停留在初級階段，且尚未成功開發(fā)出具有較高生理活性的人工核桃多肽產(chǎn)品。因此人工制備核桃生物活性肽已成為研究熱點(diǎn)[5]。

本研究在前人研究基礎(chǔ)上以核桃粕為發(fā)酵原材料，應(yīng)用固態(tài)發(fā)酵方法[6]，以乳酸菌[7]作為發(fā)酵菌種，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，最終確定出最佳的工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)以及核桃副產(chǎn)物資源有效利用提供參考。同時對核桃多肽抗氧化能力進(jìn)行評價，為制備核桃多肽及功能性開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料及試劑

乳酸菌：呂梁學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

核桃餅粕：市售；硫酸銅、三氯乙酸、硫酸銅、1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、甲醇、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）溶液、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸：天津市凱通精細(xì)化工有限公司；還原性谷胱甘肽、抗壞血酸：浙江海正藥業(yè)股份有限公司；乳酸菌培養(yǎng)基（de Man，Rogosa and Sharpe，MRS）：青島拓普生物工程有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DFT-100粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HC60001電子天平：無錫瑪瑞特科技實(shí)業(yè)有限公司；Neofuge 13R離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；GZX-9146MBE恒溫培養(yǎng)箱：上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；UV-3100PC紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)及固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取核桃粕20 g（80目篩），加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，121℃滅菌20 min[8]。

1.2.2 種子液的制備

通過無菌操作，用挑取1環(huán)活化的乳酸菌菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中，生化培養(yǎng)箱溫度設(shè)為37℃，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵及發(fā)酵樣品處理

準(zhǔn)備若干250 mL錐形瓶，在每個燒杯中分別稱取20 g核桃餅粕粉末，置于滅菌鍋內(nèi)，121℃滅菌20 min，然后無菌操作，補(bǔ)充無菌蒸餾水。按接種量15%接入至預(yù)先制備好的種子液，攪拌混勻，溫度設(shè)為37℃，發(fā)酵12 h。發(fā)酵完畢后，過濾，離心，恒溫50℃干燥，干燥結(jié)束后得到發(fā)酵樣品[9]。

1.2.4 多肽含量的測定

參考劉瀟等[10]的雙縮脲方法測定核桃多肽濃度。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 發(fā)酵時間對乳酸菌固態(tài)發(fā)酵制備多肽產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度37℃，接種量15%的條件下，分別考察發(fā)酵時長[11-12]為 10、12、14、16、18 h 時對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響。

1.2.5.2 發(fā)酵溫度對乳酸菌固態(tài)發(fā)酵制備多肽產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時間12 h，接種量15%的條件下，分別考察發(fā)酵溫度[13-14]為 35、37、39、41、43 ℃時對于乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響。

1.2.5.3 接種量對乳酸菌固態(tài)發(fā)酵制備多肽產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時間12 h，發(fā)酵溫度37℃，分別探究接種量[15-16]為5%、10%、15%、20%、25%對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵核桃粕制備多肽工藝

在對核桃粕多肽進(jìn)行單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時間（A），發(fā)酵溫度（B），接種量（C）3個因素為自變量，多肽產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平試驗(yàn)優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵制備核桃多肽的工藝。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor levels of response surface test

1.2.7 抗氧化能力測定

1.2.7.1 核桃多肽清除DPPH自由基能力測定

精確稱取核桃多肽，將其配制成濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的溶液。同樣稱取抗壞血酸，制成同樣的濃度作參比。分別取2 mL不同濃度核桃多肽溶液、抗壞血酸溶液，加入2 mL DPPH溶液，搖勻后放置30 min，用對應(yīng)的溶劑為參照，在517 nm處測吸光度，計算公式[18]如下。

式中：Ax為不同濃度溶液吸光度；Ax0為樣品本底吸光度；A0為參比溶液吸光度。

1.2.7.2 鐵還原力的測定

取2.0 mL不同濃度的樣品溶液，各加入2 mL PBS溶液和鐵氰化鉀溶液，用振蕩器混合，保溫箱里50℃存放20 min，取出后再加入2 mL三氯乙酸，3 000 r/min離10 min，取上清液，迅速加入蒸餾水和配好的三氯化鐵，室溫反應(yīng)10 min，在700 nm處測定吸光度[19-20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組樣品做3次平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)使用origin 9.0作出折線圖，采用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg concentration

此標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式：y=0.092 2x+0.007 2。相關(guān)系數(shù)R2=0.991 7。

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響

發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響Fig.2 Effect of fermentation time on preparation of walnut polypeptides by lactic acid bacteria

由圖2可知，發(fā)酵溫度37℃，接種量15%，隨著發(fā)酵時間的延長，多肽的產(chǎn)量先增大后減小，當(dāng)發(fā)酵時間為12 h時，乳酸菌發(fā)酵核桃粕的效果最佳。當(dāng)發(fā)酵時間超出12 h后，多肽產(chǎn)量開始下降，說明發(fā)酵時間過長，會影響多肽的結(jié)構(gòu)，從而影響了多肽的產(chǎn)出。所以發(fā)酵時間12 h為最佳的發(fā)酵時間。

2.2.2 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響

發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on preparation of walnut polypeptides by lactic acid bacteria

由圖3可知，發(fā)酵時間12 h，接種量15%，多肽產(chǎn)量隨溫度的升高先增大后減小。當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時，多肽產(chǎn)量達(dá)到最大。因而選37℃為最適發(fā)酵溫度。

2.2.3 接種量對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響

接種量對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響見圖4。

圖4 接種量對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響Fig.4 Effect of inoculation of walnut polypeptide by lactic acid bacteria fermentation

從圖4可看出，接種量在5%～15%當(dāng)中時，多肽產(chǎn)出量逐步增加。當(dāng)接種量越來越大時，多肽產(chǎn)出量逐步下降。因此，適合的接種量對多肽產(chǎn)量的影響極為重要，太小或太大都將導(dǎo)致多肽的產(chǎn)量呈下降趨勢[21]。根據(jù)接種量對乳酸菌發(fā)酵制備核桃粕多肽的影響程度可知，接種量為15%為最佳值。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以響應(yīng)面分析法中心組合設(shè)計原理為主要試驗(yàn)研究依據(jù)[22-24]，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，乳酸菌制備核桃粕多肽工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test design and results of response surface

2.3.2 模型方程的建立及顯著性分析

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic regression model

對響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得出核桃餅粕多肽產(chǎn)出量與發(fā)酵時間（A），發(fā)酵溫度（B），接種量（C）的二次回歸模型：Y=12.82+0.036A+0.053B-0.099C-0.15AB+0.23AC-0.030BC-0.31A2-0.32B2-0.18C2。從A、B、C項(xiàng)系數(shù)的絕對值的大小可以充分看出，這3個影響因素對多肽產(chǎn)量的直接影響程度大小，其中正負(fù)值分別表示該因素對多肽影響正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)，各影響因素對多肽發(fā)酵產(chǎn)量的直接影響由大到小依次排序?yàn)榻臃N量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。模型P=0.001 4＜0.01，說明該回歸模型具備極顯著性，證明發(fā)酵條件不同，核桃粕多肽產(chǎn)量有顯著性差異；另外，表中失擬項(xiàng)P=0.060 6＞0.05，證明在響應(yīng)面試驗(yàn)選擇的各種因素水平范圍中，模型擬合程度佳，對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)值分析和試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測時，可以用此回歸模型的結(jié)果。在響應(yīng)面試驗(yàn)選擇的各種因素水平界限內(nèi)，對多肽產(chǎn)出量的影響效果顯著的因素是接種量；交互項(xiàng)中對多肽產(chǎn)出量影響效果極顯著的為AC（P＜0.01），顯著的為AB，而BC對多肽產(chǎn)出量的影響效果不顯著；二次項(xiàng)中A2、B2對多肽產(chǎn)出量有極顯著的影響（P＜0.01），而 C2的影響為顯著。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析

各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖見圖5～圖7。

圖5 發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface and contour map of interaction between fermentation time and fermentation temperature

圖6 發(fā)酵時間與接種量交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.6 The response surface and contour map of the interaction between fermatation time and inoculation level

圖7 發(fā)酵溫度與接種量交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.7 The response surface and contour map of the interaction between fermatation time and inoculation level

從圖5可看出，等高線圖為橢圓形，表明發(fā)酵時間與溫度對多肽產(chǎn)量影響顯著；隨著發(fā)酵時間的進(jìn)一步延長，發(fā)酵溫度的增高，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。

由圖6可看出，等高線圖同樣呈現(xiàn)橢圓的形狀，說明發(fā)酵時間與接種量對多肽產(chǎn)量的影響極顯著（p＜0.01）；隨著發(fā)酵時間的延長，多肽產(chǎn)出量呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢；隨著接種量的逐步增大，多肽產(chǎn)出量呈現(xiàn)先增大然后減小的趨勢。

從圖7可知，等高線圖的形狀向圓形貼近，表明發(fā)酵溫度和接種量交互作用對多肽產(chǎn)出量的影響程度是微弱的；隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)先增高后減小的趨勢；隨著接種量的逐步增大，多肽產(chǎn)出量呈現(xiàn)逐步增高然后減小的趨向。

2.3.4 最佳制備條件驗(yàn)證

借助Design-Expert 8.0.6應(yīng)用軟件對發(fā)酵多肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，分析可得多肽的最優(yōu)發(fā)酵工藝制備條件：發(fā)酵時間11.8 h，發(fā)酵溫度37.24℃，接種量13.25%，在此條件下多肽產(chǎn)量的理論值為12.80 mg/g。根據(jù)以上優(yōu)化制備條件的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，聯(lián)系實(shí)際試驗(yàn)條件，將核桃粕多肽最佳制備工藝條件調(diào)整為發(fā)酵時間12 h，發(fā)酵溫度37℃，接種量13%，經(jīng)過3次平行試驗(yàn)，得到最佳條件下多肽產(chǎn)量為12.84 mg/g，與多肽產(chǎn)出量的理論值無顯著差異，說明該響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化后得到的工藝條件可靠。

2.4 抗氧化能力測定

2.4.1 核桃粕多肽清除DPPH自由基能力測定

不同濃度核桃粕多肽的DPPH自由基清除率結(jié)果見圖8。

圖8 不同濃度核桃粕多肽對DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Effects of different concentrations of walnut meal polypeptide on DPPH free radical scavenging rate

由圖8可知，核桃粕多肽的DPPH自由基清除能力，隨著樣品濃度的升高而不斷增加。當(dāng)樣品濃度達(dá)到10 mg/mL時，DPPH自由基清除率達(dá)到了82%，表明核桃粕多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.4.2 核桃粕多肽鐵還原能力的測定

不同濃度核桃粕多肽的鐵還原能力結(jié)果見圖9。

圖9 不同濃度核桃粕多肽的鐵還原能力Fig.9 Iron-reducing ability of polypeptides in different concentrations of walnut meal

從圖9看出，隨著樣品濃度的升高，核桃粕多肽的鐵還原能力在不斷增加，陽性對照VC的活性較強(qiáng)，當(dāng)核桃粕多肽濃度為10 mg/mL時，鐵還原能力比其濃度為8 mg/mL時增加了19.2%，可能是乳酸菌作用多肽以后，肽分子構(gòu)象改變，進(jìn)一步暴露出一些有抗氧化能力的氨基酸殘基，增強(qiáng)了其抗氧化性[25]。

3 結(jié)論

以核桃粕為原料，采用固態(tài)發(fā)酵的方式，以多肽產(chǎn)量為評價指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)，有針對性地對乳酸菌制備核桃粕多肽進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，其最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時間12 h，發(fā)酵溫度37℃，接種量13%，在此條件下核桃粕多肽含量為12.84 mg/g?？寡趸匝芯勘砻?，當(dāng)核桃粕多肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL時DPPH自由基清除率達(dá)82%，且具有較強(qiáng)的還原能力。這些技術(shù)參數(shù)可為今后核桃粕多肽在工業(yè)化生產(chǎn)以及核桃粕副產(chǎn)物資源有效利用提供參考。