楊秋萍，閻彥霏，張 艷，曹晨陽(yáng)，盛煥精，崔生輝，楊保偉*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 富平縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心（陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心） 陜西富平 711700 3 中國(guó)食品藥品檢定研究院 北京 100050）

克羅諾桿菌（Cronobacter，原稱阪崎腸桿菌）是一種食源性條件致病菌，可導(dǎo)致各年齡段人群感染，尤其是新生兒、早產(chǎn)兒、老年人和免疫力低下的人群。感染后可引起敗血癥、神經(jīng)炎、腦脊髓炎、腦膿腫、腦積水和壞死性小腸結(jié)腸炎[1-2]。目前，已報(bào)道在嬰幼兒配方乳粉和谷類輔助食品、奶酪、蔬菜、谷物等食品中檢出克羅諾桿菌[3-4]。食品污染克羅諾桿菌后會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成危害，然而，不是所有克羅諾桿菌都可導(dǎo)致人患病。研究發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter Sakazakii）、丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌（Cronobacter malonaticus）和蘇黎世克羅諾桿菌（Cronobacter turicensis）是引起新生兒和嬰兒腦膜炎、敗血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎的常見(jiàn)類型[5-7]。攝入被阪崎克羅諾桿菌污染的嬰幼兒配方乳粉是導(dǎo)致新生兒和嬰兒感染的主要原因[8]，感染引起的死亡率為40%～80%[9-10]。對(duì)嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行檢測(cè)和追溯，對(duì)保障新生兒和嬰兒食品安全至關(guān)重要。

對(duì)致病菌分型是追溯其來(lái)源的關(guān)鍵。應(yīng)用于阪崎克羅諾桿菌的分型方法主要有表型和分子分型，其中分子分型技術(shù)被認(rèn)為是追溯微生物來(lái)源的最有力工具。目前已有脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA （Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、多位點(diǎn)序列分型 （Multilocus sequence typing，MLST）、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（Multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）、腸桿菌間保守重復(fù)序列PCR（Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR）和全基因測(cè)序（Whole genome sequencing，WGS）等分型方法被用于阪崎克羅諾桿菌分型[6，11]，然而，不同方法有著各自的特點(diǎn)和局限。PFGE 分辨率高，是細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是流行病爆發(fā)調(diào)查和食源性病原菌監(jiān)測(cè)中最為常用的方法[12]。然而，PFGE 不能對(duì)基因組上缺乏XbaⅠ等限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的菌株進(jìn)行分型，也不能用于阪崎克羅諾桿菌鑒定，不能確切反映菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等缺陷[6]。MLST 分型重復(fù)性好、分辨率高，可根據(jù)fusA 等管家基因?qū)肆_諾桿菌進(jìn)行鑒定，分型結(jié)果也可以上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pubmlst.org/cronobacter/），進(jìn)行長(zhǎng)期流行學(xué)研究，然而，MLST 分型方法不適用于管家基因序列高度一致的菌株[6，11]。ERIC-PCR 具有快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的特點(diǎn)，可用于管家基因序列相似及不同克羅諾桿菌菌株的流行病學(xué)和遺傳多樣性研究[13]。

分型方法分型能力的高、低對(duì)病原菌溯源和流行病學(xué)調(diào)查有著重要意義。本研究分別采用PFGE、MLST 和ERIC-PCR 分型方法對(duì)分離于不同地區(qū)，不同品牌嬰幼兒配方乳粉、米粉和輔食中的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行分型，比較3 種分型方法的分型能力，以確定更適于阪崎克羅諾桿菌的分型方法。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

供試阪崎克羅諾桿菌共37 株，分離于2010年7月至2012年7月間采集自陜西省寶雞市、蔡家坡、楊凌、西安市、眉縣、岐山縣、周至縣、扶風(fēng)縣、武功縣、興平市和乾縣部分超市、母嬰專賣店的嬰幼兒配方乳粉、米粉和輔食（表1）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 培養(yǎng)基和試劑 Luria-Bertani（LB）營(yíng)養(yǎng)瓊脂、Luria-Bertani （LB） 肉湯、胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

Taq DNA 聚合酶、ExTaq DNA 聚合酶、dNTPmix、10×PCR 緩沖液、DL2000 DNA Ladder、蛋白酶K（含緩沖液）和限制性內(nèi)切酶XbaⅠ均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；DNA 提取試劑盒購(gòu)于北京康為試劑科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl）、乙二胺四乙酸 （EDTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF） 等均購(gòu)自Sigma 公司；PFGE 專用低熔點(diǎn)瓊脂糖（SeaKem Gold Agarose）購(gòu)自美國(guó)Cambrex Bio Science 公司。

1.2.2 主要儀器與設(shè)備 GelDocXR 凝膠成像系統(tǒng)、170-3672 脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)、MyCyclerPCR儀，Bio-Rad 公司；超NU-425-400E 凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MDF-U5411 高壓滅菌鍋，上海申安高壓儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PFGE 分型 PFGE 分型方法主要按照美國(guó)疾病預(yù)防控制中心 （the Centers for Disease Control and Prevention，CDC）頒布的應(yīng)用于食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)PulseNet 中的PFGE 標(biāo)準(zhǔn)方法。400 μL 菌懸液中加入20 μL 蛋白酶K 后與400 μL 含SDS 的Seakem Gold 瓊脂糖快速混勻、冷卻凝固。加入5 mL 細(xì)胞裂解緩沖液 （Cell lysis buffer，CLB）和25 μL 蛋白酶K 裂解細(xì)菌，于54 ℃、150～175 r/min 恒溫水浴搖床中裂解1.5～2 h。用無(wú)菌超純水和TE 緩沖液洗滌裂解細(xì)胞后，用200 μL 含有限制性內(nèi)切酶XbaⅠ及其緩沖液的混合液于37℃恒溫水浴中孵育1.5～2 h。吸出酶切混合液，加入200 μL 0.5×TBE 緩沖液，終止反應(yīng)。PFGE 電泳結(jié)束后，溴化乙錠染色30 min；去離子水洗劑2 次，TE 緩沖液洗劑3 次，每次15 min。脫色的瓊脂糖凝膠用凝膠成像系統(tǒng)拍照。利用BioNumerics 3.0軟件對(duì)PFGE 結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

1.3.2 MLST 分型 用基因組DNA 提取試劑盒抽提阪崎克羅諾桿菌基因組DNA 作為模板，參考克羅諾桿菌MLST 分型官方數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pubmlst.org/cronobacter/）公布的阪崎克羅諾桿菌MLST 分型用管家基因atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB 和pps 種類、擴(kuò)增和測(cè)序引物序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體系為50 μL，包括5 μL 10×Pfu 緩沖液，5 μL dNTP Mix（2 mmol/L），1 μL Pfu DNA 聚合酶，引物各0.5 μL（10 μmol/L），36 μL 超純水，2 μL 模板DNA；反應(yīng)條件為94 ℃10 min；94 ℃1 min，60 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。除gltB 擴(kuò)增的退火溫度為63℃外，其余6 個(gè)基因均為60 ℃。PCR 產(chǎn)物由上海桑尼生物技術(shù)有限責(zé)任公司純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與克羅諾桿菌PubMLST 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pubmlst.org/cronobacter/）比對(duì)獲得Sequence Type（ST）型。

1.3.3 ERIC-PCR 分型 用1.3.2 節(jié)中抽提的基因組DNA 作為模板，上游引物：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'，下游引物：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'，PCR 擴(kuò)增總體系為25 μL，包括13.15 μL 超純水，1.5 μL Mg-Cl2（25 mmol/L），2 μL dNTP（2.5 mmol/L），2.5 μL 10×PCR 緩沖液，引物各0.3 μL（50 pmol/L），0.25 μL Taq DNA 聚合酶，5 μL 模板。PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增后取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)照相。采用“1”“0”記帶法，同一位點(diǎn)有擴(kuò)增帶的記為“1”，無(wú)擴(kuò)增帶記為“0”。使用R 軟件包（版本3.4.4）和Pheatmap 軟件包（版本3.0.1）進(jìn)行聚類分析。

1.4 辛普森多樣性指數(shù)（DI 值）

根據(jù)辛普森多樣性指數(shù)方程計(jì)算3 種分子分型方法的DI 值，根據(jù)DI 值判斷分型方法分辨率高低。DI 值越大，分型能力越強(qiáng)[14]。

式中，N——菌株總數(shù)；S——被描述的類型總數(shù)；nj——j 型的菌株總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌PFGE 分型

PFGE 分型結(jié)果如圖1所示。37 株阪崎克羅諾桿菌可被分為35 個(gè)PFGE 帶型，分別命名為PT01～PT35，其中PT28 包含3 株菌，其余34 個(gè)PT型各含1 株菌。菌株P(guān)FGE 帶譜相似度范圍為92%～100%，分型后沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)帶譜。菌株14-4（2）和14-4（1）分離于陜西省興平市同一品牌的嬰幼兒配方乳粉，菌株12-12（2）分離于陜西省西安市的嬰兒輔食奶糕粉，3 株菌帶譜相同，為PT28 型。菌株15-17（2）、15-8（2）和菌株14-20（2）PFGE 帶譜相似性為99%，其中15-17 （2）和15-8（2）來(lái)源于同一地區(qū)采集的米粉，而14-20（2）來(lái)自其它地區(qū)的嬰幼兒配方奶粉。PFGE 分型方法分型能力較高，可對(duì)不同來(lái)源的菌株進(jìn)行相似性和溯源分析。

圖1 阪崎克羅諾桿菌PFGE 分型及聚類分析Fig.1 PFGE typing and cluster analysis of Cronobacter sakazakii

2.2 阪崎克羅諾桿菌MLST 分型

MLST 分型結(jié)果表明，37 株菌株可被分為23種ST 型，其中ST1、ST4、ST93 型菌株各有4 株，ST444 型3 株菌，ST12、ST451 和ST449 各2 株，其余16 種ST 型各1 株。23 種ST 型中，有13 個(gè)ST型（ST441、ST442、ST443、ST444、ST445、ST446、ST447、ST448、ST449、ST450、ST451、ST452 和ST453）為克羅諾桿菌MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有記錄的ST 型。2-9（1）、35-15-1、36-8-1、6-16（1）為與新生兒腦膜炎相關(guān)的ST4 型。其中，36-8-1 或6-16（1）分別來(lái)源于同一地區(qū)的米粉和嬰幼兒配方奶粉，2-9（1）、35-15-1 和6-16（1）為來(lái)源于不同地區(qū)的嬰幼兒配方奶粉，且35-15-1 和6-16（1）是為同一品牌。MLST 方法也具有較高的分型能力，可用于追溯食品中阪崎克羅諾桿菌污染源（表1，圖2）。

圖2 阪崎克羅諾桿菌MLST 分型結(jié)果及聚類分析Fig.2 MLST subtyping and cluster analysis of Cronobacter sakazakii

表1 阪崎克羅諾桿菌來(lái)源及MLST 分型結(jié)果Table 1 The source and MLST sutyping of Cronobacter sakazakii

2.3 阪崎克羅諾桿菌ERIC-PCR 分型

ERIC-PCR 分型后，各菌株擴(kuò)增得到的DNA條帶數(shù)目為2～6 條，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均在100～2 000 bp 之間。37 株菌株可被分為28 個(gè)亞型，分別命名為ET01～ET28。其中，ET28 型有4 株菌，ET27 型有3 株菌，ET4、ET10、ET14 和ET25 各有2 株菌，其余ET 型均有1 株菌。同屬ET28 型的4株菌分離于不同地區(qū)采集的米粉。23-11（1）、12-18 （1） 和21-7-2 的ERIC-PC 分型結(jié)果為ET27型，菌株23-11（1）和21-7-2 分離于陜西楊凌采集嬰幼兒配方奶粉和米粉，12-18（1）分離于西安采集米粉。ERIC-PCR 分型結(jié)果聚類分析表明，分離于不同地區(qū)不同食品的阪崎克羅諾桿菌可能具有相同基因型，可用于阪崎克羅諾桿菌溯源分析。

圖3 ERIC-PCR 結(jié)果聚類分析Fig.3 Cluster analysis of ERIC-PCR results

2.4 PFGE、MLST 和ERIC-PCR 分型比較

對(duì)37 株菌的PFGE 和MLST 分型結(jié)果進(jìn)行比較，以相似度100%為臨界值，PFGE 和MLST 的DI 值分別為99.55%和96.40%。DI 值越高，對(duì)菌株的鑒別能力越強(qiáng)，因此PFGE 的分型能力高于MLST 分型?？傮w而言，PFGE 與MLST 分型結(jié)果相似，具有相同ST 型菌株的PFGE 分型相似度不低于94%。菌株14-4（2）、14-4（1）和12-12（2）MLST分型為ST93，PFGE 帶型為PT28。然而，也有菌株具有相同ST 型而PFGE 分型略有差異的情況，如菌株14-20 （2） 和15-17 （2）MLST 型為ST449，PFGE 圖譜相似度為98%；菌株2-9（1）、35-15-1、36-8-1 和6-16（1）為ST4 型，PFGE 條帶也存在差異。

以相似性100%為臨界值，PFGE 和ERICPCR 分型的DI 值分別為99.55%和98.05%，PFGE對(duì)阪崎克羅諾桿菌分辨率略高于ERIC-PCR。ERIC-PCR 分型中菌株32-18-2 和33-15-2 同為ET04 型，而PFGE 分型相似性為92%；菌株15-17（2）與14-20（2）同為ET14 型，PFGE 分型相似性為99%。菌株14-4（2）、14-4（1）和12-12（2）PFGE分型為PT28，ERIC-PCR 電泳圖譜存在一定差異，這表明PFGE 和ERIC-PCR 對(duì)阪崎克羅諾桿菌均有較高分型能力，2 種方法分型結(jié)果略有差異。

MLST 和ERIC-PCR 分別將37 株菌分為23個(gè)ST 型和28 個(gè)不同的類群，且ERIC-PCR 的DI值大于MLST 分型，表明ERIC-PCR 對(duì)阪崎克羅諾菌的分型能力強(qiáng)于MLST 分型。ERIC-PCR 與MLST 分型結(jié)果間存在一定的相似性，如菌株18-21（2）和18-15（1）均為ST444，ERIC-PCR 指紋圖譜也相同。然而兩種分型結(jié)果也存在差異，如菌株36-8-1、3-10（1）、29-3-2 和11-1（1）的ERICPCR 分型相似性為100%，而ST 型各不相同。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的表型分型方法如血清學(xué)分型不利于對(duì)菌株進(jìn)行親緣性分析和溯源，基于細(xì)菌DNA 的分子分型技術(shù)則在研究菌株間關(guān)系、確定感染源等方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，在食品安全檢測(cè)和病原菌分型研究中起到關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)比較PFGE、ERIC-PCR 和MLST 3 種分子分型方法對(duì)分離于嬰幼兒食品源的37 株阪崎克羅諾桿菌的分型能力，以確定3 種分型方法在食源性阪崎克羅諾桿菌風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和溯源中的優(yōu)勢(shì)和局限。

PFGE 分型是針對(duì)菌株基因組，通過(guò)不同的限制性內(nèi)切酶將細(xì)菌基因組酶切為不同片段，再外加變化的電場(chǎng)，從而產(chǎn)生不同的基因指紋圖譜，以分析菌株相似性和親緣關(guān)系[15]。周厚德等[4]采用PFGE 將24 株來(lái)源于市售嬰幼兒食品的克羅諾桿菌分成22 個(gè)PFGE 基因指紋圖譜PFGE 型別高度多樣性。張彩霞等[16]對(duì)68 株食品源阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行PFGE 分型，可分為58 個(gè)PFGE 帶型，且?guī)洼^分散。本研究的37 株嬰幼兒食品源阪崎克羅諾桿可分為35 個(gè)PFGE 帶型，且DI 值為99.55%，表明PFGE 對(duì)阪崎克羅諾桿菌具有較高的分型能力。PFGE 分辨率高的優(yōu)勢(shì)，有利于菌株之間的親緣性分析和溯源，從而快速分析出感染源，減少致病菌造成的危害。然而，由于PFGE具有較低的重現(xiàn)性、無(wú)法識(shí)別酶切位點(diǎn)外的差異和不具備鑒定菌株的能力[6]，因此不利于長(zhǎng)期的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)或研究菌株之間的進(jìn)化和種系關(guān)系。

ERIC-PCR 是以腸桿菌間保守重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)生不同的DNA 圖譜，從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型和遺傳分析。Babak 等[17]采用ERICPCR 對(duì)從364 個(gè)嬰幼兒配方奶粉樣品中分離的25 株阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行分子分型，菌株被分為8 種不同的類型且具有高度的遺傳多樣性。Ye等[18]利用ERIC-PCR 分型方法將22 株來(lái)源于嬰兒配方奶粉的阪崎腸桿菌分為16 個(gè)ERIC-PCR指紋圖譜，且DI 值為93.3%，表明ERIC-PCR 具有較高的區(qū)分能力，并顯示了阪崎腸桿菌的遺傳多樣性，同時(shí)作者認(rèn)為ERIC-PCR 分型方法可用于追蹤食物鏈中阪崎腸桿菌的來(lái)源。本研究中37株阪崎克羅諾桿菌具有28 種ERIC-PCR 指紋圖譜，DI 值為98.05%，這也表明ERIC-PCR 同樣具有較強(qiáng)的分型能力。此外，ERIC-PCR 具有快捷、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)可使其迅速分析菌株之間遺傳多樣性和親緣性，從而可快速展開流行病學(xué)調(diào)查，然而PCR 擴(kuò)增結(jié)果影響因素多，需不斷優(yōu)化試驗(yàn)。

MLST 是通過(guò)擴(kuò)增菌株的管家基因，比較管家基因的核苷酸序列差異從而對(duì)菌株進(jìn)行分型，已廣泛用于即食食品、嬰幼兒配方奶粉、奶粉等食品中分離阪崎克羅諾桿菌分型[19-20]。同時(shí)，已有研究發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾桿菌ST 型與特定感染相關(guān)，如ST4 型與新生兒腦膜炎有關(guān)[21]。本研究中37 株阪崎克羅諾桿菌具有23 個(gè)ST 型，DI 值為96.04%，表明MLST 同樣具有較高的分辨率，其中有4 株阪崎克羅諾桿菌為ST4 型，對(duì)嬰幼兒健康造成威脅。MLST 分型可用于評(píng)估菌株潛在致病性。此外，已建立在線數(shù)據(jù)庫(kù)可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的全球共享和比對(duì)，有利于長(zhǎng)期流行病學(xué)調(diào)查。

PFEG、MLST 和ERIC-PCR 3 種分子分型方法均有較高的分型能力，已有文獻(xiàn)比較這3 種分型方法對(duì)空腸彎曲菌和大腸桿菌的分型能力，結(jié)果也表明3 種方法均有高度的辨識(shí)度，其中PFGE分辨率最高，其次是ERIC-PCR 和MLST[22]。然而，目前未有文獻(xiàn)比較這3 種分型方法對(duì)阪崎克羅諾桿菌的分型能力。本研究結(jié)果表明PFGE 對(duì)阪崎克羅諾桿菌的分型能力最強(qiáng)，而MLST 分型的能力相對(duì)最弱，這與已報(bào)道PFGE 分型方法對(duì)阪崎克羅諾桿菌、阪崎腸桿菌、氣單胞菌、大腸埃希菌、空腸彎曲菌、沙門氏菌、李斯特菌和銅綠假單胞菌等菌株的分型能力均略強(qiáng)于ERIC-PCR 結(jié)果一致[23-28]。此外，目前雖尚未有研究比較MSLT 和ERIC-PCR 2 種分型方法對(duì)阪崎克羅諾桿菌的分型效果，但ERIC-PCR 對(duì)肺炎克雷伯菌、空腸彎曲菌等致病菌的分型能力高于MLST[29-30]。根據(jù)對(duì)菌株的分型能力而言，3 種分型方法中PFGE 分辨率最高。

細(xì)菌分型在食品安全監(jiān)控和流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮著重要作用，傳統(tǒng)的表型方法和基于特定基因序列的分子分型方法已不能滿足對(duì)菌株的精準(zhǔn)溯源分析?；诩?xì)菌基因組分型技術(shù)可進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行精準(zhǔn)分型，且具有重復(fù)性好、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及測(cè)序費(fèi)用降低，該技術(shù)可在風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和溯源中廣泛應(yīng)用。