王勝男，曲丹妮，劉 軍，楊立娜，何余堂，劉 賀*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州 121013 2 遼寧省糧谷類食品生物高效轉(zhuǎn)化工程研究中心 遼寧錦州 121013 3 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司 山東德州 251200）

大豆種皮多糖是從大豆加工副產(chǎn)物（大豆種皮） 中分離提取的一種富含同聚半乳糖醛酸和Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸的果膠類多糖。它以半乳糖醛酸、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖為主，分子質(zhì)量范圍為104～106u[1]。Wang 等[2]研究發(fā)現(xiàn)Na+和Mg2+可誘導(dǎo)大豆種皮多糖凝膠形成，且溫度越高其凝膠結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。大豆種皮多糖具有良好的乳化性和凝膠性[3-4]，被應(yīng)用到食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域。

Zuo 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，紅松葉多糖經(jīng)乙醇分級沉淀后，單糖組成的類型、主要官能團(tuán)及抗氧化活性不變，而其單糖組成的物質(zhì)的量比有顯著差異，且隨乙醇濃度的增加，多糖相對分子質(zhì)量顯著降低。Chou 等[6]通過乙醇分級沉淀美洲楠多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)60%乙醇沉淀的楠多糖組分具有較好的吸濕性；此外，80%乙醇沉淀的楠多糖組分的β-葡聚糖、蛋白質(zhì)及糖醛酸含量均較低，抗氧化能力較強(qiáng)。Jia 等[7]探究不同濃度梯度乙醇分級沉淀對玉米絲多糖理化性質(zhì)和生物活性的影響時發(fā)現(xiàn)，80%乙醇沉淀的多糖組分的抗氧化活性最高。Guan 等[8]發(fā)現(xiàn)可以利用硫酸銨分級沉淀不同分子質(zhì)量的半纖維素，低濃度硫酸銨可沉淀出更多線性、分子質(zhì)量高的半纖維素，而高濃度硫酸銨分級沉淀的半纖維素具有支鏈更多且分子質(zhì)量低的特點(diǎn)。此外，經(jīng)較低濃度硫酸銨分級沉淀的魚鱗明膠具有更高的分子質(zhì)量、更強(qiáng)的氫鍵、更多的三螺旋結(jié)構(gòu)、更致密的微觀結(jié)構(gòu)和更高的凝膠強(qiáng)度等特點(diǎn)[9]。Shi 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硫酸銨分級的蘆薈多糖是一類具有高度乙酰化的葡甘露聚糖，且隨硫酸銨濃度的增加，蘆薈多糖的重均分子質(zhì)量從339 ku 降到67.6 ku。研究發(fā)現(xiàn)不同提取劑對提取的多糖組成、分子鏈構(gòu)象及特性有顯著影響，常用的提取劑有乙醇、草酸銨、硫酸銨等[1，11]。

本研究采用硫酸銨法分級大豆種皮多糖組分，探究分級組分的理化性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性及流變學(xué)特性等性質(zhì)，旨在探尋不同特性多糖組分，并為硫酸銨法提取大豆種皮多糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

大豆種皮（黑河43）購于遼寧錦州大豆皮經(jīng)銷公司（蛋白質(zhì)12%，纖維34%和水14%）。硫酸銨及鹽酸等其它試劑均為分析純級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JA21002 型精密電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器；800A 粉碎機(jī)，永康市紅太陽機(jī)電有限公司；PHS-25 型pH 計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TD5A-WS 型低速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；IRTracer-100 傅里葉變換紅外光譜儀、UV-2550 紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；S-4800 冷場發(fā)射掃描電鏡，日本Hitachi 公司；XE-70 原子力顯微鏡，韓國Park Systems 公司；PYRIS DIAMOND TG/DTA 熱分析儀，美國PE 公司；Rigaku Ultima IV X 射線散射儀，日本理學(xué)公司；Discovery HR-1 流變儀，美國TA 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆種皮多糖的提取 將大豆種皮粉碎并過篩（60 目）后，與體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液按1∶8（料液比）混合，攪拌24 h。在4 800 r/min 條件下離心10 min。收集沉淀物并通風(fēng)干燥過夜，然后按照料液比1∶20 加入去離子水，在80 ℃水浴磁力攪拌2 h。待冷卻后過濾，該提取過程重復(fù)兩次。合并提取兩次的濾液，在65 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的2/3，緩慢加入3 倍體積的95%乙醇使其醇沉，在室溫下放置12 h，于65 ℃恒溫干燥箱烘干[10]，得到水提大豆種皮粗多糖 （Water extraction of soy hull polysaccharide，WSHP）。

1.2.2 大豆種皮多糖的硫酸銨分級沉淀 配制2%的WSHP 水溶液，在5 000 r/min 條件下離心20 min。在上清液中緩慢加入硫酸銨，待上清液中硫酸銨質(zhì)量濃度達(dá)到40 mg/mL 靜置12 h 后在同樣離心條件下再次離心。收集沉淀物并進(jìn)行透析（Mw＜3 500 u）3 d。并用丙酮和無水乙醚混合液（v丙酮∶v無水乙醚=1∶4） 洗滌沉淀物。得到40 mg/mL硫酸銨分級沉淀的大豆種皮多糖后（ASHP40），采用同樣的方法得到60 mg/mL 硫酸銨分級沉淀的大豆種皮多糖（ASHP60）[10]。

1.2.3 多糖及蛋白含量測定 采用苯酚-硫酸法測定樣品的總糖含量[12]，以葡萄糖為標(biāo)品，在波長490 nm 處測定吸光度。

采用BCA 蛋白濃度試劑盒比色法測定樣品的蛋白質(zhì)含量[13]，在波長562 nm 處測定吸光度。

1.2.4 相對分子質(zhì)量 采用高效凝膠滲透色譜法測定WSHP、ASHP40 和ASHP60 的相對分子質(zhì)量。將20 mg WSHP、ASHP40 和ASHP60 分別溶解于2 mL 0.1 mol/L NaNO3溶液中，并在15 000 r/min 離心10 min。將20 μL 樣品過0.22 μm 濾膜，并注入300 mm×7.8 mm×2 mm 的 UltrahydrogelTMLinear 柱，流速為0.9 mL/min，柱溫保持45 ℃，利用DextranT 系列標(biāo)準(zhǔn)品（1.338×105，4.11×104，2.5×103，1×103u）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

1.2.5 單糖組成 利用高效離子色譜（Carbopac PA20 column，150 mm ×3 mm） 分析 WSHP、ASHP40 和ASHP60 的單糖組成[15]。將5 mg 多糖樣品分別溶解于10 mL 的4 mol/L 三氟乙酸，于100～110 ℃水解6 h，多次添加甲醇并利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除，氮吹儀吹干后，用去離子水稀釋20 倍。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR） 利用壓片機(jī) 將WSHP、ASHP40 和ASHP60 分別與KBr 壓片，掃描范圍為400～4 000 cm-1[14]。

1.2.7 掃描電鏡 （SEM） 取粉碎后的WSHP、ASHP40 和ASHP60 樣品各1 mg，噴金15 min，在0.5～30 kV 下放大400 倍、10 000 倍觀察多糖樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.8 原子力顯微鏡（AFM） 將WSHP、ASHP40和ASHP60 樣品溶解于去離子水，配制成5 mg/mL溶液。取5 μL 多糖于云母片上，待干燥后，利用原子力顯微鏡觀察多糖的分子構(gòu)象（5 μm×5 μm）[16]。

1.2.9 熱分析（TG） 將一定量的WSHP、ASHP40和ASHP60 放入坩堝中，在氮?dú)饬魉贋?0 mL/min的環(huán)境下，升溫速率為10 ℃/min 條件下，檢測樣品在25～800 ℃范圍內(nèi)的失重情況[17]。

1.2.10 流變學(xué)特性 將120 mg WSHP，ASHP40和ASHP60 溶解在6 mL 去離子水中，在室溫下使用直徑40 mm 的平行板，間隙0.5 mm，剪切速率0.1～100 s-1的條件下測定其流變學(xué)特性[11]。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用Origin 9.0 軟件繪圖，采用SPSS 20 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖、蛋白質(zhì)含量及相對分子質(zhì)量

WSHP、ASHP40 和ASHP60 的多糖含量，蛋白質(zhì)含量和相對分子質(zhì)量結(jié)果見表1。由表1可知，ASHP40 中的總糖含量最高，可達(dá)55.67%，其次是ASHP60，總糖含量為38.47%，比WSHP 的多糖含量分別高25.60%和8.4%。硫酸銨分級組分的總糖含量提高，而其蛋白質(zhì)含量顯著降低（P＜0.05），且隨著硫酸銨質(zhì)量濃度增加，組分中蛋白質(zhì)含量也隨之降低。此外，WSHP、ASHP40 和ASHP60 的相對分子質(zhì)量分別為2 031.1，1 140.4 ku 和1 103.3 ku，說明經(jīng)過硫酸銨分級沉淀后多糖的相對分子質(zhì)量降低。最后，ASHP40 的Wi值最高，可達(dá)13.82，表明經(jīng)過40%硫酸銨分級沉淀的大豆種皮多糖組分其多分散性最高。

表1 WSHP、ASHP40 和ASHP60 的相對分子質(zhì)量、總糖含量和蛋白含量Table 1 Relative molecular weight，polysaccharide content，protein content of WSHP，ASHP40 and ASHP60

2.2 單糖組成

WSHP、ASHP40 和ASHP60 的單糖組成見表2。從表2可知3 種多糖均含有半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、巖藻糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖等9 種單糖組成。WSHP 主要由半乳糖（25.40%），甘露糖（22.40%），鼠李糖（17.10%） 和半乳糖醛酸（14.44%） 組成。然而，ASHP40 和ASHP60 均主要由木糖和半乳糖組成且均不含甘露糖。由此可見，大豆種皮多糖經(jīng)過硫酸銨分級沉淀后，各多糖組分的單糖組成發(fā)生明顯變化。ASHP40 和ASHP60 的木糖含量分別比WSHP 高48.36%和50.31%；半乳糖含量分別比WSHP 高5.05%和3.53%；且阿拉伯多糖含量分別比WSHP 低1.71%和1.61%。因此，硫酸銨分級沉淀大豆種皮多糖可能是主要通過改變其單糖組成，進(jìn)而對其微觀結(jié)構(gòu)和性能產(chǎn)生影響。

2.3 結(jié)構(gòu)分析

采用FT-IR 研究3 種多糖組分的結(jié)構(gòu)差異，WSHP、ASHP40 和ASHP60 紅外光譜圖見圖1。由圖可知在3 410 cm-1附近的寬而強(qiáng)的吸收峰歸因于O-H 的拉伸振動。此外，從紅外光譜圖可以看出，ASHPA40 和ASHP60 在3 410 cm-1附近有朝高頻方向移動的趨勢，即出現(xiàn)了藍(lán)移現(xiàn)象，這是由于電子受體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重組[18]。在2 930 cm-1附近的窄而弱的吸收峰是糖環(huán)中含CH，CH2和CH3的C-H 的共振引起的[18]。WSHP、ASHPA40 和ASHP60在1 550，1 400 cm-1和1 320 cm-1處均有吸收峰，分別是N-H 變角振動，C-O 拉伸振動和O-H 變角振動產(chǎn) 生的[15]。然而，ASHP40 和ASHP60 在1 320 cm-1處有紅移現(xiàn)象的出現(xiàn)，這是多糖分子形成氫鍵締合后，電偶極距增大，逐漸形成分子內(nèi)部氫鍵。同時，WSHP、ASHP40 和ASHP60 在1 423，1 143 cm-1和1 082 cm-1處的峰值處具有C-O 拉伸振動，這可能是C-O-C 鍵或-COOH 基的特征吸收峰[19]。此外，從多糖的指紋圖譜區(qū)域可觀察到，WSHP、ASHP40 和ASHP60 的糖環(huán)類型均是吡喃糖，且在810 cm-1處有α-D-半乳糖苷的特征吸收峰。然而，WSHP 在894 cm-1處有β-D-甘露糖糖苷的特征吸收峰，ASHP40 和ASHP60 在871～875 cm-1處出現(xiàn)了明顯的尖銳的吸收峰，這是α-D-木糖糖苷的特征峰[20]。關(guān)于糖苷類型的判斷與上述單糖組成結(jié)果一致（表2）。總之，WSHP、ASHP40 和ASHP60 是含有羥基、羧基、氨基和醚鍵的α-D-吡喃半乳糖，而WSHP 與ASHP40 和ASHP60 氫鍵的形成和單糖糖苷類型的不同可能對多糖分子的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

圖1 WSHP、ASHP40 和ASHP60 紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of WSHP，ASHP40 and ASHP60

表2 WSHP、ASHP40 和ASHP60 的單糖組成（%）Table 2 Monosaccharide composition of WSHP，ASHP40 and ASHP60 （%）

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

為了進(jìn)一步探究多糖組分的微觀結(jié)構(gòu)差異，采用了掃描電鏡觀察了WSHP、ASHP40 和ASHP60 表面微觀結(jié)構(gòu)（見圖2）。從圖2（a，d）可以觀察到，WSHP 呈不規(guī)則片狀，表面結(jié)構(gòu)致密，略有碎屑。這是可能是由于在熱水浸提的過程中，沒有引入其它的鹽離子等多余物質(zhì)，對其表面微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用較小。然而，從圖2（b 和e，c 和f）中可以看出，ASHP40 和ASHP60 均呈不規(guī)則塊狀的形態(tài)，ASHP40 表面粗糙且沒有可見的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而ASHP60 具有疏松多孔且清晰的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。原因可能是隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加，多糖中的某些支鏈與其結(jié)合，并在透析脫鹽的過程中被除去，從而導(dǎo)致多糖表面微觀結(jié)構(gòu)的粗糙程度增加[21]。這與ASHP40 和ASHP60 的相對分子質(zhì)量低于WSHP 的結(jié)果相吻合（表1）。然而，在本研究中，從單糖組成的結(jié)果中可以看出 （表2），ASHP40 和ASHP60 的半乳糖和木糖含量均高于WSHP，阿拉伯糖含量低于WSHP，多糖組分中單糖的含量變化也可能對多糖表面粗糙程度產(chǎn)生影響。同樣，Peng 等[22]的研究也證明從竹子中分離提取半纖維素的微觀結(jié)構(gòu)與其單糖組成密切相關(guān)，且研究發(fā)現(xiàn)高含量的阿拉伯糖使得半纖維素結(jié)構(gòu)更致密，這是由于阿拉伯糖可以與帶電基團(tuán)形成氫鍵。此外，還可能是隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加，導(dǎo)致多糖組分分子內(nèi)部氫鍵的增加，使其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸清晰可見，這與前述的FT-IR 的結(jié)果可以相互印證（圖1）。Hou 等[23]的研究也發(fā)現(xiàn)，多糖微觀結(jié)構(gòu)的變化主要?dú)w因于分子間和分子內(nèi)部氫鍵的形成。上述研究結(jié)論與本文的研究現(xiàn)象相一致。因此，多糖微觀結(jié)構(gòu)的改變與其相對分子質(zhì)量、單糖組成及官能團(tuán)是否鍵合成氫鍵的變化息息相關(guān)。

圖2 WSHP、ASHP40 和ASHP60 的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of WSHP，ASHP40 and ASHP60

2.5 分子鏈構(gòu)象

為了深入探究硫酸銨分級對大豆種皮多糖微觀結(jié)構(gòu)的影響，本研究采用原子力顯微鏡表征了多糖分子鏈構(gòu)象。質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的WSHP、ASHP40 和ASHP60 在云母片上干燥后所觀察到的多糖鏈構(gòu)象及形貌如圖3所示。圖3a 可以觀察到WSHP 的多糖構(gòu)象主要是由規(guī)則且表面光滑的球狀體組成，其球狀體的長度約為220～659 nm，寬度約為293～366 nm，高度約為40～120 nm。ASHP40（圖3b）的多糖構(gòu)象呈現(xiàn)出不規(guī)則形態(tài)，且表面粗糙度增加。ASHP60 的多糖構(gòu)象如圖3c所示，其表面最粗糙的且形貌類似棉花。這與WSHP、ASHP40 和ASHP60 的掃描電鏡結(jié)果相一致。此外，在圖3b 和c 中可以觀察到ASHP40 和ASHP60 的高度分別為20～40 nm 和25～50 nm，均低于WSHP，這可能是由于ASHP40 和ASHP60的半乳糖醛酸含量的降低，羧基或羧基中的氫原子與多糖的氧原子結(jié)合形成氫鍵，使其多糖高度顯著增加[24]。Anna 等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，糖醛酸含量對多糖的構(gòu)象和聚集有顯著影響。

圖3 WSHP、ASHP40 和ASHP60 的原子力顯微鏡圖Fig.3 AFM of WSHP，ASHP40 and ASHP60

2.6 熱穩(wěn)定性

本研究利用熱重分析儀分析了WSHP、ASHP40 和ASHP60 的熱穩(wěn)定性。如圖4所示，3種多糖在30～800 ℃的溫度范圍內(nèi)均有3 個明顯的失重階段，第1 個失重階段發(fā)生在30～200 ℃，失重率約10%左右。這個階段主要是由于多糖中少量的游離水的蒸發(fā)所致[26]；其次，第2 個失重階段是在200～400 ℃，也是最主要的失重階段，樣品的失重率大約60%。主要是多糖中結(jié)合水的減少導(dǎo)致[27]；最后1 個失重階段在400～800 ℃，是多糖鏈碳化裂解產(chǎn)生的，失重率大約在20%。從圖4中可以看出，失重率最高的是ASHP60，最低的是WSHP，說明硫酸銨分級的多糖組分熱穩(wěn)定性較差。多糖的熱穩(wěn)定性與其微觀表面結(jié)構(gòu)息息相關(guān)[28]，從掃描電鏡（圖2）和原子力顯微鏡（圖3）的結(jié)果可知，ASHP40 和ASHP60 的結(jié)構(gòu)較為疏松，而WSHP 的表面微觀結(jié)構(gòu)更為致密，這是導(dǎo)致WSHP、ASHP40 和ASHP60 熱穩(wěn)定性差異的主要原因。

圖4 WSHP、ASHP40 和ASHP60 的熱重圖Fig.4 Thermogravimetric of WSHP，ASHP40 and ASHP60

2.7 流變學(xué)特性

本研究主要通過界面剪切流變學(xué)探究了不同質(zhì)量濃度的硫酸銨分級大豆種皮多糖組分的流變學(xué)特性。如圖5所示W(wǎng)SHP、ASHP40 和ASHP60（質(zhì)量濃度為20 mg/mL）均是假塑性流體[29]。在低剪切速率條件下 （0.1～1 s-1），WSHP、ASHP40 和ASHP60 的表觀黏度均隨剪切速率的增加而降低，可能是分子間作用力降低，多糖溶液中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞以及多糖分子向特定方向重新排列，從而產(chǎn)生較小的流動阻力，即出現(xiàn)了剪切稀化現(xiàn)象[30]。同時，當(dāng)剪切速率接近1 s-1時，3 種多糖的表觀黏度均趨于一致，并且剪切速率的增加對多糖溶液黏度的影響逐漸降低。此外，3 種多糖溶液在不同剪切速率下的黏度變化率不同。在低剪切速率下，多糖溶液的黏度變化快，而在高剪切速率下，溶液黏度的變化慢，這可能是由于多糖分子在低剪切速率的相互作用較大[31]。

圖5 WSHP、ASHP40 和ASHP60 的穩(wěn)態(tài)剪切流變圖Fig.5 Steady shear flow curves of WSHP，ASHP40 and ASHP60

3 結(jié)論

本研究對比了WSHP、ASHP40 和ASHP60 的組成成分和表面微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)WSHP 主要由半乳糖、甘露糖、鼠李糖和半乳糖醛酸等單糖組成，且相對分子質(zhì)量最大，可達(dá)2 031.1 ku，表面微觀結(jié)構(gòu)致密。然而，ASHP40 和ASHP60 主要由木糖和半乳糖組成，且相對分子質(zhì)量較WSHP 低，表面也呈疏松多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，3 種多糖組成成分和微觀結(jié)構(gòu)差異顯著。進(jìn)一步地探究了WSHP、ASHP40 和ASHP60 熱穩(wěn)定性和流變學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)硫酸銨分級大豆種皮多糖組分的熱穩(wěn)定性降低，表觀黏度低。因此，本研究證實(shí)了硫酸銨分級沉淀法分離的大豆種皮多糖組分具有不同的組成成分和微觀結(jié)構(gòu)，致使其熱穩(wěn)定性和流變特性差異顯著。本研究為深入研究大豆種皮多糖提取方法及其性質(zhì)的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。