牛付閣，胡得妹，張秀真，杜藝軒，張 斌，馬 爽，潘偉春

（浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州 310018）

秘魯魷魚產(chǎn)量豐富，物美價廉，特別是營養(yǎng)價值高。含有8 種人體必需氨基酸，且魚肉中的微量元素具有高鉀低鈉的特點，這些特點足以讓人們把目光聚焦在魷魚上，魷魚也因此成為銷量逐年上升的海產(chǎn)品[1]。目前，魷魚的主要加工方式是制作成魚糜，對魚糜原材料的要求主要是凝膠性能好，然而受到所含蛋白溶解度高、凝膠性能差、有特定的異味（酸、澀）等的限制[2]，魷魚在食品加工中的應用并不充分，利用價值低，導致資源的浪費。

蛋白質(zhì)是一類復雜多變的生物大分子，其結構和性能密切相關。建立蛋白結構與蛋白凝膠特性間的聯(lián)系，利用各種物理和化學手段調(diào)控蛋白的結構以優(yōu)化其凝膠性能，是目前食品加工過程中常用的技術策略，如利用多糖與蛋白之間的互作形成多糖-蛋白凝膠[3]，加入凝膠強化劑[4]，改變其外界環(huán)境條件[5]等。肌原纖維蛋白是秘魯魷魚蛋白形成凝膠過程中的主要作用成分，它由肌動蛋白（AC）、原肌球蛋白（TM）及副肌球蛋白（PM）等單質(zhì)蛋白組成[6]。為生產(chǎn)出大眾所接受和喜愛的產(chǎn)品，需進一步研究肌原纖維蛋白的結構與性能[7]。由于肌原纖維蛋白含多組分蛋白，且蛋白間存在強相互作用，這些作用力不僅會影響蛋白質(zhì)整個失活過程，對調(diào)節(jié)不同分子間的交聯(lián)過程也起到一定的作用[8]。因為這些表征參數(shù)大多取決于肌原纖維蛋白的組成成分，所以整體表征肌原纖維蛋白幾乎是不可能的。肌原纖維蛋白組成的細微變化，可能引起這些理化指標的巨大差異，導致食品實際生產(chǎn)過程中經(jīng)驗遠比理論模型更常用。理論系：Bottom-up 方法是目前解決這類問題很常見的科研策略。獲取高純度的單個組分是這一策略能否實施的關鍵。然而，秘魯魷魚肌原纖維蛋白溶液中的蛋白納米顆粒（Nano protein particle）的存在[9]揭示各組分間存在強相互作用，是分離純化該體系的主要障礙。同時多組分的存在導致各組分在溶液中的濃度很低，進一步增大了體系分離純化的難度；此外，分離純化前目標蛋白質(zhì)分子自身的折疊會影響分離純化的pH 值、溫度和壓力等條件。因此常用的條件為室溫或低溫、常壓以及pH 值接近等電點。這些制約條件使實驗者不得不采用特殊的分離純化儀器（蛋白純化系統(tǒng)）和單元操作（色譜分離純化技術）。同時，為達到分離純化蛋白的目的，研究者需優(yōu)化分離程序，包括色譜柱的選型，不同色譜柱的排序，色譜柱的操作條件。

目前，對肌原纖維蛋白的研究主要集中在外界環(huán)境條件，如pH 值、壓強和溫度等對其凝膠性能的影響，如林偉偉等[10]研究pH 值和KCl 對肌原纖維蛋白的影響；廖慧琦等[11]研究NaCl 不同添加量對大黃魚肌原纖維蛋白凝膠性能的影響；韓柯穎等[12]通過控制微波功率和時間，研究溫度對雞胸肉肌原纖維蛋白凝膠性能的影響；李釗等[13]研究超高壓對肌原纖維蛋白凝膠性能的影響。然而，目前尚未見從秘魯魷魚中分離純化出單體蛋白的報道。蛋白質(zhì)結構復雜，為全面了解其結構和性能之間的關系，本研究通過陰離子交換層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的技術，從多組分且存在強相互作用的蛋白體系中分離純化出較高純度的單質(zhì)蛋白，為食品蛋白構效關系的研究提供更精準的模型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

秘魯魷魚（4.5±1.5）kg，舟山第二海洋漁業(yè)公司；曲拉通-X10、Tris，美國Amrosco 公司；30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺預混液（質(zhì)量比29∶1）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED），美國BIORAD 公司；即用型蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準Marker（6.5～200 ku），杭州寶誠生物技術有限公司；酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氫氧化鈉、乙醇等分析純級試劑均來自于杭州捷誠生物科技有限公司。

1.2 試劑制備

1.2.1 磷酸鹽緩沖液 pH 7.5，10 mmol/L EDTA，3.5 mmol/L KH2PO4，15.6 mmol/L Na2HPO4。

1.2.2 上樣緩沖液 2 mL 的Tris-HCl 0.5 mol/L，（pH 6.8）+4 mL 10% SDS+2 mL 甘油+0.05 mL 1% 溴酚藍，超純水定容至10 mL，4 ℃保存。試驗前加入200 mmol/L DTT（v上樣緩沖液∶mDTT=1∶0.03）。

1.2.3 脫色液 40%無水乙醇+10%冰醋酸+50%去離子水。

1.2.4 緩沖液 緩沖液A：含0.1 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖溶液；緩沖液B：含0.15 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液。

1.2.5 考馬斯亮藍染液 100 mg 考馬斯亮藍G-250+50 mL 90%的乙醇+100 mL 80%的磷酸，超純水稀釋至1 L。

1.3 試驗儀器與設備

變性梯度凝膠電泳儀、GS800 高分辨光密度掃描儀，美國BIO-RAD 公司；HPLC-1260KW-804 液相色譜儀，美國Agilent 公司；Millipore-Q超純水儀，美國MILLIPORE 有限公司；AKTA 蛋白純化儀，美國GE 公司；ALVCGS-3 廣角光散射儀，德國ALV 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 肌原纖維蛋白的提取 參考Hashimoto等[14]的方法，稱取25 g 秘魯魷魚胴體肉（去除魚皮、骨頭、內(nèi)臟、眼球、尾巴等），加入200 mL 磷酸鹽緩沖液和50 mL 1%曲拉通（Triton），用IKA 組織勻漿機勻漿（1 000 r/min），整個勻漿過程在冰浴上進行，每勻漿30 s 停30 s，重復5 次，最后一次得到的勻漿液用2 層紗布過濾得到濾液，離心（冷凍離心機，8 000×g，10 min，4 ℃），沉淀用10 倍體積的緩沖液B 漂洗，離心，將以上過程重復進行3次，最后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.4.2 肌原纖維蛋白溶液的制備 磷酸鹽緩沖液先抽濾（0.22 μm 濾膜）再超聲30 min。將上述肌原纖維蛋白沉淀在4 ℃下按一定的質(zhì)量比充分溶解在磷酸鹽緩沖液中后離心，取上清液過0.45 μm濾膜即為目標溶液。

1.4.3 考馬斯亮藍G-250 染色法測定蛋白濃度采用Brodford 法對肌原纖維蛋白進行定量，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白。配置濃度梯度的牛血清蛋白溶液1 mL，加入考馬斯亮藍染色液5 mL，充分混勻反應5 min，用紫外分光光度計測定溶液在波長595 nm 處的吸光值，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算出肌原纖維蛋白的濃度。

1.4.4 秘魯魷魚肌原纖維蛋白分離純化 將提取得到的肌原纖維蛋白溶液過HiTrap Q FF 16 離子交換層析，用含0.15～1 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖溶液進行梯度洗脫，洗脫流速為3 mL/min，收集各峰洗脫液超濾濃縮脫鹽，然后過SurperdexTM 200 10/300 凝膠層析，用1 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖溶液進行洗脫，洗脫流速為0.5 mL/min，收集各峰洗脫液超濾濃縮脫鹽，進行純度鑒定[7]。

1.4.5 蛋白的SDS-PAGE 分析

1.4.5.1 梯度膠的制備 按配方配制6%～18%的梯度膠，然后用BioRad 梯度膠灌膠器進行灌膠，制成蛋白變性單向電泳所用的梯度膠。

1.4.5.2 制樣 用提取液及鹽溶液將蛋白溶液稀釋至適合的倍數(shù)（3～5 mg/mL），然后按體積比1∶1加入上樣緩沖液，于沸水中煮沸3～5 min。

1.4.5.3 上樣 將10 μL 蛋白Marker 及煮沸過的樣品依次加入膠孔。

1.4.5.4 電泳 凝膠板通電電泳，30 min 后將電壓由70 V 調(diào)到110 V，當溴酚藍移動到離膠板下沿約1 cm 時，停止電泳。

1.4.5.5 染色 取出凝膠放在考馬斯亮藍G-250染色液中染色2 h 以上，過程中保護膠面不被污染。

1.4.5.6 脫色 將染好的凝膠放入脫色液中脫色至蛋白條帶清晰。

1.4.5.7 膠圖像掃描和分析 用GS-800 光密度掃描儀對染色后的凝膠進行掃描（光學分辨率為300 DPx，像素標準為8 bits）。為保證重復性，對每個樣品的蛋白質(zhì)電泳重復3 次。

1.4.6 HiTrap Q FF 16 離子交換層析 在溫度為4 ℃的冰箱中，將提取得到得肌原纖維蛋白按照質(zhì)量比1∶3 溶解在緩沖液A 中，充分溶解過夜后離心10 min （5 000×g，4 ℃），取上清液過0.45 μm 的微孔濾膜；上樣量5 mL，起始緩沖液為緩沖液A，洗脫緩沖液為緩沖液B，速度為2 mL/min，洗脫梯度為30%，50%和100%。

1.4.7 SurperdexTM 200 10/300 凝膠層析柱分離純化 將離子交換層析得到的蛋白組分峰用Millipore 超濾管 （微孔超濾管） 濃縮脫鹽，再用SurperdexTM 200 10/300 凝膠層析柱分離純化，上樣量500 μL，洗脫液用緩沖液A，洗脫流速為0.5 mL/min，用分步收集器收集，每管0.5 mL。

1.4.8 HPLC 測定蛋白的純度 利用高效液相色譜儀自帶的KW-804 凝膠蛋白柱（排阻極限為106Pa）分離純化，所需的流動相為緩沖溶液A，在室溫下以0.5 mL/min 的速度進行分離，在波長280 nm 處檢測蛋白含量。

1.4.9 MALDI-TOF 蛋白的鑒定 收集經(jīng)凝膠電泳分離得到的單一條帶，重新溶解提取蛋白質(zhì)，然后利用MALDI-TOF/MS 對分離得到的蛋白質(zhì)進行鑒定，并將獲得的信息與數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.4.10 動態(tài)光散射粒徑分析 利用激光光散射儀對純化得到的蛋白質(zhì)粒徑進行表征，測量參數(shù)為（波長628 nm，角度90°，溫度25 ℃），每次累積30 s，平行測量3 次。

2 結果與分析

2.1 離子交換層析分離蛋白的結果分析

如圖1所示，經(jīng)過離子交換層析分離后，肌原纖維蛋白溶液中總共分離出5 個組分峰，峰A 為沒有被凝膠柱吸附的組分；峰B 和C 顯示這兩組分峰沒有完全分開，但依然依次收集；峰D 和E可單獨收集，收集得到的各洗脫液取少量做SDSPAGE 檢測，其余的用Millipore 超濾管進行濃縮脫鹽處理。

圖1 肌原纖維蛋白的分離洗脫曲線圖Fig.1 Isolation and elution diagram of myofibril protein

2.2 SDS-PAGE 凝膠電泳結果鑒定

由圖2可知，電泳條帶A 中顏色較深的為肌動蛋白，較淺的條帶為少量的副肌球蛋白和肌球蛋白重鏈；電泳條帶B 和C 為30%的洗脫液分離的組分峰，由于沒有完全分離所以收集的時候界面不明確，導致電泳條帶中兩組分種類類似，都含有較多的副肌球蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白；電泳條帶D 中主要成分是肌動蛋白和原肌球蛋白；在電泳條帶E 中顯示出單一條帶，主要成分為肌動蛋白，分子質(zhì)量為44.3 ku。單純選擇離子交換層析技術分離肌原纖維蛋白，僅能從洗脫峰E 中得到電泳純的肌動蛋白，且純化得到的蛋白量較少。而其它洗脫峰中肌動蛋白含量雖然高，但是不能得到較純的單一蛋白質(zhì)，因此還需要結合其它層析柱進一步分離純化。

圖2 離子柱分離得到的各洗脫液的SDS-PAGE 電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoretogram of each eluent obtained by ion column separation

2.3 凝膠層析柱分離純化的結果分析

如圖3a所示，收集液A 用凝膠柱分離后得到3 個洗脫峰，分別標記為AA、AB 和AC；收集液B 進一步分離得到3～4 個洗脫峰，由圖3b 可看出幾個峰依然沒有完全分離開；而50%洗脫峰被進一步分離出3 個峰，分別被命名為DA、DB、DC，由圖3c（30%洗脫峰）可看出分離度良好。對比圖3a 和3d 可以看出，峰AA 和DA 被分離出時所需的洗脫液的體積和出峰位置相似，初步猜測這兩個峰可能含有相同的蛋白組分。收集每個洗脫峰溶液，經(jīng)濃縮脫鹽后用于SDS-PAGE 電泳鑒定。

圖3 凝膠柱分離肌原纖維蛋白的洗脫峰Fig.3 Separation of elution peak from myofibrillar protein by gel column

2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳結果

用Millipore 超濾管（截留分子質(zhì)量為10 ku）濃縮經(jīng)凝膠層析得到的所有洗脫峰用于SDSPAGE 進行純度鑒定，鑒定結果如圖4所示。

如圖4所示，泳道AA、AB、DA 和DC 均顯示出分子質(zhì)量約44.3 ku 的均勻單一條帶。根據(jù)文獻可知，這些條帶均為電泳純肌動蛋白。而BA 泳道中不僅含有肌動蛋白還有較多的復肌球；從BC泳道中分離得到了肌動蛋白、原肌球蛋白以及少量的副肌球蛋白；DB 峰只能得到肌動蛋白和原肌球蛋白的復合物；C 峰 （即CA、CB、CC、CD 峰）的副肌球蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白沒有分離；AC 峰未檢測到蛋白質(zhì)。

圖4 凝膠柱分離得到的各洗脫液的SDS-PAGE 電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoretogram of each eluent obtained by gel column separation

綜上所述，秘魯魷魚肌原纖維蛋白經(jīng)離子交換柱和凝膠色譜法柱聯(lián)合處理后，可從AA、AB、DA 和DC 洗脫液中得到較純的肌動蛋白（電泳純級）。

2.5 肌動蛋白的高效液相色譜洗脫峰分布

由以上結果可知，肌動蛋白可從峰AA、AB、DA 及DC 中獲得，對于該蛋白純度的檢測，以從DA 峰中收集到的蛋白液為代表，檢測結果顯示為單一、對稱性良好的峰，說明肌動蛋白在層析介質(zhì)上是均一的（除去鹽離子所引起的吸收峰）。

2.6 肌動蛋白的MALDI-TOF-MS 鑒定及純度分析

利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析分離純化得到的肌動蛋白，然后根據(jù)數(shù)據(jù)庫比對，獲得肌動蛋白的信息（圖6）。

圖6 肌動蛋白的MS/MS 質(zhì)譜圖Fig.6 MS/MS mass spectra of actin

由表1可知，Mascot 峰值為829，而當Mascot峰值≥95 時即為鑒定成功，說明經(jīng)過離子交換色譜和凝膠色譜聯(lián)合從肌原纖維蛋白中分離得到了電泳純和色譜純的肌動蛋白。

表1 肌動蛋白的鑒定Table 1 Identification of actin

2.7 肌動蛋白粒徑分布

由圖7可知，在0.15 mol/L KCl 鹽溶液條件下，肌動蛋白光強度自相關衰減速度較快，在弛豫時間為1.64 ms 時達到最低點，說明該溶液肌動蛋白溶解性良好。由圖8可知，肌動蛋白溶液的粒徑分布呈單峰狀態(tài)，對稱性好，說明溶液體系比較均勻，進一步間接說明本試驗純化的肌動蛋白相對純凈。肌動蛋白在0.15 mol/L KCl 中的平均水力半徑（Rh）為3.46 nm，這與Kanzaki 等[15]的測定結果一致，說明該方法獲得的肌動蛋白保持了其天然的結構，未發(fā)生變性聚集。

圖5 肌動蛋白的高效液相色譜分析Fig.5 HPLC analysis of actin

圖7 肌動蛋白溶液的自相關函數(shù)分布Fig.7 Autocorrelation function distribution of actin solution

圖8 肌動蛋白溶液的粒徑分布圖Fig.8 Particle size distribution of actin solution

3 結論

整個分離純化肌動蛋白流程中均沒有加入蛋白酶抑制劑EDTA，提取液用磷酸鹽緩沖液分步洗脫，梯度30%，50%，100%，洗脫流速2 mL/min，肌原纖維蛋白過離子柱后，獲得5 個洗脫峰，100%洗脫峰E 中獲得電泳純肌動蛋白，其余的洗脫峰再進一步利用凝膠柱分離純化，在A 峰和D峰中獲得較高純度的肌動蛋白；SDS-PAGE 和HPLC 分析結果顯示肌動蛋白為電泳純級和色譜純級蛋白，經(jīng)MALDI-TOF-MS 進一步驗證確定所得到的蛋白質(zhì)為肌動蛋白。利用動態(tài)光散射多所獲得的肌動蛋白進行了表征，0.15 mol/L KCl 中光強自相關衰減速率較快，弛豫時間1.64 ms 處達到最小值，肌動蛋白水力學半徑（Rh）為3.46 nm，說

明獲得的肌動蛋白保持了其天然結構，未發(fā)生變性聚集。本研究詳細探討了秘魯魷魚肌動蛋白的分離純化，對進一步分析秘魯魷魚蛋白之間的構效關系和產(chǎn)品開發(fā)具有重要的意義。