鄧祥宜，李煒瑋，徐 耀，胡 澳，鮑曉龍，李 琳

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院 武漢 430205）

柑橘皮渣是柑橘加工的副產(chǎn)物，約占全果的40%～50%[1]，含有較多的黃酮類化合物。黃酮具有降血糖[2-3]、降血脂[4]、抑菌[5]、抗氧化[6-7]、抗炎等功效，在食品、化妝品、醫(yī)藥工業(yè)都有很高的應(yīng)用價(jià)值。很多研究表明，多酚類化合物（包括黃酮類）對(duì)蛋白酶[8]、淀粉酶[9]、脂肪酶[10-11]等消化酶活性有抑制作用。通過抑制淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活力來降低淀粉消化速率是多酚類化合物降低餐后血糖的機(jī)理之一[2，12]。然而，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柑橘黃酮（用0.05 mmol/L NaOH 溶解后HCl 調(diào)pH 值至8.0）對(duì)胰淀粉酶有激活作用，且與黃酮加入量呈正相關(guān)，而醇溶的柑橘黃酮（減壓蒸餾去除酒精）無明顯激活作用，推測激活作用可能與黃酮溶解方法有關(guān)。考慮到Cl-對(duì)唾液淀粉酶有激活作用[13]，推測NaCl 可能對(duì)胰淀粉酶有激活作用。

為弄清Cl-和柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶活性的影響，本試驗(yàn)研究Cl-對(duì)胰淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的影響；在有（或無）Cl-基礎(chǔ)上研究柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶活性及淀粉消化的影響；通過熒光光譜法研究Cl-和柑橘黃酮與胰淀粉酶的作用機(jī)制，以期為柑橘黃酮在保健品中的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柑橘黃酮（黃酮含量≥60%），西安森冉生物工程有限公司；豬胰α-淀粉酶（12 U/mg）和柚皮苷（≥95%），上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

RF-6000 熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；FA2104B 型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；HH-6 型數(shù)顯水浴鍋，江蘇國華電器有限公司；UV2150 紫外-可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 胰淀粉酶酶促反應(yīng)速度（酶活力）的測定方法 采用DNS 法制作麥芽糖標(biāo)曲[14]。以麥芽糖含量x（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光值y（OD540nm）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為y=0.8067x-0.029，R2=0.9996。

胰淀粉酶酶促反應(yīng)速度按以下方法測定[15]：以2%可溶性淀粉為底物，在一定溫度、一定pH值（0.05 mol/L 磷酸緩沖液）條件下反應(yīng)10 min，采用DNS 法測定酶促反應(yīng)產(chǎn)生的麥芽糖的量，計(jì)算酶促反應(yīng)速度，用來表征酶活大小。

1.2.2 Cl-對(duì)胰淀粉酶活力影響的測定方法 取4支離心管，以蒸餾水為對(duì)照，在Na+濃度相同的條件下，比較Cl-、SO42-、NO3-對(duì)胰淀粉酶活力的影響。同時(shí)，研究不同濃度Cl-對(duì)胰淀粉酶活力的影響。酶活測定方法參照1.2.1 節(jié)，試驗(yàn)設(shè)3 組平行，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.2.3 Cl-對(duì)胰淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)影響的測定方法研究10 mmol/L Cl-對(duì)胰淀粉酶最適溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性（不同溫度下處理30 min）和pH 穩(wěn)定性的影響（不同pH 值下4 ℃過夜）。另外，在測定熱處理（不同溫度下處理30 min）后的胰淀粉酶活力時(shí)，研究10 mmol/L Cl-能否恢復(fù)（或激活）熱處理失活的胰淀粉酶。通過繪制雙倒數(shù)曲線，測定添加10 mmol/L Cl-對(duì)胰淀粉酶Km、Vmax和Kcat的影響。試驗(yàn)以不加Cl-為對(duì)照，至少重復(fù)3 次。

1.2.4 Cl-和柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶活力影響的測定方法 研究不同添加量（0.0，0.1，0.3，1.0 mg）的柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶活力的影響；另外，在各梯度中添加10 mmol/L Cl-，研究Cl-存在時(shí)柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶活力的影響，試驗(yàn)設(shè)3 組平行，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.2.5 Cl-和柑橘黃酮對(duì)淀粉體外消化的影響 采用體外模擬消化的方法研究Cl-和柑橘黃酮對(duì)淀粉消化的影響，試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[16]。柑橘黃酮終質(zhì)量濃度和Cl-終濃度根據(jù)推算的濃度確定，共4 種處理，每種處理重復(fù)測定4 次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

黃酮終質(zhì)量濃度的推算方法如下：按照成人每次服用140 mg 柑橘黃酮、食物消化體系（含消化液） 按2.5 L 計(jì)，黃酮終質(zhì)量濃度約0.056 mg/mL。Cl-終濃度推算方法如下：10 mmol/L Cl-相當(dāng)于每頓從食物中攝入1.5 g NaCl，每日約4.5 g，與我國居民膳食指南提倡的每人每日食鹽量 （6 g）接近。

1.2.6 Cl-和柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響

1.2.6.1 柑橘黃酮與胰淀粉酶相互作用的測定[17-18]將胰淀粉酶（終質(zhì)量濃度0.15 mg/mL）與柑橘黃酮溶液（終質(zhì)量濃度0～0.0134 mg/mL）混合，分別在20 ℃（293 K）和35 ℃（308 K）恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 min，用熒光分光光度計(jì) （激發(fā)光波長280 nm）以200 nm/min 的速度掃描發(fā)射光譜（300～420 nm），狹縫寬5 nm。每個(gè)梯度設(shè)置3 組平行，結(jié)果用平均值表示。進(jìn)一步分析柑橘黃酮（質(zhì)量濃度以柚皮苷計(jì)）對(duì)胰淀粉酶的熒光猝滅機(jī)理，并計(jì)算結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合點(diǎn)數(shù)n。

1.2.6.2 Cl-與胰淀粉酶相互作用的測定 取一定量的胰淀粉酶（測定體系中胰淀粉酶的終質(zhì)量濃度0.15 mg/mL）和不同濃度的Cl-，參考1.2.6.1 節(jié)中的方法進(jìn)行發(fā)射光譜掃描。

1.2.6.3 Cl-對(duì)柑橘黃酮和胰淀粉酶相互作用的影響 取胰淀粉酶（終質(zhì)量濃度0.15 mg/mL）、Cl-（終濃度10 mmol/L） 和不同質(zhì)量濃度的柑橘黃酮，參考1.2.6.1 節(jié)中的方法進(jìn)行發(fā)射光譜掃描。

2 試驗(yàn)結(jié)果和分析

2.1 Cl-對(duì)胰淀粉酶活力的影響

陰離子種類和Cl-濃度對(duì)胰淀粉酶酶活的影響見圖1。對(duì)照組 （水） 中酶促反應(yīng)速度為2.36 mg/h，加入SO42-、NO3-對(duì)酶活影響不大，加入Cl-后酶促反應(yīng)速度增加到12.35 mg/h，激活效應(yīng)明顯（圖1a）。Cl-對(duì)淀粉酶的激活具有濃度效應(yīng)，0～10 mmol/L（酶促反應(yīng)體系終濃度）時(shí)激活倍數(shù)迅速增加；10 mmol/L 以上，激活倍數(shù)基本保持不變 （圖1b），將10 mmol/L 作為后續(xù)的試驗(yàn)濃度。

圖1 不同陰離子對(duì)胰淀粉酶酶促反應(yīng)速度的影響Fig.1 Effects of different anions on the enzymatic reaction rate of pancreatic amylase

2.2 Cl-對(duì)胰淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

Cl-對(duì)胰淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的影響見圖2。無Cl-時(shí)，胰淀粉酶的最適溫度是37 ℃（圖2a）、最適pH 值為6 （圖2b）；37 ℃以上處理30 min 導(dǎo)致胰淀粉酶活力逐漸下降，47 ℃時(shí)，酶已基本失活（圖2c），胰淀粉酶的pH 穩(wěn)定范圍為6～10（圖2e）。添加10 mmol/L Cl-后，胰淀粉酶的最適溫度提高到47 ℃（圖2a）、最適pH 值變?yōu)?（圖2b）；熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，42 ℃以上處理30 min 導(dǎo)致胰淀粉酶活力逐漸下降，57 ℃時(shí)基本失活（圖2c），pH 值穩(wěn)定性不變，為6～10（圖2e）。此外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cl-不能恢復(fù)熱失活（47 ℃以上）淀粉酶的活性（圖2d）。

胰淀粉酶雙倒數(shù)曲線見圖2f。無Cl-時(shí)，Vmax為0.29 μmol/min，Km值為0.14 mg/mL，Kcat值為4.65×107/min；添加10 mmol/L Cl-后，Vmax（1.83 μmol/min）和Kcat值（2.96×108/min）增加了6.3 倍，說明Cl-的激活效應(yīng)明顯，而Km值增加了14.3 倍（2.00 mg/mL），這可能不是酶和底物親和力下降的表現(xiàn)，而是因?yàn)榈矸凼谴蠓肿樱瑪U(kuò)散能力差，酶被激活后需要更高濃度的底物才能滿足酶工作的需要。

圖2 Cl-對(duì)胰淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的影響Fig.2 Effects of Cl- on enzymatic properties of pancreatic amylase

2.3 Cl-和柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶活力的影響

Cl-及柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶酶促反應(yīng)速度的影響見圖3。無Cl-時(shí)，反應(yīng)體系中添加0.1 mg 黃酮的酶促反應(yīng)速度（28.35 mg/h）與對(duì)照（25.16 mg/h）相近，黃酮添加量0.3～1.0 mg 時(shí)，酶促反應(yīng)速度稍有下降（20.86 mg/h），抑制率最高為17.1%。添加10 mmol/L Cl-時(shí)，酶促反應(yīng)速度隨著黃酮含量的增加變化不大，均呈現(xiàn)較高的水平（各梯度均高于無Cl-時(shí)，激活明顯），即高濃度黃酮（0.3～1.0 mg）對(duì)胰淀粉酶沒有明顯抑制作用。因此，單獨(dú)加Cl-對(duì)胰淀粉酶起激活作用，單獨(dú)添加高質(zhì)量濃度黃酮對(duì)胰淀粉酶有抑制作用，同時(shí)添加Cl-和柑橘黃酮時(shí)，柑橘黃酮基本不影響Cl-發(fā)揮激活作用。

圖3 Cl-及柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶酶促反應(yīng)速度的影響Fig.3 Effects of Cl- and citrus flavonoids on the enzymatic reaction rate of pancreatic amylase

2.4 Cl-和柑橘黃酮對(duì)淀粉消化的影響

Cl-和柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶體外消化的影響見圖4。無Cl-時(shí)，淀粉消化產(chǎn)生的還原糖的量呈線性增加；添加10 mmol/L Cl-后，淀粉消化速度大幅增加，20 min 內(nèi)消化了大部分的淀粉；添加終質(zhì)量濃度0.056 mg/mL 柑橘黃酮，基本不影響淀粉的消化規(guī)律，這與2.3 節(jié)中酶活研究結(jié)果一致。

圖4 Cl-和柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶體外消化的影響Fig.4 Effects of Cl- and citrus flavonoids on the digestion of pancreatic amylase in vitro

2.5 Cl-和柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響

2.5.1 柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響 柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶熒光的猝滅呈現(xiàn)劑量效應(yīng) （見圖5），質(zhì)量濃度越高猝滅作用越強(qiáng)。同時(shí)，熒光光譜峰由337 nm 紅移至344 nm，說明兩者發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致胰淀粉酶色氨酸殘基的熒光光譜發(fā)生了變化[19]。以柑橘黃酮的主要成分柚皮苷[20]代替柑橘黃酮提取物研究胰淀粉酶熒光光譜特性 （數(shù)據(jù)未展示），兩者結(jié)果高度吻合，說明柑橘黃酮提取物中與胰淀粉酶發(fā)生相互作用的成分是柚皮苷等主要成分。

圖5 柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響Fig.5 Effects of citrus flavonoids on the fluorescence spectra of pancreatic amylase

2.5.2 柑橘黃酮和胰淀粉酶相互作用的熒光猝滅機(jī)理和結(jié)合常數(shù) 柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線[21]見圖6。20 ℃（293 K）和35℃（308 K）下，柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶的表觀猝滅常數(shù)Kq分別為13.02×1012L/（molos）和11.29×1012L/（molos），遠(yuǎn)高于不同猝滅劑與酶分子的最大擴(kuò)散碰撞常數(shù)2.0×1010L/（molos）[15]；同時(shí)，猝滅常數(shù)Ksv由20 ℃下的13.02×104L/mol 降低到35 ℃下的11.29×104L/mol，說明柑橘黃酮不是通過分子動(dòng)態(tài)碰撞導(dǎo)致胰淀粉酶熒光發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅，而是通過結(jié)合導(dǎo)致了靜態(tài)猝滅[18，22]。以lg[Q]為自變量、lg[（F0-F）/F]為因變量進(jìn)行一元線性回歸，計(jì)算得到35 ℃（308 K） 下的兩者結(jié)合常數(shù)KA為6.2×105L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n 為1.2，即柑橘黃酮與胰淀粉酶只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

圖6 柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶熒光猝滅Stern-Volmer 曲線Fig.6 Stern-Volmer curve of pancreatic amylase fluorescence quenching by citrus flavonoids

2.5.3 Cl-對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響 Cl-對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響見圖7，添加10 mmol/L Cl-后，胰淀粉酶的熒光強(qiáng)度與對(duì)照無明顯差異（20℃）；隨著Cl-濃度的增加，熒光強(qiáng)度雖有所降低，但是變化幅度較小；當(dāng)添加300 mmol/L 和570 mmol/L Cl-時(shí)，熒光強(qiáng)度降低較明顯，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高濃度Cl-的反應(yīng)體系中出現(xiàn)了微量絮狀沉淀，這可能是因?yàn)辂}溶液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的電荷及表面水化特性產(chǎn)生影響，造成少量酶蛋白析出（鹽析）而降低蛋白濃度，從而降低了蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度。35℃時(shí)呈現(xiàn)類似的規(guī)律（數(shù)據(jù)未展示）。

圖7 20 ℃時(shí)Cl-對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響曲線Fig.7 Effects of Cl- on fluorescence spectra of pancreatic amylase at 20 ℃

2.5.4 普通膳食中Cl-對(duì)柑橘黃酮和胰淀粉酶作用的熒光光譜的影響 普通飲食后消化液中的Cl-（10 mmol/L，按推薦食鹽攝入量4.5 g/d 計(jì)算）對(duì)柑橘黃酮和胰淀粉酶作用后熒光光譜的影響見圖8。體系中柑橘黃酮質(zhì)量濃度越高，胰淀粉酶的熒光強(qiáng)度越低，猝滅效果與2.5.1 節(jié)中結(jié)果一致；柑橘黃酮質(zhì)量濃度相同時(shí)，添加10 mmol/L Cl-對(duì)胰淀粉酶的熒光光譜沒有明顯影響，與2.5.3 節(jié)結(jié)果一致。以柚皮苷代替柑橘黃酮混合物測定其對(duì)胰淀粉酶的熒光猝滅規(guī)律，結(jié)果高度吻合，10 mmol/L Cl-也不影響柚皮苷對(duì)胰淀粉酶的熒光猝滅效應(yīng)（圖9）。

圖8 Cl-和柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響Fig.8 Effects of Cl- and citrus flavonoids on fluorescence spectra of pancreatic amylase

圖9 Cl-和柚皮苷對(duì)胰淀粉酶熒光光譜的影響Fig.9 Effects of Cl- and naringin on fluorescence spectra of pancreatic amylase

綜上，柑橘黃酮混合物對(duì)胰淀粉酶熒光的猝滅效應(yīng)明顯，其影響規(guī)律與柚皮苷（柑橘黃酮主要成分之一） 一致，普通飲食后消化液中的Cl-（10 mmol/L）對(duì)柑橘黃酮（柚皮苷）和胰淀粉酶作用后熒光光譜沒有明顯影響。

3 結(jié)論和討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Cl-是豬胰淀粉酶的激活劑，由于豬胰淀粉酶與人胰淀粉酶的同源性很高，其作用規(guī)律可類推到人胰淀粉酶。消化液中10 mmol/L Cl-相當(dāng)于每餐從食物中攝入1.5 g NaCl（每日約4.5 g），接近我國居民膳食指南提倡的每人每日食鹽量（6 g），說明日常食鹽攝入量能保證胰淀粉酶的激活。Cl-能提高胰淀粉酶的最適溫度（由37 ℃提升至47 ℃）和熱穩(wěn)定性（失活溫度由47 ℃提升至57 ℃），然而Cl-不能讓熱處理失活的胰淀粉酶恢復(fù)活性；Cl-雖能改變胰淀粉酶的最適pH（由6 變?yōu)?），但會(huì)不改變其pH 值穩(wěn)定性。10 mmol/L Cl-雖能極大地提高胰淀粉酶的Vmax和Kcat值（6.3 倍），但Km值也增加了14.3 倍，這可能是因?yàn)槊副患せ詈笮枰邼舛鹊牡孜锊拍軡M足酶工作的需要（底物淀粉是大分子，擴(kuò)散能力差），不代表酶和底物親和力下降。無Cl-時(shí)，低質(zhì)量濃度柑橘黃酮對(duì)胰淀粉酶酶活的影響不大，而高質(zhì)量濃度的黃酮對(duì)胰淀粉酶具有一定的抑制作用（抑制率最高為17.1%）；添加10 mmol/L Cl-，胰淀粉酶被激活后，能解除高質(zhì)量濃度黃酮的抑制作用。正常膳食中的Cl-（10 mmol/L） 能大幅提高淀粉消化速率，終質(zhì)量濃度0.056 mg/mL 的柑橘黃酮基本不影響淀粉消化速率。綜上可以初步得出，服用柑橘黃酮類保健品不會(huì)影響胰淀粉酶對(duì)普通膳食中淀粉的消化。

人胃中會(huì)分泌胃酸，按照餐后pH 為3～4 計(jì)算，若不考慮食物中的Cl-，消化液中Cl-濃度約0.1～1 mmol/L，不足以完全激活胰淀粉酶（激活倍數(shù)為1.5～3.3 倍，見圖1b），需要從膳食中補(bǔ)充食鹽方能完全激活胰淀粉酶。這也可為高血糖人群的日常飲食提供參考，如將淀粉類食物與含NaCl的食物間隔一段時(shí)間食用，或者清淡飲食再在餐后2 h 飲用少量淡鹽水補(bǔ)充鹽分等。

熒光光譜常用來研究小分子與蛋白質(zhì)的相互作用[17-18，23]。蛋白質(zhì)熒光主要來自色氨酸，研究表明α-淀粉酶中至少含有16 個(gè)色氨酸殘基，因此可以用熒光光譜的變化來表征其結(jié)構(gòu)的變化[15，22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柑橘黃酮（柚皮苷）能靜態(tài)猝滅胰淀粉酶的自發(fā)熒光，且兩者有1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；Cl-對(duì)胰淀粉酶的熒光光譜影響較小，且10 mmol/L 的Cl-基本不影響柑橘黃酮（柚皮苷）對(duì)胰淀粉酶的熒光猝滅作用。

10 mmol/L 的Cl-能顯著激活胰淀粉酶（Kcat值增加到6.3 倍），推測其對(duì)胰淀粉酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了重大影響。然而，Cl-對(duì)胰淀粉酶的熒光光譜幾乎無影響，這說明Cl-與胰淀粉酶的作用與胰淀粉酶的色氨酸殘基無關(guān)，作用位點(diǎn)應(yīng)該是其它殘基。后續(xù)可通過圓二色譜、X-晶體衍射、核磁共振等方法進(jìn)一步研究Cl-對(duì)胰淀粉酶結(jié)構(gòu)的影響，分析Cl-激活胰淀粉酶的機(jī)制。

由于日常攝入的食鹽可以完全激活胰淀粉酶，正常人腸道中的胰淀粉酶會(huì)以激活狀態(tài)進(jìn)行工作，在研究淀粉類食物體外消化特性時(shí)，應(yīng)注意添加Cl-，保證體外試驗(yàn)中胰淀粉酶也處于激活狀態(tài)。