劉國榮，聶 蓉，段嬌嬌，王成濤

（北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術研究中心 北京 100048）

大多數(shù)天然存在人體腸道中的益生菌，如糞腸球菌（Enterococcus faecalis），通常是來源于發(fā)酵食品。例如：酸奶、奶酪、發(fā)酵香腸、酸菜等。其中能代謝合成細菌素的菌株，因細菌素對致病菌的抑制作用[1]以及不具有抗藥性，而極大地增強了對人體健康的益生功效[2]。糞腸球菌Gr17 分離自中國傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚，可以代謝合成新型廣譜IIa 細菌素enterocin Gr17。enterocin Gr17 具有良好的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性，在pH 2～10 條件下仍具有抑菌能力，100 ℃加熱30 min 與121 ℃加熱15 min 后，其抑菌活性可分別保留95.26%和90.35%[3]。糞腸球菌Gr17 有作為發(fā)酵食品功能性菌株的巨大應用潛力。

許多IIa 類細菌素代謝合成受種群內部 （種內）三組分群體感應系統(tǒng)[4-5]（Quorum sensing，QS）調控，該系統(tǒng)包括擔當種內信號分子的自誘導肽 （Autoinducing peptide，AIP） 和雙組分系統(tǒng)（Two component system，TCS），其中TCS 由組氨酸蛋白激酶（Histidine protein kinase，HPK）和反應調節(jié)蛋白 （Response regulator protein，RR）組成[4-5]，AIP 的分泌需要ABC 轉運蛋白的協(xié)助。前期研究表明，添加AIP 粗提液可誘導糞腸球菌Gr17 合成細菌素，且在糞腸球菌Gr17 中發(fā)現(xiàn)細菌素ABC 轉運基因[6]（as-48E、as-48F、as-48G、as-48H）、雙組分基因（entPK、entR）、自誘導肽基因（entIP）和細菌素編碼基因（entGr17），這表明種內三組分群體感應系統(tǒng)參與調控細菌素enterocin Gr17 的代謝合成過程[3]。

實際發(fā)酵環(huán)境中糞腸球菌Gr17 會面臨多種脅迫條件[7]，包括酸脅迫[8-10]、鹽脅迫[11]、溫度脅迫[12]、氧脅迫[13]、乙醇脅迫[14]和營養(yǎng)脅迫[15]等。因發(fā)酵過程會積累大量的酸[16]，而大部分乳酸菌是嗜中性微生物[17]，不耐受酸性環(huán)境，導致生長代謝緩慢甚至死亡，因此說酸脅迫是重要的脅迫因素。不過，酸脅迫具有雙重效應，一些微生物經(jīng)過弱酸脅迫處理會產(chǎn)生一定的適應性[17]，對自身產(chǎn)生一定的保護作用，甚至可促使某些代謝產(chǎn)物的過量合成[18]。董穎穎等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與強酸脅迫（pH 1.5）相比，弱酸脅迫（pH 3.5）條件處理產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）SZU 07-01 可促進谷胱甘肽的過量合成。

目前，尚不清楚酸脅迫能否增強糞腸球菌Gr17 合成細菌素的能力，能否通過影響種內三組分群體感應系統(tǒng)以增加糞腸球菌Gr17 的合成量。為此，本研究探討不同酸脅迫條件對菌株Gr17 生長及代謝合成細菌素的影響，篩選可正向影響細菌素合成的酸脅迫條件參數(shù)。通過確定群體檢測系統(tǒng)和與細菌素生物合成有關的基因表達水平，初步分析酸脅迫正向調控糞腸球菌Gr17 合成細菌素的機理。全面揭示實際發(fā)酵環(huán)境中分子水平上乳酸菌細菌素合成的調控行為，最大限度地提高乳酸菌生產(chǎn)菌素的應用價值，具有重要的科學和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 糞腸球菌 （Enterococcus faecalis）Gr17 于實驗室分離保藏；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）1.90，由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 主要試劑 硫酸銨、NaOH、HCl、無水乙醇、96 孔細胞培養(yǎng)板、SYB Green 染料，上海撫生實業(yè)有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆固體（TSA）培養(yǎng)基，上海恪敏生物科技有限公司；DNA Maker、瓊脂糖、RNA 制備Pure Cell/Bacterla 試劑盒RNA 提取試劑盒、DNaseI（無RNase）和RNase 抑制劑、細菌基因組DNA 提取試 劑 盒（DP302）、qPCR Master Mix、SuperReal PreMix Plus（SYBR 綠色），翌圣生物科技（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

UB-7pH 計，美國DENVER 儀器公司；C1000 Touch PCR 儀，閎龍生物科技（上海）有限公司；Bio Spectrum 凝膠成像儀，美國UVP 公司；多功能酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；CFX96 Touch熒光定量PCR 儀，美國伯樂公司；BG-Power 300型電泳儀，上海洪紀儀器設備有限公司；牛津杯（10 mm×7.8 mm×6 mm），廣州標邁生物科技有限公司；TGL-20M 低溫離心機，邢臺潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司；SPX-150B 生化培養(yǎng)箱，杭州聚萊儀器有限公司；LDZX-75KB 立式壓力滅菌器，濟南鑫貝西生物技術有限公司；Supra 22K 大容量高速冷凍離心機，北京中儀遠大科技有限公司；渦旋振蕩器，上海鼎科科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 的培養(yǎng)將儲存在-80 ℃超低溫冰箱中的菌株（1 mL）接種到裝有50 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 錐形燒杯中，在振蕩器中以180 r/min 速度37 ℃培養(yǎng)24 h。

將種子液接種到裝有3 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為10%，起始速度為350 r/min，通氣率為3.0 L/min。手動調節(jié)攪拌轉速 （300～900 r/min）將溶氧水平控制在30%以上，使用梅特勒電極監(jiān)測pH 值，并且添加3 mol/L HCl 溶液或3 mol/L NaOH 將溶液pH 值調至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，以pH 7.0 的正常狀態(tài)為對照，在37℃下培養(yǎng)28 h，得糞腸球菌Gr17 發(fā)酵液。

1.3.2 可正向調控細菌素合成的最佳酸脅迫條件篩選 測定不同酸脅迫條件對菌株Gr17 生長的影響。分別取200 μL 不同酸脅迫條件下培養(yǎng)的糞腸球菌Gr17 發(fā)酵液至96 孔細胞培養(yǎng)板中，用酶標儀測定其在波長600 nm 處的吸光值。

測定不同酸脅迫條件下細菌素enterocin Gr17 的效價。將1.3.1 節(jié)中獲得的糞腸球菌Gr17發(fā)酵肉湯以8 000 r/min 的轉速在4 ℃下離心20 min，提取上清液，用2.5 mol/L NaOH 調節(jié)pH 值至7.0，并用0.22 μm 過濾器過濾。將80%硫酸銨溶液添加到上清液中，置4 ℃冰箱中過夜沉淀。以10 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集沉淀物。將沉淀物重新溶解在0.02 mol/L 磷酸鹽溶液（pH 7.0）中，即不同酸脅迫條件下細菌素enterocin Gr17 粗提液。

取不同酸脅迫和正常條件下的細菌素enterocin Gr17 粗提液，參照抗生素效價測定方法--管碟法[20]測定其對指示菌大腸桿菌1.90 的效價（AU/mL），代表enterocin Gr17 的分泌情況。與正常條件為對照，以增加enterocin Gr17 效價最顯著的酸脅迫條件為可正向調控細菌素合成的最佳酸脅迫條件。

其中表示通信拓撲子圖的鄰接矩陣Aσ的元素；M表示系統(tǒng)所有可能的通信拓撲情況.通過構造代價指標T，可展開對編隊系統(tǒng)模型優(yōu)劣性的分析，從而證明本文所提脈沖控制方法在節(jié)約時間和能量方面的優(yōu)越性.

1.3.3 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 菌體生長代謝及細菌素分泌情況 通過比較最佳酸脅迫條件下和糞腸球菌Gr17 在不同發(fā)酵時間菌體生長代謝及細菌素分泌情況，探究酸脅迫對菌株Gr17 合成細菌素在表觀水平上的影響程度。

1.3.3.1 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 菌體生長代謝情況 分別取200 μL 不同發(fā)酵時期的糞腸球菌Gr17 發(fā)酵液至96 孔細胞培養(yǎng)板中，用酶標儀測定其在600 nm 處的吸光值。

1.3.3.2 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 細菌素分泌情況 參照1.3.2 節(jié)方法，測定不同發(fā)酵時期細菌素enterocin Gr17 的效價，代表enterocin Gr17 的分泌情況。

1.3.4 最佳酸脅迫下細菌素合成相關基因轉錄水平變化 在1.3.2 節(jié)確定的最佳酸脅迫條件下，采用RT-qPCR 技術研究不同發(fā)酵時期菌株Gr17 所分泌細菌素編碼的結構基因（entGr17）；細菌素調控相關的雙組分系統(tǒng)的基因（entPK、entR），調節(jié)該系統(tǒng)的信號分子自誘導肽基因（entIP）；轉運自誘導肽AIP 的ABC 轉運系統(tǒng)基因[6]（as-48E、as-48F、as-48G、as-48H） 的差異表達情況及變化規(guī)律，從分子水平全面揭示細菌素enterocin Gr17 在實際發(fā)酵環(huán)境中的合成調控行為。

1.3.4.1 糞腸球菌Gr17 總RNA 提取 每4 h 取酸脅迫和正常條件（pH 7.0）下的發(fā)酵液，10 000 r/min 離心獲得細菌細胞。使用RNAprep 純多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，按照說明操作從糞腸球菌Gr17 中提取總RNA，并將其儲存在-80 ℃下。

1.3.4.2 反轉錄RNA 使用Tiangen FastQuant cDNA 的第一個鏈合成組，具體操作方法：1）融化RNA 模板，5×gDNA 緩沖液、FQ-RT 引物混合物、10×快速RT 緩沖液、冰上無RNase 的ddH2O，渦旋并在使用前短暫混合每種溶液。2）將2 μL 5×gDNA 緩沖液、50 ng 總RNA 和無RNase 的ddH2O制成10 μL 混合溶液并充分混勻，然后42 ℃孵育3 min，置于冰上。3）將2 μL 10×快速RT 緩沖液、1 μ LRT 酶混合物，2 μL FQ-RT 引物混合物和5 μL 不含RNase 的ddH2O 充分混合。4）混合步驟2和步驟3 中獲得的液體混合物，42 ℃孵育15 min后在95 ℃孵育3 min，然后置于冰上以獲得cDNA。

1.3.4.3 RT-qPCR 分析 以糞腸球菌Gr17 基因entGr17、entIP、entPK、entR、as-48H、as-48G、as-48F、as-48E 為檢測目標，16s RNA 作為內參基因，通過Primers Blast 軟件設計引物，引物序列見表1。RT-qPCR 使用天根生化科技（北京）有限公司的增強定量熒光SuperReal 陣列（SYBR Green）預混合試劑（SYBR Green）。設計并放大了反應體系，具體操作方法如下：

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers uesd for RT-qPCR

表2 RT-qPCR 反應體系Table 2 RT-qPCR reaction system

實時PCR 反應條件：采用兩步法PCR 反應程序進行反應，即：95.0 ℃變性2 min，94.0 ℃擴增20 s，63.0 ℃退火45 s，40 個循環(huán)，60.0 ℃延伸5 min。以16s RNA 為內參基因，以對應空白試驗組作為對照，采用2－ΔΔCt法進行相對定量計算。

2 結果與分析

2.1 可正向調控細菌素合成的最佳酸脅迫條件

糞腸球菌Gr17 在弱酸性條件下生長良好，在強酸性條件下生長受到抑制，enterocin Gr17 的抑菌活性與菌體密度的變化趨勢一致。如圖1所示，弱酸性條件 （pH 5.0，5.5，6.0，6.5） 下糞腸球菌Gr17 的菌體密度顯著高于正常條件（pH 7.0）；強酸性條件（pH 4.0，4.5）下糞腸球菌Gr17 的菌體密度顯著低于正常條件。enterocin Gr17 的抑菌活性與菌體密度的變化成正比，當pH 值為5.5 時，糞腸球菌Gr17 的菌體密度和enterocin Gr17 的抑菌活性達到最高，抑菌活性是正常條件下的150%；當pH 值在4.0～5.5 之間時，糞腸球菌Gr17的菌體密度和enterocin Gr17 的抑菌活性隨pH的增加而上升；當pH 值在5.5～7.0 之間時，enterocin Gr17 的抑菌活性隨pH 值的增加而下降。上述結果表明，弱酸脅迫可使糞腸球菌Gr17 過量代謝合成enterocin Gr17，在pH 5.5 的酸脅迫條件下提高enterocin Gr17 抑菌活性的效果最顯著。

圖1 不同pH 條件下糞腸球菌Gr17 的菌體密度與抑菌活性Fig.1 Cell density and antibacterial activity of Enterococcus faecalis Gr17 under different pH conditions

2.2 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 菌體生長代謝情況

比較pH 5.5 的弱酸脅迫條件與正常條件下，糞腸球菌Gr17 的菌體密度與抑菌活性隨時間的變化情況。如圖2所示，0～4 h 時，pH 5.5 的酸脅迫下糞腸球菌Gr17 的菌體密度低于正常條件；4～8 h 時，pH 5.5 的酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 的菌體密度略高于正常條件；12～40 h 時，pH 5.5 的酸脅迫下糞腸球菌Gr17 的菌體密度遠低于正常條件。上述結果表明，弱酸脅迫有利于糞腸球菌Gr17 在延滯期適應發(fā)酵環(huán)境，從而快速繁殖。在穩(wěn)定期弱酸脅迫顯著抑制其生長，這可能是后期糞腸球菌所產(chǎn)有機酸抑制自身生長的緣故。

圖2 pH 5.5 與pH 7.0 下糞腸球菌Gr17 的生長曲線Fig.2 Growth curve of Enterococcus faecalis Gr17 at pH 5.5 and pH 7.0

2.3 最佳酸脅迫條件下糞腸球菌Gr17 細菌素分泌情況

比較pH 5.5 的酸脅迫與正常條件下，糞腸球菌Gr17 的抑菌活性隨時間的變化情況。如圖3所示，糞腸球菌Gr17 在兩種條件下均從8 h 開始合成enterocin Gr17，分別在28 h 和32 h 開始降解enterocin Gr17。兩種條件下到達抑菌活性最大峰值的時間有所不同，正常條件下，enterocin Gr17的合成量在24 h 達到峰值。pH 5.5 的酸脅迫條件下，enterocin Gr17 的合成量在28 h 達到峰值。雖然pH 5.5 的酸脅迫條件下enterocin Gr17 到達最大合成量的時間有所延遲，但是各時間點enterocin Gr17 合成量均比在正常條件下有明顯提高。

圖3 pH 5.5 與pH 7.0 下糞腸球菌Gr17 的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of Enterococcus faecalis Gr17 at pH 5.5 and pH 7.0

2.4 最佳酸脅迫下細菌素合成相關基因轉錄水平

2.4.1 細菌素編碼基因轉錄水平 如圖4所示，細菌素編碼基因（entGr17）的相對表達的變化方向對應于生長曲線和抗菌活性的變化方向。4～8 h時，pH 5.5 的酸脅迫條件與正常條件下entGr17基因的相對表達量相近；12～36 h 時，pH 5.5 的酸脅迫條件下entGr17 基因的相對表達量顯著高于正常條件；36～40 h 時，entGr17 基因的相對表達量驟然下降，這與36～40 h 時enterocin Gr17 分泌量的下降趨勢一致。

圖4 entGr17 相對表達量Fig.4 Relative expression of entGr17

2.4.2 細菌素調控相關基因轉錄水平 自誘導肽基因（entIP）和雙組分基因（entPK、entR）的相對表達方向對應于生長曲線和抗菌活性的方向。如圖5所示，在pH 5.5 的酸脅迫條件下，糞腸球菌Gr17 的entIP 基因的相對表達從8 h 開始急劇增加，在20 h 達到峰值，在36 h 開始有所下降。20～36 h 時，entIP 基因的相對表達量與峰值幾乎持平。這表明糞腸球菌在8 h 時開始產(chǎn)生AIP，在20 h 時AIP 的濃度達到最大，并在20～36 h 持續(xù)處于高水平，從36 h 開始AIP 濃度下降，仍然高于8 h時的濃度。正常條件下，entIP 基因相對表達量的變化趨勢與pH 5.5 的類似，在24 h 達到峰值。比較酸脅迫與正常條件下entIP 基因的相對表達量，發(fā)現(xiàn)8～40 h 內pH 5.5 的酸脅迫條件下entIP 基因的相對表達量顯著高于正常條件。

圖5 entIP 相對表達量Fig.5 Relative expression of entIP

雙組分基因（entPK、entR）相對表達量的變化與entIP 基因一致，不同點在于12 h 時pH 5.5 的酸脅迫條件下entPK、entR 基因的相對表達量才開始高于正常條件，比entIP 基因滯后4 h，且entPK、entR 基因在各個時間點的相對表達量都低于entIP 基因。

2.4.3 細菌素ABC 轉運系統(tǒng)轉錄水平 如圖8所示，ABC 轉運系統(tǒng)相關基因 （as-48E、as-48F、as-48G、as-48H）的相對表達量整體而言呈先增長后減少的變化趨勢，變化程度遠小于entGr17、entIP、entPK、entR 基因，結果不顯著。對于as-48E、as-48F、as-48G 基因，12～40 h 內pH 5.5 的酸脅迫條件下其相對表達量顯著高于正常條件；對于as-48H 基因，16～24 h 內pH 5.5 的酸脅迫條件下其相對表達量顯著高于正常條件。

圖6 entPK 相對表達量Fig.6 Relative expression of entPK

圖7 entR 相對表達量Fig.7 Relative expression of entR

圖8 ABC 轉運系統(tǒng)相關基因相對表達量Fig.8 Relative expression of ABC transport system related genes

3 討論與結論

本研究表明，pH 5.5 的酸脅迫條件使糞腸球菌Gr17 過量代謝合成enterocin Gr17。不論是在酸脅迫條件下，還是在正常條件下，enterocin Gr17的合成量都呈現(xiàn)出菌體密度依賴性，這是enterocin Gr17 合成受種內群體感應系統(tǒng)調控的表觀體現(xiàn)。pH 5.5 的酸脅迫條件下，糞腸球菌Gr17 的菌體密度小于正常條件，這不利于其產(chǎn)生細菌素，然而細菌素enterocin Gr17 的產(chǎn)量卻在此條件下更高。為此，對pH 5.5 的酸脅迫條件與正常條件下與enterocin Gr17 代謝合成的相關基因進行轉錄水平比較，發(fā)現(xiàn)pH 5.5 的酸脅迫條件較正常條件，細菌素結構基因（entGr17）的相對表達量在12～40 h 顯著增加，與抑菌活性的變化趨勢一致；自誘導肽基因（entIP）的相對表達量在8～40 h 顯著增加；雙組分基因（entPK、entR）的相對表達量在12～40 h 顯著增加；ABC 轉運系統(tǒng)相關基因（as-48E、as-48F、as-48G）的相對表達量在12～40 h 增加，ABC 轉運系統(tǒng)相關基因（as-48H）在16～40 h 增加。上述結果表明，酸脅迫通過影響種內三組分群體感應系統(tǒng)，進而影響糞腸球菌Gr17 代謝合成enterocin Gr17。

種內群體感應系統(tǒng)在乳酸菌代謝產(chǎn)細菌素中發(fā)揮調控作用的過程[4]可分為以下幾步：1）乳酸菌合成前體信號分子，然后修飾其成為成熟的自誘導肽AIP[21]，AIP 無法自行分泌到胞外，需借助ABC 轉運系統(tǒng)或其它膜通道蛋白[22]；2）當細菌大量繁殖，種群密度不斷增加使胞外的信號分子AIP 大量積累，達到閾值；3）AIP 激活位于細菌細胞膜上的雙組分系統(tǒng)[23]，通過磷酸化的方式將種內群體感應信號傳遞給下游靶基因，并調控相應靶基因的表達。相應的，RT-qPCR 試驗結果表明，弱酸脅迫與正常條件中的糞腸球菌Gr17 相比，自誘導肽基因（entGr17）轉錄水平率先增高，弱酸脅迫使糞腸球菌Gr17 更早地合成AIP；ABC 轉運系統(tǒng)相關基因 （as-48E、as-48F、as-48G、as-48H）和雙組分基因 （entPK、entR） 的相對表達量隨后增高，然而ABC 轉運系統(tǒng)相關基因的轉錄水平的增加量小于雙組分基因的增加量，一方面可能是由于糞腸球菌Gr17 依賴其它膜通道蛋白轉運AIP，另一方面由于這些蛋白質活性位點的氨基酸通常含有可電離基團，外部pH 值可能會影響蛋白質的活性和親和力[24]。同時，收到傳遞信號的細菌素結構基因（entGr17）的轉錄水平也明顯增強。

乳酸菌雙組分系統(tǒng)和LuxS/AI-2 介導的種群之間（種間）群體感應系統(tǒng)，即種間信息交流機制，對乳酸菌的耐酸性有影響。Azcarate-Peril 等[25]構建缺失HPK 突變株，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌NCFM 的耐酸性明顯下降，并且該過程中LuxS 基因的表達水平上調。Moslehi-Jenabian 等[26]在pH 3.0，4.0，5.0，6.5（作為對照）條件下，分別對鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，NCFM）進行酸性休克試驗，測定了AI-2 活性和LuxS 基因的轉錄水平。AI-2活性隨pH 值的降低而增加，而菌株適應酸性環(huán)境后AI-2 的活性下降。LuxS 基因轉錄水平的變化與AI-2 一致，酸適應能減弱LuxS 基因的轉錄。或許，酸脅迫也影響糞腸球菌Gr17 由LuxS/AI-2介導的種間群體感應系統(tǒng)，甚至該系統(tǒng)與細菌素的增產(chǎn)有密切關系。

本課題組接下來會構建種內信號分子entIP基因缺失突變株，并針對弱酸脅迫下LuxS/AI-2介導的種間群體感應系統(tǒng)對細菌素enterocin Gr17 代謝合成的影響展開研究，探究種內或種間群體感應調控系統(tǒng)在細菌素enterocin Gr17 合成中的調控效應。