廖家樂，方 甜，范艷麗

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院 銀川 750021）

肥胖癥的形成，很大程度上是由不健康的飲食習(xí)慣和生活方式引起的，特別是長期過量攝入高脂膳食。肥胖不僅會影響形體外觀審美，而且容易引起異常的生理代謝，從而引發(fā)一系列的生理、心理和社會問題[1]。肥胖是導(dǎo)致許多慢性疾病發(fā)生的關(guān)鍵誘因，如高血壓、高血脂、糖尿病、心腦血管疾病以及癌癥等[2-4]。腸道脂肪酶在人體脂肪消化中發(fā)揮著重要作用，其中胰脂肪酶是水解脂肪的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)腸腔內(nèi)50%～70%總膳食脂肪的水解和吸收[5-6]。胰脂肪酶能將膳食中的油脂分解為小分子的甘油和脂肪酸，人體可以吸收并參與新陳代謝。抑制肥胖的有效方法是通過抑制小腸中的胰脂肪酶活性，使胰脂肪酶喪失部分分解能力，從源頭上控制脂肪進(jìn)入血液，從而降低脂肪的消化和吸收，起到減肥降脂的作用。目前，市面上許多減肥藥雖療效顯著但副作用明顯，如奧利司它會導(dǎo)致人體出現(xiàn)胃腸排氣增多、脂肪瀉等不良反應(yīng)[7]。從植物界尋找高效、低毒、低副作用的胰脂肪酶抑制劑，具有著重要意義。

枸杞葉，是茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）植物枸杞的嫩葉。枸杞葉富含生物活性成分和微量元素，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。在中國以及東南亞和北美洲地區(qū)，枸杞葉被用作功能性茶、藥用蔬菜和草藥。過去枸杞葉并未受到重視，多用于土壤肥料和飼料配料，未能充分利用其價值，這嚴(yán)重阻礙了枸杞葉的應(yīng)用與發(fā)展[8]。研究表明，枸杞葉中富含黃酮類化合物，其含量要遠(yuǎn)高于果實[9]。目前國內(nèi)外學(xué)者在類黃酮化合物抑制胰脂肪酶活性方面做了大量研究[10-13]，證實了從植物中提取出的類黃酮，具有胰脂肪酶活性抑制的作用。然而，枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的作用卻未見報道。

本文以寧夏地區(qū)枸杞葉黃酮提取物為研究對象，采用酶動力學(xué)法研究枸杞葉黃酮（Lycium barbarum leaves flavonoids，LBLF） 對胰脂肪酶的抑制作用，借助紫外、熒光和紅外光譜探討枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的機(jī)理。本試驗結(jié)果為枸杞葉黃酮作為功能性食品原料和潛在替代藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞葉茶購于銀川育新枸杞有限公司；枸杞葉黃酮：實驗室自制，總黃酮含量83.0%（以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品計算）。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），上海源葉生物公司；D101 大孔樹脂，安徽三星樹脂科技公司；豬胰脂肪酶（Type Ⅱ）、三羥甲基氨基甲烷（Tris），美國SIGMA 公司；棕櫚酸對硝基苯酯 （p-Nitrophenyl palmitate，p-NPP），麥克林生物公司；對硝基苯酚、異丙醇、鹽酸、氯化鈣、氯化鈉、二甲基亞砜（DMSO）、曲拉通X-100、阿拉伯樹膠粉等其它試劑均為國產(chǎn)分析純級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME203E/02、AL104 電子天平，梅特勒-托利多公司；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器公司；DF-2 數(shù)顯磁力攪拌器，常州諾基儀器公司；BSOWX2200 臥式智能精密型搖床，上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠；F-7000 熒光分光光度計，日本日立公司；UV-1800 紫外分光光度計，日本島津公司；Spectrum Two 傅里葉變換紅外光譜儀、UATR Two 衰減全放射附件，美國PerkinElmer 公司；JDG-0.2真空凍干實驗機(jī)，蘭州科近真空凍干技術(shù)公司；ST70-2 微孔板恒溫振蕩器，杭州米歐儀器公司；Multiskan Mk3 全波長酶標(biāo)儀，賽默飛世兒儀器公司；TDL-5-A 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 枸杞葉類黃酮化合物的制備

1.3.1.1 提取 枸杞葉粉碎過篩，按照料液比1∶70，于70 ℃下用70%乙醇磁力攪拌提取2 h，重復(fù)提取1 次，合并提取液，5 000 r/min 下離心取上清液，55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至一定體積后加入石油醚進(jìn)行脫除葉綠素和脫脂處理。分液棄除石油醚層，保留上層。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥，得枸杞葉黃酮粗提物。

1.3.1.2 純化 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的D101 大孔樹脂2.0 g 和樣品0.375 g （超純水作溶劑），加入250 mL 具塞三角瓶中，室溫置于搖床上振蕩吸附24 h。將充分吸附后的樹脂過濾，置于250 mL 三角瓶中，加入100 mL 70%的乙醇，相同條件下解吸24 h，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得到純化產(chǎn)物。

1.3.2 總黃酮含量的測定

1.3.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量[14]，于波長510 nm處測定吸光值，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：Y=7.0747X+0.0899，R2=0.9992。

1.3.2.2 樣品測定 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量樣品，配成一定濃度的樣液于比色管中測定樣液吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出黃酮的質(zhì)量濃度，按公式（1）計算總黃酮含量。

式中，C——為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V——樣品溶液體積，mL；M——稱取的樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶活性的影響

1.3.3.1 枸杞葉黃酮抑制胰脂肪酶活性的測定

1）溶液的配制 準(zhǔn)確稱取3.0 g Tris，0.731 g NaCl，0.555 g CaCl2，溶于超純水，并定容至500 mL，鹽酸調(diào)pH 值為8.0，得50 mmol/L Tris-HCI緩沖液；稱取0.5 g 胰脂肪酶，溶于50 mL Tris-HCI 緩沖液，5 000 r/min 離心10 min，分離上清液，得10 mg/mL 胰脂肪酶儲備液；準(zhǔn)確稱取3.02 mg p-NPP，用緩沖溶液定容至10 mL，得0.8 mmol/L 的p-NPP 溶液 （含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%曲拉通X-100，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%阿拉伯樹膠粉和體積分?jǐn)?shù)10%異丙醇）。

2）胰脂肪酶活性的測定 參照Franco 等[15]的方法并作略微改進(jìn)。取40 μL 50 mmol·L-1Tris-HCI 緩沖液、20 μL 一定濃度的枸杞葉黃酮溶液和60 L 10 mg/mL 的胰脂肪酶溶液加入96孔板中混勻，37 ℃溫育10 min 后，加入80 μL p-NPP 底物啟動反應(yīng)，37 ℃溫育30 min，酶標(biāo)儀405 nm 波長處測定吸光值。對照組用緩沖液替代酶液，每組試驗重復(fù)3 次。反應(yīng)體系見表1。胰脂肪酶活性抑制率計算見公式（2）。

表1 胰脂酶活性測定反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for determination of pancreatic lipase activity

式中，A——對照試驗組吸光值；B——樣品試驗組吸光值；a——對照空白組吸光值；b——樣品空白組吸光值。

1.3.3.2 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶半抑制濃度（IC50）和抑制作用類型的確定 以不同質(zhì)量濃度的枸杞葉黃酮為橫坐標(biāo)，胰脂酶活性抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線圖并進(jìn)行線性回歸擬合后求得半抑制濃度（IC50）。

固定底物濃度不變（0.8 mmol/L），分別測定添加0.5 mg/mL 和不添加酶抑制劑時，不同酶濃度下的反應(yīng)初速度。以初速度對酶質(zhì)量濃度作圖。由圖判斷抑制類型（可逆或不可逆），添加抑制劑會得到一條通過原點且斜率降低的直線，可確定為可逆抑制作用類型[16]。

固定酶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL，枸杞葉黃酮溶液質(zhì)量濃度為0，0.5，1 mg/mL，分別測定p-NPP濃度為8，4，2，1 mmol/L 時的酶促反應(yīng)初速度，反應(yīng)體系同1.3.3.1 節(jié)。以反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）對底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）作圖，得到Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，確定反應(yīng)最大速率（Vmax）、米氏常數(shù)（Km）以及抑制常數(shù)（Ki）。曲線與X 軸的截距=-1/Km，與Y 軸截距=1/Vmax；抑制常數(shù)（Ki）由式（3）求得。根據(jù)Vmax和Km的變化可判斷抑制類型，非競爭性抑制為Km不變，Vmax變??；競爭性抑制為Km增大，Vmax不變[17]。每組試驗重復(fù)3 次，對照組用緩沖液替代。酶促反應(yīng)速率（v）為反應(yīng)體系吸光值（A）與反應(yīng)時間的比值。

枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的非競爭性抑制動力學(xué)方程見式（3）：

式中，V*max——添加酶抑制劑的最大反應(yīng)速率，min-1；Vmax——不添加酶抑制劑的最大反應(yīng)速率min-1；[I]——抑制劑的質(zhì)量濃度，mg/mL；Ki——抑制常數(shù)，mg/mL。

1.3.4 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶紫外光譜測定 根據(jù)張永軍[18]的方法，準(zhǔn)確移取3 mL 酶液（1 mg/mL）和200 μL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，常溫下混勻靜置5 min，得到質(zhì)量濃度為0，6.25×10-3，1.56×10-2，3.13×10-2，4.69×10-2，6.25×10-2mg/mL 的樣液，分別移取2 mL 于石英比色皿中，放入紫外分光光度計中測定（掃描250～400 nm 的波長）。

1.3.5 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的熒光光譜分析

1.3.5.1 熒光光譜的測定 根據(jù)范金波等[19]的方法，準(zhǔn)確移取3 mL 酶液（1 mg/mL）和50 μL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，使溶液總體積達(dá)到4 mL，得到濃度為0，1.25×10-3，3.125×10-3，6.25×10-3，1.25×10-2，2.50×10-2，5.00×10-2mg/mL 的樣液，分別在20 ℃和37 ℃條件下混勻靜置10 min，分別移取2 mL 于熒光比色皿中，放入熒光光度計中測定（激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長掃描范圍300～500 nm，狹縫寬均為5 nm）。

1.3.5.2 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的熒光猝滅機(jī)理研究 假設(shè)LBLF 對胰脂酶的猝滅類型為動態(tài)猝滅，則符合Stern-Volmer 方程：

式中，F(xiàn)0——不加酶抑制劑時酶液的熒光強(qiáng)度；F——加酶抑制劑時酶液的熒光強(qiáng)度；Ksv——動態(tài)猝滅常數(shù)，L/mol；[Q]——LBLF 摩爾濃度，mol/L；Kq——雙分 子碰撞 過 程猝滅 常數(shù)，L/（mol·s）；τ0——無抑制劑時熒光分子的平均壽命（生物大分子平均壽命為10-8s），s。

1.3.5.3 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的作用力類型和熱力學(xué)參數(shù)的確定 根據(jù)式 （6），作lg（F0-F）/F）關(guān)于lg[Q]的雙對數(shù)曲線，分別求得293 K 和310 K 下LBLF 與胰脂肪酶結(jié)合位點數(shù)（n）以及結(jié)合常數(shù)（Ka）。

293 K（T1）和310 K（T2）下的熱力學(xué)參數(shù)，焓變（△H）、熵變（△S）和吉布斯自由能變（△G）由式（7）、（8）、（9）計算得到，并由此可知二者相互作用力類型。

式中，R——氣體常數(shù) （8.314），J/（mol·K）；Ka1——293 K 的結(jié)合常數(shù)，L/mol；Ka2——310 K下的結(jié)合常數(shù)，L/mol。

1.3.6 傅里葉衰減全放射紅外光譜 （ATR-FTIR）測定 準(zhǔn)確移取50 mL 的酶液（10 mg/mL）和稱取不同質(zhì)量的枸杞葉黃酮粉末（0，25，50，100，200，300 mg），混勻，得到質(zhì)量濃度為0，0.5，1，2，4，6 mg/L 的樣液，反應(yīng)液置于搖床（37 ℃，160 r/min）上恒溫振蕩反應(yīng)30 min，取出進(jìn)行冷凍干燥。移取適量樣品置于ATR 附件的晶體上，擰緊螺旋壓實；光譜掃描范圍：4 000～400 cm-1；掃描次數(shù)：32次；分辨率：4 cm-1；每個樣本采集3 次，測定之前扣除空氣基底。

2.2.1 氣切吸痰 吸痰是清理呼吸道、保持呼吸道通暢的最常用而重要的護(hù)理操作[2]，也是無菌操作技術(shù)，操作時戴一次性無菌手套，并使用一次性無菌吸痰管，或者密閉式吸痰管。操作前后注意醫(yī)護(hù)人員的手衛(wèi)生，吸痰前聽診患者肺部是否有痰鳴音，觀察患者表現(xiàn)：有無煩躁、呼吸困難或血氧飽和度降低等情況或呼吸機(jī)報警為氣道壓力過高時，需及時吸痰。吸痰操作時動作輕柔，吸痰中注意：插入吸痰管時阻斷負(fù)壓，防止損傷的氣管黏膜，使其充血、水腫、上皮組織脫落、纖毛的丟失，以及氣道內(nèi)肉芽腫的形成，否則會增加了患者氣道黏膜的出血和感染的機(jī)會[3]；吸痰前后給予純氧吸入，防止供氧不足或吸痰后肺不張引起患者低氧血癥。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 每組試驗3 次重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2019作圖。樣品的紅外圖譜通過PeakFit 4.12 在譜帶范圍內(nèi)（酰胺Ⅰ帶）校正基線、區(qū)分重疊子峰，二階高斯擬合，根據(jù)峰面積計算酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)。酰胺一帶二階導(dǎo)數(shù)圖，由Origin 8.0 作歸一化并二階求導(dǎo)得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的抑制作用

課題組前期試驗結(jié)果顯示[20]，純化后的枸杞葉黃酮的總含量為809.89 mg/g，進(jìn)一步借助HPLC 測得純化產(chǎn)物主要為蘆丁、槲皮素、綠原酸、山奈酚等化合物，其中蘆丁占檢出物比例的70%以上。經(jīng)檢測，本試驗中所使用的實驗室自制枸杞葉黃酮的總含量為83.0%。

由圖1可知，隨著LBLF 質(zhì)量濃度的增大，LBLF 對胰脂肪酶的抑制率也逐漸增大。通過多元線性回歸擬合曲線，求得LBLF 對胰脂酶的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為（0.910±0.008） mg/mL。高暢等[21]發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物因提取溶劑和方法不同對胰脂肪酶的抑制作用是不同的，其中桑葉黃酮純化產(chǎn)物對胰脂肪酶的半抑制濃度（IC50）為1.19 mg/mL，抑制作用類型為非競爭性抑制；張忠[22]發(fā)現(xiàn)，市售的茶多酚能顯著抑制胰脂肪酶活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.16 mg/mL，抑制類型為非競爭性抑制；楊鵬等[23]發(fā)現(xiàn)，蕎麥黃酮醇提物是一種胰脂肪酶的競爭性抑制劑，半數(shù)抑制濃度（IC50）為2.53 mg/mL，而陽性對照奧利司他的半抑制濃度為0.47 mg/mL；范金波等[24]發(fā)現(xiàn)，咖啡酸能非競爭性抑制胰脂肪酶活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.88 mg/mL。相比于茶多酚和桑葉黃酮，枸杞葉黃酮對胰脂酶的抑制效果雖更好，但效果不如咖啡酸，這可能由于咖啡酸是純度更高的單體化合物。目前，枸杞葉黃酮抑制胰脂酶的效果雖比不上化學(xué)合成藥物奧利司他，但枸杞葉黃酮作為天然活性產(chǎn)物，不僅有著廣泛的生物學(xué)功能，而且對人體有較低的毒副作用。

圖1 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的抑制效果Fig.1 The inhibitory effect of Lycium barbarum leaves flavonoids on pancreatic lipase

2.2 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的抑制作用類型

由圖2可知，抑制劑組和無抑制劑組擬合得到的曲線都通過原點，且添加抑制劑后，曲線斜率降低，說明枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的抑制作用類型為可逆抑制。枸杞葉黃酮能與酶以非共價鍵可逆結(jié)合而引起酶活力的喪失或降低，影響酶催化效率。

圖2 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的抑制作用類型Fig.2 Types of inhibitory effects of Lycium barbarum leaves flavonoids on pancreatic lipase

可逆抑制類型分為非競爭性、反競爭性以及競爭性抑制3 種。非競爭性抑制典型特征為Km不變，Vmax變小。由圖3可知，在底物濃度為1～8 mmol/L 范圍內(nèi)，通過繪制不同質(zhì)量濃度抑制劑組和空白對照組的Lineweaver-Burk 曲線發(fā)現(xiàn)，抑制劑和無抑制劑組曲線相交于橫軸，且直線在橫軸的截距保持不變，斜率變大，即Km不變，Vmax變小，表明枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的抑制作用類型為非競爭性抑制。表2為通過計算得到的酶動力學(xué)參數(shù)和半抑制質(zhì)量濃度。

圖3 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的可逆抑制Lineweaver-Burk 曲線Fig.3 Lineweaver-Burk curve of reversible inhibition of Lycium barbarum leaves flavonoids on pancreatic lipase

表2 枸杞葉黃酮抑制胰脂肪酶的半抑制濃度和動力學(xué)參數(shù)Table 2 The half inhibitory concentration and kinetic parameters of Lycium barbarum leaves flavonoidsin inhibiting pancreatic lipase

2.3 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的紫外光譜分析

由圖4可知，胰脂肪酶在波長260 nm 處有最大吸收峰，這是由于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的存在造成的。通過觀察紫外圖譜吸收峰強(qiáng)度和波長的變化，可判斷LBLF 與胰脂酶相互作用程度以及芳香族氨基酸微環(huán)境的狀態(tài)，而所處微環(huán)境的變化會引起酶構(gòu)象的改變。圖4表明，加入不同質(zhì)量濃度LBLF 后觀察到胰脂酶紫外吸收光譜發(fā)生變化，隨著LBLF 質(zhì)量濃度增大，吸收峰增強(qiáng)并發(fā)生紅移（260 nm→273 nm），然而5個樣品間沒有顯著差異。上述結(jié)果說明，添加LBLF 后兩者相互作用程度加強(qiáng)，胰脂酶芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境和酶構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性降低，這可能是LBLF 的存在導(dǎo)致胰脂酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，更多芳香族氨基酸暴露所致[25]。

圖4 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的紫外光譜Fig.4 Ultraviolet spectra of the interaction between Lycium barbarum leaves flavonoids and pancreatic lipase

2.4 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的熒光光譜結(jié)果分析

2.4.1 枸杞葉黃酮和胰脂肪酶相互作用的熒光發(fā)射光譜 胰脂肪酶中由于色氨酸 （Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的存在而具有內(nèi)源熒光，其中對熒光貢獻(xiàn)最大的是色氨酸，其次是酪氨酸，苯丙氨酸熒光最弱，而酪氨酸和色氨酸主要在波長313 nm 和350 nm 左右出現(xiàn)熒光峰[26]。圖5表明，胰脂肪酶的最大發(fā)射波長為351 nm，隨著LBLF 質(zhì)量濃度的增大，其熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)規(guī)律性的降低并發(fā)生紅移（351 nm→354 nm），說明對胰脂酶熒光貢獻(xiàn)最大的是色氨酸，且酶蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化；小分子LBLF 是胰脂肪酶的熒光猝滅劑，并存在一定的劑量依賴效應(yīng)。熒光峰發(fā)生移位主要有兩種說法：1）3 種芳香氨基酸疏水性較高并聚集在一起，其所處環(huán)境極性的改變會導(dǎo)致紅移或藍(lán)移，LBLF 可以將色氨酸的微環(huán)境變?yōu)楦H水的環(huán)境，從而改變酶蛋白的構(gòu)象和活性[27-30]。2）酶是多疇結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)LBLF可以進(jìn)入酶蛋白的縫隙和空穴，從而改變酶的構(gòu)象[31]。

圖5 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的熒光發(fā)射光譜Fig.5 Fluorescence emission spectra of the interaction between Lycium barbarum leaves flavonoids and pancrelipase

2.4.2 枸杞葉黃酮對胰脂肪酶的熒光猝滅機(jī)理熒光猝滅類型分為靜態(tài)猝滅、動態(tài)猝滅以及混合猝滅，其中動態(tài)和靜態(tài)猝滅的Stern-Volmer 曲線均呈線性，混合猝滅曲線朝縱軸向上彎曲[32]。圖6可知，隨溫度升高，曲線斜率增大，且兩條曲線隨抑制劑質(zhì)量濃度增大朝縱軸向上彎曲，初步確定LBLF 對胰脂酶的熒光猝滅類型是以動態(tài)猝滅為主的混合型猝滅。由圖6和表3可知，抑制劑濃度較低時，兩條曲線均呈線性關(guān)系，溫度升高，曲線斜率增大，Ksv增大，其中293 K 和310 K 時Kq值分別為1.94×1012L/（mol·s） 和3.15×1012L/（mol·s），Kq值均遠(yuǎn)高于由碰撞引起的最大猝滅常數(shù)【2×1010L/（mol·s）】，進(jìn)一步說明熒光猝滅類型為混合型，抑制劑在低濃度范圍（2×10-6～20×10-6mol/L）內(nèi)動態(tài)猝滅尤為明顯。

表3 枸杞葉黃酮（線性濃度范圍2×10-6～20×10-6 mol/L）猝滅胰脂肪酶熒光的Stern-Volmer 方程和猝滅常數(shù)Table 3 Stern-Volmer equation and quenching constant of Lycium barbarum leaves flavonoids（within a linear concentration range of 2×10-6～20×10-6 mol/L） for quenching pancrelipase fluorescence

圖6 枸杞葉黃酮猝滅胰脂肪酶熒光的Stern-Volmer 曲線Fig.6 Stern-Volmer curve of Lycium barbarum leaves flavonoids quenching pancrelipase fluorescence

2.4.3 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶的結(jié)合常數(shù)（Ka）及熱力學(xué)參數(shù)、作用力類型 表4說明，溫度升高，結(jié)合常數(shù)和位點數(shù)都增大，該結(jié)合反應(yīng)是吸熱反應(yīng)；不同溫度下結(jié)合位點數(shù)都趨近于1，說明一個胰脂酶只能結(jié)合一個LBLF 分子，升溫更有利于結(jié)合。

表4 枸杞葉黃酮和胰脂肪酶的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點數(shù)（n）Table 4 Binding constant （Ka） and number of binding sites （n） of Lycium barbarum leaves flavonoids and pancrelipase

酚類化合物與酶蛋白的相互作用力類型主要為氫鍵、范德華力以及疏水相互作用力等非共價鍵。由表5可知，不同溫度下的△G<0，表明該反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行；△H>0，說明該反應(yīng)是吸熱反應(yīng)；通過比較△G、△H 和△S 三者的正負(fù)關(guān)系，可以判斷LBLF 與胰脂酶的作用力類型[33]。本研究△H>0、△S>0、△G<0，說明LBLF 與胰脂酶形成的復(fù)合物主要靠疏水相互作用力維持。

表5 枸杞葉黃酮和胰脂肪酶的熱力學(xué)參數(shù)Table 5 Thermodynamic parameters of Lycium barbarum leaves flavonoids and pancrelipase

2.5 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的ATRFTIR 光譜

峰強(qiáng)度和峰位的變化可以作為樣品基團(tuán)或化學(xué)鍵變化的判據(jù)，峰強(qiáng)度降低說明樣品基團(tuán)或化學(xué)鍵可能受到損傷，峰位發(fā)生偏移說明樣品基團(tuán)或化學(xué)鍵發(fā)生改變[34]。

由圖7可知，添加不同質(zhì)量濃度LBLF，胰脂肪酶特征峰位略微改變，且隨著LBLF 質(zhì)量濃度的增大，紅外吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，1 mg/mL LBLF 的樣品峰強(qiáng)度最高，表明1 mg/mL LBLF 對酶蛋白紅外吸收振動化學(xué)鍵的保護(hù)作用最佳，同時酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了一定程度的變化和轉(zhuǎn)化。

圖7 枸杞葉黃酮與胰脂肪酶相互作用的紅外光譜圖及酰胺Ⅰ帶擬合二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of the interaction between LBLF and pancrelipase and the second derivative infrared spectra of amide

二階導(dǎo)數(shù)光譜的峰谷位置對應(yīng)原光譜的峰尖和肩峰位置。LBLF 處理后胰脂酶譜圖的變化不太明顯。對原圖譜相應(yīng)譜帶進(jìn)行二階導(dǎo)處理，將原圖譜中細(xì)微的差別區(qū)分開來，可準(zhǔn)確辨別出重疊子峰和強(qiáng)峰的峰尖。

紅外光譜是研究蛋白二級結(jié)構(gòu)變化的經(jīng)典方法，通過分析蛋白質(zhì)的一組酰胺吸收帶，獲得酶蛋白基團(tuán)、二級結(jié)構(gòu)、微環(huán)境的變化信息，以確定分子間的作用力變化，其中酰胺Ⅰ帶吸收最強(qiáng)，最具有研究價值[35]。酰胺Ⅰ帶主要涉及-C=O 和雙鍵的伸縮振動，其中1 600～1 640，1 640～1 650，1 650～1 660，1 660～1 700 cm-1特征峰分別代表β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋以及β-轉(zhuǎn)角[36]。由圖8可知，β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋以及β-轉(zhuǎn)角分別占酶蛋白二級結(jié)構(gòu)的40.0%，29.5%，12.3%和18.4%。隨著LBLF 添加量增多，β-轉(zhuǎn)角含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，含量最高為21.0%；α-螺旋含量由12.3%增加至29.1%；無規(guī)則卷曲含量由29.5%減少至17.2%；β-折疊含量由40.0%減少至34.8%。α-螺旋的增加，表明酶蛋白分子內(nèi)氫鍵增多，結(jié)構(gòu)凝集；β-折疊的減少，說明酶蛋白分子間氫鍵減少，蛋白分子由伸展變的聚集，而減少的β-折疊更多地轉(zhuǎn)化為α-螺旋；無規(guī)卷曲減少，說明復(fù)合物結(jié)構(gòu)傾向于有序化。上述結(jié)果表明，添加不同質(zhì)量濃度的LBLF 一定程度上改變了酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為復(fù)合物結(jié)構(gòu)變得更為有序，β-折疊向α-螺旋的轉(zhuǎn)化。

圖8 胰脂肪酶蛋白二級結(jié)構(gòu)含量變化Fig.8 Changes in the secondary structure content of pancrelipase protein

3 結(jié)論

本文以寧夏地區(qū)豐富的枸杞葉資源為試驗原料，深入分析了從枸杞葉中提取的類黃酮化合物的酶抑制劑效果。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，枸杞葉黃酮提取物能顯著抑制胰脂肪酶活性，半數(shù)抑制濃度為（0.910±0.008）mg/mL，抑制類型為可逆非競爭抑制。枸杞葉黃酮能與胰脂肪酶以疏水相互作用力結(jié)合，猝滅酶蛋白內(nèi)源熒光，改變酶結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，進(jìn)而抑制胰脂肪酶活性。本試驗的研究結(jié)果為闡述枸杞葉黃酮減肥降脂機(jī)理提供了一定的理論依據(jù)，然而不同溶劑枸杞葉提取物及枸杞葉黃酮單體化合物對胰脂肪酶活性抑制的作用及二者的構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。