鮑有為 朱新華

1 變應(yīng)性鼻炎

變應(yīng)性鼻炎是變應(yīng)原激發(fā)特應(yīng)性個體產(chǎn)生IgE，并由IgE 介導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺等炎性介質(zhì)，多種細(xì)胞（肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）參與的鼻部I 型變態(tài)反應(yīng)性疾病。其表現(xiàn)癥狀為：陣發(fā)性噴嚏、清水樣涕、鼻癢和鼻塞，可伴有眼部癥狀，包括眼癢、流淚、眼紅和灼熱感等，多見于花粉過敏患者[1，2]。

變應(yīng)性鼻炎患者的病理特征是組胺等介質(zhì)釋放，以EOS 為主的多種免疫細(xì)胞[3，4]浸潤，導(dǎo)致鼻黏膜阻力血管收縮，容量血管擴(kuò)張,毛細(xì)血管通透性增高，副交感神經(jīng)活性增強，腺體增生，分泌旺盛，感覺神經(jīng)敏感性增強。EOS 的凋亡的延遲導(dǎo)致大量EOS 浸潤在外周血、痰、支氣管肺泡灌洗液以及肺組織中。激活后，EOS 的脫顆粒導(dǎo)致這些細(xì)胞毒性蛋白的釋放，以及大量促炎細(xì)胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8 和IL-13 的釋放，脂質(zhì)介質(zhì)包括前列腺素和白三烯[5]，以及活性氧[6]的釋放。這種釋放會導(dǎo)致局部組織損傷和炎癥，以及進(jìn)一步的炎癥細(xì)胞聚集（IL-5 的聚集作用）[7]。因此，EOS 目前被認(rèn)為是過敏性疾病和哮喘的治療靶點。有選擇地針對嗜酸性粒細(xì)胞在組織中的積累和存活的藥物是迫切需要的[8]。目前EOS 在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制研究主要問題有二：①EOS 凋亡是如何加速變應(yīng)性鼻炎進(jìn)程結(jié)束的機(jī)制？②如何調(diào)控EOS 凋亡以縮短變應(yīng)性鼻炎的進(jìn)程？本文在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上對EOS凋亡在變應(yīng)性鼻炎的機(jī)制進(jìn)行論述，并對這兩個問題進(jìn)行解答，以期進(jìn)一步明確EOS 凋亡對變應(yīng)性鼻炎的作用及臨床應(yīng)用價值[9，10]。

2 嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）凋亡

2.1 EOS 凋亡的生物學(xué)特征

細(xì)胞凋亡是一種高度調(diào)節(jié)的生理機(jī)制，可被看作是對于各種生物過程至關(guān)重要的細(xì)胞程序性死亡，具有重要的生物學(xué)意義。凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞膜起泡以及含有完整細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器和核碎片的凋亡小體。這些凋亡小體被駐留的吞噬細(xì)胞和相鄰細(xì)胞迅速消除，阻止細(xì)胞成分釋放到細(xì)胞外空間，避免發(fā)生炎癥和免疫反應(yīng)。除了形態(tài)變化之外，凋亡細(xì)胞經(jīng)歷多種不同的生物化學(xué)事件，涉及線粒體膜電位的喪失，DNA 片段化和蛋白質(zhì)裂解。凋亡過程可能通過幾種分子途徑發(fā)生，這其中最顯著突出的是涉及線粒體功能畸變引起的內(nèi)始式途徑，以及由細(xì)胞膜上死亡受體激活的外始式途徑，除此之外還有為數(shù)較少的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。雖然表面上獨立，但是這兩條凋亡途徑中，通過涉及兩個途徑共有的關(guān)鍵蛋白的精細(xì)協(xié)調(diào)相互作用。

2.2 EOS 凋亡的精準(zhǔn)調(diào)控

EOS 浸潤是變應(yīng)性鼻炎發(fā)病的重要炎癥機(jī)制，活化的、長期存活的EOS 聚集，釋放因子，損傷周圍細(xì)胞，誘發(fā)一系列的癥狀出現(xiàn)，而EOS 凋亡的延遲進(jìn)一步維持、加重了這種炎癥狀態(tài)。在機(jī)體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境中，組織局部EOS 凋亡并非由單一因素所決定，而是受到眾多基因和細(xì)胞因子等所組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)控。EOS 可能同時受凋亡信號與抗凋亡信號的調(diào)控，通過促凋亡因素與抗凋亡因素之間保持相對動態(tài)的平衡，完成對EOS 凋亡的調(diào)控。

2.2.1 EOS 凋亡機(jī)制

EOS 的凋亡主要有兩種途徑。其內(nèi)在途徑的特征是促凋亡Bcl-2 蛋白家族成員的構(gòu)象改變，導(dǎo)致外線粒體膜孔的形成。隨后細(xì)胞色素c 的釋放導(dǎo)致與凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）形成復(fù)合物，然后激活下游的caspases，促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖1）。

外在途徑是細(xì)胞表面死亡受體三聚導(dǎo)致Fas 介導(dǎo)的蛋白的激活與死亡域（FADD）和TNF-受體1介導(dǎo)的死亡蛋白質(zhì)（TRADD），負(fù)責(zé)催化活化的發(fā)起者和效應(yīng)還導(dǎo)致同步分子改變和形態(tài)變化與細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，這兩種不同途徑的結(jié)果是細(xì)胞內(nèi)caspases（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族）的激活，這代表了細(xì)胞凋亡的一個標(biāo)志性事件[11]（圖1）。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑不是EOS 凋亡的主要途徑，但是也是行使作用。具體過程有三種方式：①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白成熟和折疊方式異常，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接被破壞。②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)凋亡蛋白酶Caspases 激活，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被破壞。③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+信號異常導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞（圖1）。

圖1 嗜酸性粒細(xì)胞凋亡機(jī)制圖。①其內(nèi)在途徑：Bcl-2 蛋白導(dǎo)致細(xì)胞色素c 的釋放導(dǎo)致與凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）形成復(fù)合物，激活caspases 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。②外在途和戲：死亡受體三聚致Fas 蛋白激活與死亡域（FADD）和TNF- 受體1 介導(dǎo)的死亡蛋白質(zhì)（TRADD）結(jié)合。激活caspases促進(jìn)細(xì)胞凋亡。③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。

在TGF-β，F(xiàn)as 抗原系統(tǒng)，siglecl-8 等細(xì)胞因子和信號通路調(diào)EOS 凋亡，調(diào)控的結(jié)果是導(dǎo)致EOS進(jìn)一步存活還是走向凋亡。導(dǎo)致EOS 凋亡的具體進(jìn)程如下：

①TGF-β：是一種抗炎介質(zhì)，可拮抗IL-5 和GM-CSF 信號，加速EOS 細(xì)胞死亡[6，12]。TGF-β 通過抑制Akt 磷酸化導(dǎo)致calpain 活化，拮抗IL-5 促生存信號。calpain 是高度保守的非溶酶體半胱氨酸蛋白酶，在鈣通量的反應(yīng)中被選擇性激活。Calpain 的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故TGF-β 促進(jìn)EOS 凋亡[12]。在Calpain 激活之前，其內(nèi)源性抑制劑calpastatin 的丟失。鈣蛋白酶抑制劑減少自發(fā)和Fas 受體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞死亡，而calpastatin 加速中性粒細(xì)胞凋亡[13]。因此，calpastatin-calpain 系統(tǒng)是炎癥消退過程中Eos 凋亡決定的控制點之一[11，13，14]。

②Fas 抗原系統(tǒng)：Fas 抗原又叫凋亡抗原-1（APO-1）或CD15,是一種45KD 蛋白。屬于跨膜蛋白腫瘤壞死因子（TNF）和神經(jīng)生長因子（NGF）受體家族,它由富含半胱氨酸的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿內(nèi)位點組成[15]。胞漿內(nèi)位點缺乏PTK(酪氨酸激酶)和磷酸酶的共同位點。自然表達(dá)或轉(zhuǎn)染表達(dá)Fas 抗原的細(xì)胞和經(jīng)抗Fas 抗體交聯(lián)的細(xì)胞均走向凋亡。靜止?fàn)顟B(tài)下的Eos 同時表達(dá)Fas 受體（CD95，APO-1）和Fas 配體。Fas 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡至少存在兩種途徑：①Fas 信號通過第二信使神經(jīng)酰胺傳遞凋亡信息, 引起抗凋亡基因表達(dá)失衡。②配體結(jié)合后，F(xiàn)as 分子形成三聚體，激發(fā)胞漿內(nèi)潛在凋亡效應(yīng)分子的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12，16]。

③siglec-8：唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素8的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。siglec-8 是一種高水平存在于人和小鼠Eos、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面的單通道跨膜抑制受體。Siglec-8 與糖蛋白和糖脂中的唾液酸結(jié)合。配體在肺上皮中表達(dá)，并在過敏性炎癥和細(xì)胞因子如IL-13 中增強。在IL-5 和GM-CSF 存在的情況下，血液Eos 上的siglec-8 抗體的結(jié)合或交聯(lián)會導(dǎo)致線粒體的凋亡以及caspase-8 和3 的激活。這一過程的分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明[13]。不過可以推測siglec-8 導(dǎo)致的EOS 凋亡是通過線粒體途徑發(fā)生凋亡作用[18]。

2.2.2 其他導(dǎo)致EOS 凋亡的物質(zhì)

①Pin1：是神經(jīng)元、腫瘤和免疫細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子[19]。Pin1 是一種肽基-丙基異構(gòu)酶（PPIase），與親環(huán)素（cyclophilin）和FKBP 家族相關(guān)。Pin1 參與調(diào)控促生存信號和促死亡信號，使其成為一個有吸引力的治療靶點。OhJ, MalterJS 證實Pin1與活化的Eos 中的Bax、FADD、Pim1、caspase-8 和cIAP2 相互作用[19]：Pin1 與促凋亡和抗凋亡的關(guān)鍵蛋白相互作用；Pin1 是GM-CSF 和IL-5 受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，并可阻止Bax 的激活；Pin1 通過FADD 介導(dǎo)外部死亡途徑；對于GM-CSF 表達(dá)，Pin1 是必需的[20-22]。以上作用位點是通過拮抗EOS 的激活途徑，并且發(fā)生外界凋亡路徑來促進(jìn)EOS 盡早凋亡。

②糖皮質(zhì)激素（GC）：在體內(nèi)主要與糖皮質(zhì)激素受體（GR）結(jié)合后才能發(fā)揮作用[23]。GC 以被動擴(kuò)散方式通過細(xì)胞膜入細(xì)胞漿，與細(xì)胞漿內(nèi)GR 的DNA結(jié)合區(qū)結(jié)合，形成GR-GC 復(fù)合物, 同時其上的hsp90 亞單位分離，GR 的DNA 結(jié)合區(qū)暴露，GR 蛋白發(fā)生一定的構(gòu)象變化，GC-GR 形成一個同分二聚體的復(fù)合物以主動轉(zhuǎn)運方式入細(xì)胞核，與染色體內(nèi)相應(yīng)的GC 反應(yīng)成分（GRE）結(jié)合，從而啟動和調(diào)控某些具有一定生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子、酶等基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其作用[24]。一般認(rèn)為GC 可激活一種內(nèi)源性限制性核酸內(nèi)切酶，并可下調(diào)IL-3、IL-5、GM-CSF 的表達(dá)[25]。糖皮質(zhì)激素除了能促進(jìn)粒細(xì)胞凋亡外，還能增強巨噬細(xì)胞的吞噬功能，這可能是一種清除炎癥部位凋亡細(xì)胞的方法[11]。糖皮質(zhì)激素治療的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞骨架調(diào)控改變，細(xì)胞活力增強，并表達(dá)高水平的活性Rac，這是參與細(xì)胞活力、有絲分裂、傷口愈合和吞噬的關(guān)鍵蛋白[11]。

③影響EOS 的生理過程來促使EOS 凋亡。例如通過作用于細(xì)胞周期蛋白MCL-1[26，27]；shRNA 和慢病毒傳遞方法構(gòu)建小鼠CCR3-shRNA 表達(dá)慢病毒載體。沉默CCR3 基因可以減少EOS 的增殖，促進(jìn)EOS 凋亡[28]。雖然shRNA 干擾機(jī)制目前沒有明確，但是可以確定是ShRNA 干擾DNA→RNA→蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯過程來實現(xiàn)促使EOS 凋亡[29]。丁酸鹽下調(diào)IL-5RA mRNA 的表達(dá)，降低EOS 細(xì)胞表面IL-5RA 受體數(shù)量，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)運和存活[8]。

④胞吞作用：最近研究發(fā)現(xiàn)，大量的氣道局部吞噬細(xì)胞來清除凋亡碎片，一些“非專業(yè)”吞噬細(xì)胞[31]。包括乳腺上皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞也能夠吞噬凋亡細(xì)胞，并且證明促進(jìn)EOS 凋亡吞噬可以緩解AR 的癥狀[32]。雖然上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也可以進(jìn)行胞吐，但胞吞細(xì)胞主要是樹突細(xì)胞和組織常駐巨噬細(xì)胞的特殊亞群，如庫普弗細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞[33]。巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞是利用胞外代謝物促進(jìn)抗炎細(xì)胞的激活，最終導(dǎo)致組織修復(fù)[34]。這提示氣道上皮細(xì)胞在哮喘EOS 炎癥的解決中發(fā)揮非被動作用。盡管潛力為炎癥性疾病的治療提供新的治療方法，在目前的炎癥性氣道疾病模型中，對這些細(xì)胞吞噬能力的操縱的研究工作很少[18，30，31]。

2.3 EOS 激活機(jī)制及細(xì)胞因子的作用

嗜酸性粒細(xì)胞激活機(jī)制較復(fù)雜，本文主要分析嗜酸性粒細(xì)胞激活I(lǐng)L-5、IL-13 和GM-CSF 在細(xì)胞激活后表達(dá)這些細(xì)胞因子，雖然數(shù)量很低，但足以誘導(dǎo)生存。GN-CSF 或IL-5 信號通路通過抑制Bax促凋亡功能上調(diào)Bcl-xL 的表達(dá)并抑制caspase 的激活。其他支持Eos 生存的細(xì)胞因子包括Leptin、TNF-a、IL-33 和IFN-c 調(diào)控PI3K/AKT、PI3K/PKC和Erk 的功能從而抑制bax 基因或激活NF-KB 基因（圖2、圖3）。

圖2 嗜酸性粒細(xì)胞激活途徑：IL-3、IL-5、IL-13 和GM-CSF 在細(xì)胞激活后表達(dá)這些細(xì)胞因子，雖然數(shù)量很低，但足以誘導(dǎo)生存。GM-CSF 或IL-5 信號通路通過抑制Bax 促凋亡功能上調(diào)Bcl-xL 的表達(dá)并抑制caspase 的激活。其他支持Eos 生存的細(xì)胞因子包括Leptin、TNF-a、IL-33 和IFN-c 調(diào)控PI3K/AKT、PI3K/PKC 和Erk 的功能從而抑制bax 基因或激活NF-KB 基因。

圖3 各種細(xì)胞因子詳情表

3 EOS 凋亡在變應(yīng)性鼻炎中的作用

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是一種主動的、由基因調(diào)控的、不同于壞死的細(xì)胞死亡形式，是細(xì)胞衰老、死亡過程的主要形式。正常時EOS 主要通過凋亡的方式從組織中清除。近幾年，很多科研人員發(fā)現(xiàn)，可以通過控制EOS 凋亡來調(diào)控變應(yīng)性炎癥[10，43]。

哮喘[44]和變應(yīng)性鼻炎兩者常同時存在，且常?；橐蚬Ｏ贓OS 的研究較多。針對EOS 炎癥最成功和研究的治療是針對白介素-5 途徑的治療，因此針對哮喘使用糖皮質(zhì)激素和抗IL-5 受體藥物是近幾年的研究熱點[45，46]。朱新華等[28]通過慢病毒shRNA 敲除CCR3 能有效抑制EOS 增殖，促進(jìn)嗜酸性細(xì)胞凋亡。雖然這些效應(yīng)背后的機(jī)制未被完全闡明，但可以發(fā)現(xiàn)：促使EOS 凋亡可以明顯縮短變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病進(jìn)程。最近的研究表明[30]，在小鼠體內(nèi)，黃酮胡黃素可抑制EOS 凋亡，這提示調(diào)節(jié)EOS凋亡是治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的一個真正的靶點。Theiler A 等[8]的實驗研究表明：SCFA 可以通過丁酸酯通過限制EOS 的運輸和存活來改善過敏性氣道炎癥。短鏈脂肪酸中，特別是丁酸對人EOS 有直接影響，通過濃度依賴性地降低IL-5RA mRNA 的表達(dá)，降低EOS 細(xì)胞表面IL-5RA 受體數(shù)量，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)運和存活的ERMS。而Miriam Peinhaupt等[47]研究發(fā)現(xiàn)DP1 受體通過SRE 誘導(dǎo)和促炎基因的誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞存活。因此，靶向DP1 受體，同時靶向DP2，可能有助于嗜酸性疾病的抗炎治療。Felton 等[30]的研究證實了巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞清除有助于過敏性氣道炎癥的緩解，提示增加凋亡細(xì)胞清除率是治療過敏性氣道炎癥的一種潛在治療策略。而Felton JM 等[27]也發(fā)現(xiàn)EOS 細(xì)胞表面Mcl-1（一種抗凋亡蛋白）保護(hù)EOS 的凋亡從而加重過敏性氣道炎癥。值得注意的是，這與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的EOS 凋亡相反，后者可被IL-5 等細(xì)胞因子的存在所消除。

EOS 在哮喘和其他變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病過程中是重要的效應(yīng)細(xì)胞。在過敏性炎癥過程中，IL-5、IL-3 和GM-CSF 等生存促進(jìn)因子敏感性地提高了EOS 的存活，從而促進(jìn)了氣道中EOS 的積累?；罨腅OS 胞是細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞毒顆粒蛋白(如嗜酸性神經(jīng)毒素和主要堿性蛋白) 的主要來源，這些蛋白的釋放可導(dǎo)致組織損傷和氣道重塑。因此，EOS 目前被認(rèn)為是過敏性疾病和哮喘的主要治療靶點。目前迫切需要有選擇性地針對EOS 在組織中的積累和存活的藥物[1，2，8]。

4 小結(jié)

嗜酸性粒細(xì)胞在呼吸道過敏性疾病發(fā)病過程中是重要的效應(yīng)細(xì)胞。在過敏性炎癥過程中，對EOS 細(xì)胞的凋亡和胞吞作用的的研究為炎癥性氣道疾病的治療提供了新的見解，尤其是以嗜酸性粒細(xì)胞為主的氣道炎癥。這兩種方法可用于治療干預(yù)，允許成功操縱炎癥解決，并減少與現(xiàn)有治療相關(guān)的不良反應(yīng)。因此，通過控制嗜酸性粒細(xì)胞凋亡來調(diào)控變應(yīng)性炎癥，目前并且未來可能是過敏性疾病的主要治療關(guān)注點。