楊翠平，何 園，劉慧瑩，張 硌，周晨辰，米志強(qiáng)，查玉華，柏長(zhǎng)青

（1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100039；中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū) 2.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，3.醫(yī)學(xué)工程科，北京 100071；4.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071）

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β， TGF-β）是一個(gè)由多種分泌型多肽信號(hào)分子組成的細(xì)胞因子超家族，調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生物學(xué)功能。Smad蛋白在TGF-β的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)TGF-β受體胞內(nèi)激酶底物，可將TGF-β信號(hào)由細(xì)胞膜外直接轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核，TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在生物體的胚胎發(fā)育、成體組織再生及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮重要作用[1]。Smad 蛋白是TGF-βⅠ型受體（TGF-β receptorⅠ，TβR-Ⅰ）的直接作用底物，從結(jié)構(gòu)和功能上主要分為3個(gè)亞型：① 受體調(diào)節(jié)型Smad（receptor-activated Smad，R-Smad），包含5個(gè)成員：Smad 1，2，3，5和8；② 共同通路型Smad，哺乳動(dòng)物中只有Smad 4，與其他Smad的同源性較低，參與所有TGF-β超家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，C端功能域無磷酸化位點(diǎn)，不與受體直接作用，與R-Smad形成穩(wěn)定的異源多聚體進(jìn)入細(xì)胞核；③抑制型Smad，包含Smad 6和7，通過阻斷R-Smad磷酸化，對(duì)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[2]。TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各型Smad分子之間的作用精密協(xié)調(diào)，共同完成生理及病理狀態(tài)下TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)[2]。研究TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的具體作用機(jī)制對(duì)闡明肺纖維化等疾病發(fā)生機(jī)制及篩選藥物治療靶點(diǎn)十分重要，亦有助于進(jìn)一步探索Smad蛋白在多細(xì)胞生物體結(jié)構(gòu)的發(fā)育和維持中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用[3]。

紅色熒光蛋白mCherry和熒光素酶報(bào)告基因載體具有操作簡(jiǎn)便、易于觀察、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。本研究構(gòu)建一種以Smad響應(yīng)元件（Smad response elements，Smad RE）作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控順式元件、以GalVP64為放大調(diào)控因子、以mCherry或熒光素酶為報(bào)告基因的表達(dá)載體，并進(jìn)一步構(gòu)建由TGF-β誘導(dǎo)表達(dá)mCherry或熒光素酶的人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系，通過觀察mCherry或熒光素酶的表達(dá)篩選TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)抑制劑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

A549細(xì)胞（人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系）和293FT（人腎上皮細(xì)胞系）及慢病毒質(zhì)粒載體pCDH-GFPPuro-noCMV由本實(shí)驗(yàn)室保存；UAS-Smad REPmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-Smad REPmin-Gal4VP64-luciferase報(bào)告基因序列由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成，報(bào)告基因序列中的Smad RE參照Dennler等[4]設(shè)計(jì)，序列為：5′-TCGAGAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAC-3′；EcoRⅠ和BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、PCR反應(yīng)試劑及3.1NEB緩沖液（美國NEB公司）；感受態(tài)細(xì)菌DH5α、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA電泳凝膠回收試劑盒〔天根科技生化（北京）有限公司〕；脂質(zhì)體lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；TGF-β受體拮抗劑LY2109761和SB431542、兔抗人Smad2/3和磷酸化Smad2/3（phospho-Smad2/3，p-Smad2/3）多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG多克隆抗體（二抗）（美國Jackson公司）；RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司）；ECL發(fā)光試劑盒和重組人TGF-β（美國Thermo Fisher Scientific公司）；熒光素酶檢測(cè)試劑盒（美國Promega公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase的構(gòu)建和鑒定

首先用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分別酶切pCDH-GFP-Puro-noCMV慢病毒質(zhì)粒載體及UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-luciferase報(bào)告基因序列，使它們線性化后通過T4 DNA連接酶將該載體分別與UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-luciferase報(bào)告基因序列連接（圖1），分別獲得由TGF-β誘導(dǎo)的含有Smad RE和mCherry或熒光素酶報(bào)告基因序列的重組慢病毒質(zhì)粒載體，分別命名為pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase。將該2個(gè)重組慢病毒質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，隨后挑取單克隆、酶切和測(cè)序，鑒定重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase是否構(gòu)建成功。

Fig.1 Schematic diagrams of construction of recombinant lentiviral plasmid vectors—pCDH-USPG-mCherry and pCDH-USPG-luciferase recombinant lentiviral plasmids induced by transforming growth factor- β（TGF- β），which contained Smad response elements（Smad RE）and mCherry（red fluorescent protein）or luciferase sequences,respectively.

1.3 慢病毒包裝

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293FT細(xì)胞，接種于60 mm×15 mm皿中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。1個(gè)目標(biāo)質(zhì)粒：pCDH-USPG-mCherry或pCDH-USPG-luciferase，4 μg；2個(gè)輔助質(zhì)粒：pMD2G 1 μg，psPAX2 3 μg。首先用Opti-MEM 100 μL分別稀釋2個(gè)輔助質(zhì)粒和1個(gè)目標(biāo)質(zhì)粒，輕輕吹吸3～5次混勻；其次用Opti-MEM 100 μL 稀釋 16 μL LipofectamineTM2000，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置5 min；隨后混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA稀釋液，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置20 min；最后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到293FT細(xì)胞培養(yǎng)皿中，前后輕搖培養(yǎng)皿混合均勻。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞上清液1次；加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后再次收集細(xì)胞上清液。將2次收集的上清液合并，300×g離心5 min去除殘余細(xì)胞。用0.22 μm的濾器過濾后，4000×g離心 20 min得到病毒濃縮液約 200 μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 慢病毒感染A549細(xì)胞

以每孔3×104～5×104A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且狀態(tài)良好時(shí)，加入濃縮后的pCDH-USPG-mCherry或pCDH-USPG-luciferase病毒液50 μL。感染后約72 h，在450 nm激發(fā)光照射下，利用倒置熒光顯微鏡觀察A549細(xì)胞是否表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）。隨后加入嘌呤霉素5 mg·L-1篩選感染成功的細(xì)胞。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，未成功感染的細(xì)胞被嘌呤霉素殺死，感染成功的細(xì)胞完好，并表達(dá)GFP。感染成功的細(xì)胞分別命名為USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后備用。

1.5 倒置熒光顯微鏡觀察USPG-mCherry A549細(xì)胞mCherry的表達(dá)

取穩(wěn)定感染的USPG-mCherry A549細(xì)胞加入24孔板，在37℃，5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)約80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對(duì)照、TGF-β（終濃度 10 μg·L-1）、LY2109761（終濃度5 μmol· L-1）、SB431542（終 濃 度 10 μmol· L-1）、LY2109761+TGF-β和SB431542+TGF-β組，其中LY2109761+TGF-β和SB431542+TGF-β組先分別加入 LY2109761（終濃度 5 μmol·L-1）和 SB431542（終濃度10 μmol·L-1）預(yù)孵育1 h，然后加入TGF-β（終濃度10 μg·L-1）。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞mCherry的表達(dá)。

1.6 熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)USPG-luciferase A549細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)

取穩(wěn)定感染的USPG-luciferase A549細(xì)胞加入24孔板中，在37℃，5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)約80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對(duì)照、TGF-β（終濃度 10 和 50 μg·L-1）、LY2109761（終濃度 5 μmol·L-1）+TGF-β（終濃度10 μg·L-1）和 SB431542（終濃度 10 μmol·L-1）+TGF-β（終濃度 10 μg·L-1）組，其中 LY2109761+TGF-β和SB431542+TGF-β組先加入LY2109761和SB431542孵育1 h，然后加入TGF-β。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后裂解細(xì)胞，使用Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍攝熒光圖像，并利用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)。

1.7 Western印跡法檢測(cè)A549細(xì)胞中Smad2/3蛋白磷酸化水平

將A549細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，在37℃，5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)約80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對(duì)照、TGF-β（終濃度 1，5 和 10 μg·L-1）、LY2109761（終濃度5 μmol·L-1）、SB431542（終 濃 度 10 μmol·L-1）、LY2109761（終濃度 5 μmol·L-1）+TGF-β（終濃度為 1，5和10 μg·L-1）和 SB431542（終濃度10 μmol·L-1）+TGF-β（終濃度為1，5和10 μg·L-1）組。① 細(xì)胞對(duì)照組用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；②LY2109761+TGF-β和SB431542+TGF-β組先加入LY2109761和SB431542孵育0.5 h，然后加入TGF-β。各組繼續(xù)培養(yǎng)1.0 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入RIPA裂解液（RIPA裂解液中加入10%的PMSF，現(xiàn)用現(xiàn)配）裂解細(xì)胞；然后加入等體積2×蛋白上樣緩沖液，于98℃水浴鍋中15 min，使細(xì)胞充分裂解；6400×g離心2 min，上清用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后制成上樣液。各樣品取等量蛋白質(zhì)上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，隨后電轉(zhuǎn)移至NC膜。5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，與1∶1000稀釋的一抗工作液4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶1000稀釋的二抗工作液搖床上室溫孵育1 h；TBST洗3次，每次10 min。加入ECL顯色液置Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影，參考蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)觀察是否有p-Smad2/3蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase的鑒定

構(gòu)建的重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase經(jīng)EcoRⅠ與BamHⅠ雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，隨后用凝膠成像分析儀觀察。如圖2所示，pCDH-USPG-mCherry酶切后，可見一條約1690 bp的條帶，大小與UASSmad RE-Pmin-Gal4VP64-mCherry序列一致；pCDH-USPG-luciferase酶切后，可見一條約1772 bp的條帶，大小與UAS-Smad RE-Pmin-Gal4VP64-luciferase序列一致。選取酶切正確的單克隆菌落進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果顯示與上述序列一致，表明重組慢病毒質(zhì)粒載體pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase構(gòu)建成功。

Fig.2 ldentification of recombinant lentiviral plasmid vectors pCDH-USPG-mCherry and pCDH-USPG-luciferase.A：pCDH-USPG-mCherry vector identification by EcoR Ⅰand BamHⅠenzymes digestion；lane 1：PCR product；lane 2：pCDH-USPG-mCherry enzymes digestion product.B：pCDHUSPG-luciferase vector identification by EcoRⅠand BamHⅠenzymes digestion；lane 1：PCR product；lane 2：pCDH-USPG-luciferase enzyme digestion product.

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549的鑒定

用濃縮的含pCDH-USPG-mCherry或pCDHUSPG-luciferase的病毒液感染A549細(xì)胞，72 h后用倒置熒光顯微鏡在488 nm激發(fā)光照射下可觀察到被感染的A549細(xì)胞表達(dá)GFP（圖3），表明A549細(xì)胞被感染成功，分別命名為USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549細(xì)胞。

Fig.3 ldentification of USPG-mCherry A549 and USPG-luciferase A549 transfected cells（×100）.A549 cells were infected with concentrated virus fluids containing pCDH-USPG-mCherry or pCDH-USPG-luciferase（namely USPG-mCherry A549 and USPG-luciferase A549 cells，respectively）.The expressions of green fluorescent protein in USPG-mCherry A549 cells and USPG-luciferase A549 were observed under excitation light at 488 nm under an inverted fluorescence microscope.

2.3 TGF- β及其受體拮抗劑對(duì)USPG-mCherry A549細(xì)胞mCherry表達(dá)的影響

如圖4所示，USPG-mCherry A549細(xì)胞對(duì)照組及單獨(dú)加入LY2109761或SB431542組未檢測(cè)到mCherry的表達(dá)；TGF-β組mCherry的表達(dá)較細(xì)胞對(duì)照組明顯增強(qiáng)，分別加入LY2109761和SB43154后mCherry的表達(dá)較TGF-β組明顯減弱。上述結(jié)果表明，受Smad調(diào)控表達(dá)mCherry的USPG-mCherry A549細(xì)胞可用于篩選TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑。

2.4 TGF- β及其受體拮抗劑對(duì)USPG-luciferase A549細(xì)胞熒光素酶表達(dá)的影響

如圖5所示，USPG-luciferase A549細(xì)胞對(duì)照組熒光素酶的表達(dá)在基線水平，幾乎不表達(dá)；與細(xì)胞對(duì)照組相比，加入TGF-β（10和50 μg·L-1）刺激后熒光素酶表達(dá)明顯升高，分別為細(xì)胞對(duì)照組的3.55和 3.76 倍；而 LY2109761+TGF-β（10 μg·L-1）和SB431542+TGF-β（10 μg·L-1）組熒光素酶表達(dá)較 TGF-β（10 μg·L-1）組又明顯減弱，僅為 TGF-β（10 μg·L-1）組的約1/3。上述結(jié)果表明，受Smad調(diào)控表達(dá)熒光素酶的USPG-luciferase A549細(xì)胞可用于篩選TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑。

Fig.5 Effect of TGF- β and its receptor antagonists on luciferase expression of USPG-luciferase A549 cells detected by luciferase detection kit.See Fig.4 for the cell treatment.A：pseudo-color image of cell luminescence imaging；B：luminescence imaging of cells；C：the relative expression level of luciferase was normalized by the cell control group.

2.5 TGF- β及其受體拮抗劑對(duì)A549細(xì)胞Smad2/3蛋白磷酸化的影響

如圖6所示，細(xì)胞對(duì)照、LY2109761和SB431542組A549細(xì)胞未見p-Smad2/3蛋白表達(dá)；加入TGF-β（1，5和10 μg·L-1）刺激后，均可檢測(cè)到p-Smad2/3蛋白表達(dá)；預(yù)先加入LY2109761或SB431542，TGF-β（1，5和10 μg·L-1）誘導(dǎo)的p-Smad2/3蛋白表達(dá)則被明顯抑制。上述結(jié)果表明，Smad2/3蛋白磷酸化被LY2109761或SB431542阻斷，LY2109761和SB431542對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有明顯的抑制作用。

Fig.6 Effect of LY2109761（A）and SB431542（B）on expression of phosphorylated of Smad2/3 proteins（p-Smad2/3）in A549 cells by Western blotting.LY2109761+TGF-β and SB431542+TGF-β groups were pre-incubated with LY2109761 or SB431542 for 0.5 h，and then incubated with TGF-β for another 1.0 h.

3 討論

TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路構(gòu)成了一個(gè)多功能性的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、分化、黏附、轉(zhuǎn)移和凋亡[5-6]。Smad 蛋白是TGF-β超家族細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子[7]，通過調(diào)節(jié)該信號(hào)通路中一系列下游基因的活性，參與人類多種疾病如纖維化、炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤等的發(fā)生與發(fā)展[8]。阻斷TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)可對(duì)與其相關(guān)疾病的發(fā)展起到抑制作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一些小分子抑制劑如LY2109761和SB431542可抑制該信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，因此被廣泛應(yīng)用于與TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究中。

mCherry是一種來自于蘑菇珊瑚（mushroom corals）的紅色熒光蛋白，能在特定波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)發(fā)出紅色熒光[10]。相對(duì)于其他熒光蛋白，mCherry的優(yōu)越性在于它可與應(yīng)用較多的GFP共同標(biāo)記，且熒光非常穩(wěn)定。熒光素酶是能催化熒光素或脂肪醛氧化產(chǎn)生生物發(fā)光的一類酶，是一種常用的報(bào)告基因，因其具有非放射性、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，在藥物篩選領(lǐng)域已成為一種非常重要的研究工具[11-14]。

本研究利用DNA重組技術(shù)成功構(gòu)建pCDHUSPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase 2個(gè)重組慢病毒報(bào)告基因載體，在293FT細(xì)胞中包裝出慢病毒感染A549細(xì)胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察到被感染的A549細(xì)胞表達(dá)GFP，表明表達(dá)mCherry和熒光素酶的USPG-mCherry A549和USPG-luciferase A549細(xì)胞構(gòu)建成功。加入TGF-β后可觀察到USPG-mCherry A549細(xì)胞表達(dá)mCherry，USPG-luciferase A549細(xì)胞表達(dá)熒光素酶；而加入TGF-β受體拮抗劑LY2109761和SB431542后，mCherry和熒光素酶的表達(dá)被抑制，表明本研究構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體可成功響應(yīng)與TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的信號(hào)刺激。

最后，為初步探討LY2109761和SB431542在TGF-β下游Smad2/3蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的抑制作用，本研究用A549細(xì)胞檢測(cè)其阻斷Smad2/3蛋白磷酸化的作用。結(jié)果表明，LY2109761和SB431542可特異性阻斷A549細(xì)胞Smad2/3蛋白磷酸化，對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有明顯的抑制作用。

綜上所述，本研究構(gòu)建了pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase 2個(gè)慢病毒報(bào)告基因載體，通過觀察mCherry熒光蛋白或熒光素酶的表達(dá)可鑒別目的細(xì)胞對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的響應(yīng)，而且結(jié)果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，可直接用于以TGF-β或其受體家族為靶點(diǎn)的藥物篩選和活性檢測(cè)。