鄭層層，楊翠翠，郜 丹，郝晉萍，張 蘭，胡朝英

（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部，北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京 100053）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)的自身免疫性疾病，以慢性炎癥浸潤、脫髓鞘以及CNS軸突和神經(jīng)元丟失為主要病理特征[1]，臨床表現(xiàn)具有癥狀和體征的空間多發(fā)性、病程的時間多發(fā)性及復(fù)發(fā)、遷延和致殘率高等特點(diǎn)，多發(fā)于視神經(jīng)、脊髓和腦干。目前，MS已成為致青壯年肢體殘疾的第二大誘因，給家庭和社會造成沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)[2-4]。MS發(fā)病初期多為復(fù)發(fā)緩解型，多以抑制炎性脫髓鞘病變進(jìn)展、防止急性期病變惡化及緩解期復(fù)發(fā)為主要治療方針，有限的藥物選擇和沉重的治療負(fù)擔(dān)是治療MS面臨的兩大難題。

神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間存在多維度的交互作用[5-6]。在MS炎癥反應(yīng)早期，小膠質(zhì)細(xì)胞在維持CNS免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程中占主導(dǎo)地位[7]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS固有免疫細(xì)胞以及聯(lián)接固有免疫和獲得性免疫的橋梁，是CNS最主要的免疫防線。對于內(nèi)、外源性刺激，小膠質(zhì)細(xì)胞首先被激活并分泌一系列炎癥細(xì)胞因子和神經(jīng)毒性因子，這些因子可能導(dǎo)致鄰近神經(jīng)元受損，進(jìn)而引發(fā)更多小膠質(zhì)細(xì)胞激活[7]。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞的低水平持續(xù)激活，持續(xù)釋放多種炎癥介質(zhì)，被認(rèn)為與復(fù)發(fā)緩解型MS腦和脊髓的持續(xù)慢性損傷有關(guān)[8-10]。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞是治療MS，尤其是復(fù)發(fā)緩解型MS的重要靶點(diǎn)。

在CNS中，Nod樣受體家族蛋白3（Nod-like receptor family protein 3，NLRP3）炎癥小體主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，被認(rèn)為是CNS免疫炎癥反應(yīng)的啟動子，是控制CNS免疫炎癥反應(yīng)的新靶點(diǎn)[11-12]。小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的異常過度激活可促進(jìn)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（interlukin-1β，IL-1β）和IL-18的分泌并促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，引起細(xì)胞凋亡[13-15]。據(jù)報道，敲除小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體主要組成蛋白，可減輕CNS炎癥[16]。在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎模型小鼠中，小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體缺失可延緩MS進(jìn)程，也提示NLRP3炎癥小體的激活參與MS進(jìn)程[17]。

淫羊藿苷（icariin，ICA）是從淫羊藿中提取的黃酮類化合物，具有多種藥理學(xué)作用，如抗衰老、抗氧化和抗炎作用[18]，且可通過血腦屏障[19]。本課題組前期研究結(jié)果表明，ICA能夠明顯抑制MS模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，抑制炎癥因子分泌[20-21]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究進(jìn)一步探討ICA的抗神經(jīng)炎癥作用是否與其抑制NLRP3炎癥小體的形成有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥物、細(xì)胞、試劑和儀器

ICA（ID：E065-N15W，批號：110737-201516，HPLC純度≥94.2%，中國食品藥品檢驗(yàn)研究院）。小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞（批號：3111C0001CCC00-0063，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心）。DMEM高糖培養(yǎng)基、4%細(xì)胞固定液和PBS（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；青、鏈霉素混合液和ECL化學(xué)發(fā)光底物（美國Thermo Fisher公司）；細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（美國Sigma公司）；干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和Luminex多因子檢測試劑盒（美國R&D Systems公司）；大鼠抗人CD16/CD32單克隆抗體和兔抗人CD206多克隆抗體（美國Abcam公司）；Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG（H+L）和Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（H+L）多克隆抗體（美國Invitrogen公司）；兔抗小鼠NLRP3單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；小鼠抗人凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、胱天蛋白酶1（caspase 1）和胱天蛋白酶原1（procaspase 1）單克隆抗體（美國Santa公司）；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（中國Abclonal公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）多克隆抗體、DAPI封片劑、山羊血清和Triton X-100（北京中杉金橋公司）。Multiskan Spectrum全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；Bio-Plex 200自動免疫分析儀系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Tanon曝光儀（上海天能科技有限公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和藥物處理

小鼠BV2細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1.0%青、鏈霉素混合液配制的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5% CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長良好的BV2細(xì)胞懸液以3×107L-1接種于6孔培養(yǎng)板，或以2×107L-1接種于放有滅菌蓋玻片的24孔板中。BV2細(xì)胞生長至約70%融合度時，用LPS聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)BV2細(xì)胞，構(gòu)建擬神經(jīng)炎癥反應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia with analog neuroinflammation，MANF）模型。BV2細(xì)胞分為6組：細(xì)胞對照、ICA 10 μmol·L-1、模型及模型+ICA 5，10和20 μmol·L-1組。細(xì)胞對照和模型組加入DMEM高糖培養(yǎng)基，ICA組加入ICA 10 μmol·L-1，模型+ICA組分別加入ICA 5，10和20 μmol·L-1，孵育24 h；隨后模型和模型+ICA組加入LPS 100 μg·L-1和IFN-γ 20 μg·L-1，細(xì)胞對照和ICA組用等體積培養(yǎng)基代替，孵育18 h；最后模型+ICA組加入相應(yīng)濃度的ICA，其他各組加入等體積培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。處理結(jié)束后，吸取24孔板細(xì)胞上清進(jìn)行Luminex多細(xì)胞因子檢測，固定細(xì)胞后進(jìn)行免疫熒光染色；提取6孔板細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)。

1.3 Luminex多細(xì)胞因子試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中l(wèi)L-3，lL-5，lL-17和單核/巨噬細(xì)胞趨化因子11（monocyte/macrophage chemokine 11，CCL11）濃度

收集1.2中24孔板細(xì)胞上清液，每組4復(fù)孔，低溫離心去除細(xì)胞顆粒備用。試劑盒平衡至室溫，按使用說明書依次向微孔板中加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白微粒混合物、生物素-抗體檢測試劑、鏈霉親和素-PE制劑和洗滌緩沖液，室溫?fù)u床30 min。將微孔板置于磁力架上，清洗液清洗3次，每孔加入洗滌緩沖液100 μL，使微粒重新懸浮，在搖床上培養(yǎng)2 min。用Bio-Plex 200自動免疫分析儀檢測細(xì)胞上清液中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11濃度。

1.4 免疫熒光染色檢測BV2細(xì)胞M1型和M2型細(xì)胞百分比

收集1.2中24孔板細(xì)胞，每組3復(fù)孔，加4%細(xì)胞固定液室溫固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；采用0.5% Triton X-100磷酸鹽緩沖液（PBST）室溫透膜 20 min，PBS 洗滌 3次，每次5 min；5%山羊血清37℃封閉30 min；加入大鼠抗人CD16/CD32單克隆抗體和兔抗人CD206多克隆抗體（稀釋比1∶200）4℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；加Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG（H+L）或Alexa Fluor 594山羊抗兔 IgG（H+L）多克隆抗體（稀釋比1∶200）37℃孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI封片劑封片，拍照。綠色熒光表示CD16/CD32陽性，即M1型BV2細(xì)胞；紅色熒光表示CD206陽性，即M2型BV2細(xì)胞。藍(lán)色表示細(xì)胞核，即總細(xì)胞數(shù)。以綠色或紅色與藍(lán)色共標(biāo)的細(xì)胞數(shù)除以藍(lán)色細(xì)胞總數(shù)計(jì)算M1型或M2型BV2細(xì)胞百分比。

1.5 Western印跡法檢測BV2細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)

收集1.2中6孔板細(xì)胞，每組3復(fù)孔，加入RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟和2%蛋白酶抑制劑）冰上裂解細(xì)胞，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。10%和15% SDS-PAGE凝膠電泳，恒流400 mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，加入兔抗小鼠NLRP3蛋白（1∶1500）、小鼠抗人ASC（1∶500）、小鼠抗人胱天蛋白酶1（1∶500）和小鼠抗人GAPDH（1∶5000）單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次8 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）多克隆抗體（二抗，1∶2000）室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，每次8 min，加入發(fā)光液，曝光。以待測蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶積分吸光度比值表示待測蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 22和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫熒光染色結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lCA對MANF模型炎癥因子分泌的影響

如表1所示，與細(xì)胞對照組相比，ICA組細(xì)胞上清中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11水平無明顯變化，模型組均顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+ICA 5 μmol·L-1組上述細(xì)胞因子水平無明顯變化；模型+ICA 10 μmol·L-1組除IL-5降低（P＜0.05）外，其他均無明顯變化；模型+ICA 20 μmol·L-1組上述細(xì)胞因子水平均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of icariin（lCA）on secretion of interlukin-3（lL-3），lL-5，lL-17 and monocyte/macrophage chemokine 11（CCL11）in microglia with analog neuroinflammation（MANF）model

2.2 lCA對MANF模型M1和M2型細(xì)胞百分比的影響

圖1結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，ICA組CD16/CD32和CD206陽性細(xì)胞百分比無明顯變化；模型組CD16/CD32陽性細(xì)胞百分比明顯增加（P＜0.01），CD206陽性細(xì)胞百分比顯著減少（P＜0.01），提示擬神經(jīng)炎癥反應(yīng)的BV2細(xì)胞向M1型炎癥表型極化。與模型組相比，模型+ICA 5 μmol·L-1組CD16/CD32陽性細(xì)胞百分比無明顯變化，CD206陽性細(xì)胞百分比明顯增加（P＜0.05）；模型+ICA 10和20 μmol·L-1組 CD16/CD32陽性細(xì)胞百分比減少（P＜0.01），CD206陽性細(xì)胞百分比顯著增多（P＜0.01），提示擬神經(jīng)炎癥反應(yīng)的BV2細(xì)胞向M2型極化。

Fig.1 Effect of lCA on percentage of M1 and M2 types BV2 cells of MANF model detected by immunofluorescence staining.See Tab.1 for the cell treatment.A：the representative fluorescence image of BV2 cell phenotypes，green fluorescence represents CD16/CD32 positive cells and red fluorescence represents CD206 positive cells；B1（the percentage of CD16/CD32 positive cells）and B2（the percentage of CD206 positive cells）were the semi-quantitative results of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.3 lCA對MANF模型NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western印跡結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對照組相比，ICA組NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶原1蛋白表達(dá)均無明顯變化；模型組NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表達(dá)增多（P＜0.05，P＜0.01），胱天蛋白酶原1蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，模型+ICA 5，10 和 20 μmol·L-1組NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），胱天蛋白酶原1表達(dá)無明顯改變。

Fig.2 Effect of lCA on protein expressions of Nod-like receptor family protein 3（NLRP3），apoptosis-associated speck-like protein（ASC），procaspase 1 and caspase 1 in MANF model detected by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.B1，B2，B3 and B4 were the semi-quantitative results of A，respectively.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

炎癥因子的過表達(dá)是腦炎癥損傷病理的經(jīng)典特征，其中CCL11吸引免疫細(xì)胞到炎癥反應(yīng)部位[22]，IL-3和IL-5刺激參與T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖和分化[23-24]，IL-17可促使IL-6和細(xì)胞黏附分子1等炎癥因子的合成和釋放[25]，從而使炎癥反應(yīng)持續(xù)。本研究用LPS聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)BV2細(xì)胞，構(gòu)建MANF模型。研究結(jié)果表明，與細(xì)胞對照組相比，細(xì)胞+ICA組細(xì)胞上清中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11水平無明顯變化，模型組均顯著升高；ICA 20 μmol·L-1可使MANF模型細(xì)胞上述細(xì)胞因子水平明顯降低，提示ICA可抑制BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。神經(jīng)系統(tǒng)受到內(nèi)在或外來炎癥損傷初期，小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化以發(fā)揮抗炎保護(hù)作用；隨著損傷程度加深，小膠質(zhì)細(xì)胞則表現(xiàn)向M1型促炎表型極化，進(jìn)一步加深神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。CD16/CD32是促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞M1型表型標(biāo)志物，CD206是抑炎型小膠質(zhì)細(xì)胞M2型表型標(biāo)志物。本研究結(jié)果表明，與細(xì)胞對照組相比，ICA對BV2細(xì)胞CD16/CD32和CD206陽性細(xì)胞百分比無明顯影響；MANF模型組CD16/CD32陽性細(xì)胞百分比明顯增加，CD206陽性細(xì)胞百分比顯著減少，提示MANF模型細(xì)胞向M1型炎癥表型極化。與模型組相比，ICA 10和20 μmol·L-1可使MANF模型細(xì)胞CD16/CD32陽性細(xì)胞百分比明顯減少，CD206陽性細(xì)胞百分比顯著增加，表明ICA可使MANF模型細(xì)胞向M2型抗炎表型極化。

MS進(jìn)程中存在NLRP3炎癥小體的激活。炎癥發(fā)生初期，小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)M2型，此時NLRP3激活以抵御外界炎癥損傷，維持中樞功能平衡；疾病后期，NLRP3大量激活，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞占主導(dǎo)地位。NLRP3炎癥小體是以NLR3蛋白為受體蛋白、胱天蛋白酶作為效應(yīng)蛋白（effector）、ASC為接頭蛋白的復(fù)合體。炎癥發(fā)生時，炎癥因子分泌增多可刺激NLRP3和ASC表達(dá)增加，使胱天蛋白酶原1轉(zhuǎn)為成熟的胱天蛋白酶1，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，與細(xì)胞對照組相比，ICA對BV2細(xì)胞NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶原1蛋白表達(dá)均無明顯影響；模型組NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表達(dá)增多，胱天蛋白酶原1蛋白表達(dá)明顯減少；ICA 5，10 和 20 μmol·L-1可使 MANF模型細(xì)胞NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表達(dá)減少，提示ICA發(fā)揮抗炎作用可能與其抑制NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，ICA可明顯改善LPS和IFN-γ聯(lián)合誘導(dǎo)的MANF模型細(xì)胞炎癥反應(yīng)，有較好的抑制神經(jīng)炎癥的作用。據(jù)報道，ICA可通過靶向核因子E2相關(guān)因子2信號通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[18]。因此，需開展動物實(shí)驗(yàn)研究，對ICA改善神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制進(jìn)行深入探索。