劉朝玉, 林艷, 吳保歡, 羊海軍, 李薇, 崔大方*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學, a. 林學與風景園林學院; b. 基礎實驗與實踐訓練中心; c. 華南農(nóng)業(yè)博物館，廣州 510462；2. 貴州省凱里市第一中學，貴州 凱里556000)

益智(Alpinia oxyphylla)為姜科(Zingiberaceae)山姜屬多年生草本植物，為中國特有種[1]，主產(chǎn)于海南、廣東、廣西、福建和云南。作為傳統(tǒng)中藥材，益智以成熟果實入藥，具暖腎固精、溫脾止瀉的功效，被譽為“四大南藥”之一[2-3]。隨著研究的深入，其新的藥用價值還在陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，例如抗腫瘤和治療帕金森癥[4-5]。20 世紀80 年代以來，國內(nèi)外市場對益智仁的需求逐漸增加，貨源已從野生資源采集轉化為規(guī)?；胍吧斯ぴ耘?，年交易量達1 700~3 500 t[6]。生產(chǎn)方式的改變，促進了益智種質資源的收集、保存、評價和利用，以及優(yōu)良品種選育、種苗繁育和規(guī)范化栽培等方面的研究，不僅更好地滿足消費需求，也保護了野生資源。

相對于化學成分、藥理藥效研究[7-8]，益智的種質資源評定、居群遺傳多樣性、優(yōu)良品種選育等領域的研究尚處在初級階段[9]。Wang 等[10]利用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記技術, 認為益智野生居群具有較高的遺傳多態(tài)性，建議通過禁止開發(fā)野生資源來保護該物種的棲息地，同時加強種質資源庫的建設。王茂媛等[11]的田間觀測表明，益智在花果形態(tài)方面存在極為豐富的多態(tài)性, 個體間差異明顯，但株叢內(nèi)具有較高的一致性，其中果序長度、果實大小和形態(tài)這3 個性狀可作為鑒別益智種質資源及雜交育種評定的重要性狀。形態(tài)變異是基因型與環(huán)境壓力共同作用的結果，可在一定程度上反映生物遺傳變異的程度，然而王祝年等[12]報道益智種質資源間基于ISSR 標記的聚類與基于表型性狀的聚類結果不完全一致，一方面是表型性狀不僅受遺傳物質影響，也受海拔、經(jīng)緯度、郁閉度等環(huán)境因子要素的影響[13]；另一方面，ISSR 具有通用隨機引物特征從而導致物種特性不強。相對的，SSR (simple sequence repeat)是在復制或修復過程中DNA 滑動和錯配或染色單體不均等交換的結果，具有較高的物種特異性，可用于鑒定雜合子和純合子[10,14]。SSR 長度為100~200 bp。因微衛(wèi)星中重復單位的數(shù)目有極高的變異現(xiàn)象，所表現(xiàn)出的變異現(xiàn)象為微衛(wèi)星單位數(shù)目成整倍性變異或可能出現(xiàn)重復單位序列中的序列不完全一樣，從而形成多態(tài)性位點。SSR 分子標記技術已成功應用于多種農(nóng)林植物的遺傳多樣性分析、目標基因的標定和指紋圖譜的構建等研究中[14-16]。

20 世紀70 年代開始，廣東省從海南引種益智，至今種植面積已近4 000 hm2，其中茂名地區(qū)的信宜、高州最為集中連片[17-18]，由于益智良種選育工作嚴重滯后，以及農(nóng)戶分散經(jīng)營的業(yè)態(tài)，導致目前廣東省境內(nèi)種植的益智種質十分混雜，形態(tài)變異多樣，產(chǎn)量差異顯著，抗逆性參差不齊[19-20]。本研究利用SSR 分子標記技術針對廣東省益智栽培群體進行遺傳多樣性的分析研究，探討其遺傳多樣性豐富度、遺傳結構及類型的劃分，為廣東省栽培益智種質資源的保護育種及良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

本試驗益智(Alpinia oxyphylla)材料分別采自廣東省茂名地區(qū)的信宜白石鎮(zhèn)岳龍村、洪冠鎮(zhèn)洪勝村，高州古丁鎮(zhèn)大窩村和龍馬村、深鎮(zhèn)鎮(zhèn)良坪村、新垌鎮(zhèn)高良村以及陽江市陽春雙滘鎮(zhèn)榕木村。根據(jù)益智果和葉片的形態(tài)特征分類劃分為10 個群體(Z1~Z8、DA 和YC)，共166 份材料(表1)。采集益智新鮮葉片，放入-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)DNA 提取。

1.2 DNA 提取和測序

使用北京天根新型植物基因組DNA 提取試劑盒DP320 提取益智鮮葉片總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度檢測合格后稀釋至50 ng/μL，用于后續(xù)基因組測序。

1.3 SSR 引物擴增

23 對SSR 引物來自于鄒穎[21](表2)，經(jīng)PCR 擴增選擇具有穩(wěn)定擴增和多態(tài)性良好的14 對引物(表3)。SSR 擴增反應體系總體積為10μL，包括2×TaqPCR Master Mix 5μL，模板DNA 1μL (50 ng/μL), 上游引物0.1μL (100 ng/μL)，下游引物0.4μL (100 ng/μL),帶熒光的M13 引物0.4μL (100 ng/μL), ddH2O 3.1μL。擴增反應程序: 95 ℃預變性5 min；然后95 ℃變性45 s，52 ℃~62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸20 min。

表2 SSR 引物序列Table 2 Sequence of SSR primers

表3 益智的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of Alpinia oxyphylla

1.4 SSR 數(shù)據(jù)分析

SSR 數(shù)據(jù)采用PopGene (ver. 1.32)[22]進行遺傳多樣性統(tǒng)計，計算Shannon’s 信息指數(shù)(Shannon’s information index,I)、等位基因數(shù)(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、群體間基因流(Nm)和Nei’s 遺傳距離[23]。

利用Arlequin (ver. 3.5.1)分析群體間和群體內(nèi)差異，位點和群體間的遺傳分化系數(shù)(Fst)，進行AMOVA 分子方差和顯著性分析，參數(shù)“Number of permutations”設置為9 999，“Number of permutetions”設置為100，顯著性水平設置為0.05[24]。利用Structure (ver. 2.3.4)軟件對群體進行遺傳結構分析,利用Structure Harvester 計算ΔK 值和LnP(D)值，計算群體最佳K 值[25]。采用R 軟件(www.r-project.org/)中ape 包的pcoa 函數(shù)進行PCoA 主坐標分析，并繪制樣本分布散點圖。

2 結果和分析

2.1 遺傳多樣性分析

SSR位點多態(tài)性從表3 可見，14 對引物在166 份栽培益智種質中共檢測出88 個等位基因，每對引物檢測等位基因1.198~3.279 個，平均3.729 個;Shannon’s 信息指數(shù)為0.190~1.235；觀測雜合度為0.090~0.696，平均0.448；期望雜合度為0.123~0.655,平均0.512。

群體遺傳多樣性比較采用PopGene 進行群體遺傳多樣性分析(表4)，群體間有效等位基因數(shù)最小為1.653 個，最大為4.023 個，平均2.599 個;平均每個群體可擴增出16.121 個個體，檢測到3.721個等位基因位點；Shannon’s 信息指數(shù)為0.520~1.463，均值為0.946；觀測雜合度和期望雜合度分別為0.328~0.683 和0.385~0.714，平均分別為0.448和0.512。其中，DA 群體的Shannon’s 信息指數(shù)最高，為1.463，等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)分別為6.000 和4.017，表明DA 群體的遺傳多樣性最為豐富。

表4 益智群體的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity in Alpinia oxyphylla populations

群體遺傳分化分析從表5 可見，益智群體的遺傳分化系數(shù)Fst為0.043~0.265，平均為0.131，0.050≤Fst≤0.150 的有27 組，占比49.1%，0.150≤Fst≤0.250 的有15 組，占比27.3%，表明該益智種質大部分群體間處于中等偏高遺傳分化程度。Z4和Z5 群體的遺傳分化系數(shù)最高，為0.265，最低的是Z2 和Z3，為0.043。

表5 益智群體間的FstTable 5 Fst among Alpinia oxyphylla populations

AMOVA方差分析從表6 可見，在顯著性水平P<0.001 下，20.87%的遺傳變異發(fā)生在群體間,79.13%的遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)，說明益智群體遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)，群體間的遺傳分化較低。

表6 益智群體變異的AMOVA 分析Table 6 AMOVA variation analysis of Alpinia oxyphylla populations

2.2 群體遺傳結構分析

利用Structure 軟件基于貝葉斯數(shù)學模型對166份益智種質資源進行初步群體結構分析，結果表明，當K 值為4 時，模型的后驗概率最大(圖1) 由此可見，將供試益智樣本劃分為4 個類型最為合適(圖2)。從群體遺傳結構圖可以看出，群體Z2、Z3、Z4 和Z8 的遺傳背景較為相似，群體Z5、Z9、Z10較為獨立而各成一體，而群體Z1、Z6、Z7 存在一定的遺傳漸滲(圖2)。

圖1 不同K 值時ΔK 值的變化Fig. 1 Changes in ΔK at different K values

圖2 益智群體的遺傳結構圖。1~8: Z1~Z8; 9: DA; 10: YC。Fig. 2 Genetic structure map of Alpinia oxyphylla population. 1-8: Z1-Z8;9: DA; 10: YC.

PCoA 主坐標分析結果表明(圖3)，所有個體在二維空間上表現(xiàn)出集群分布特征，大致可分為4 個區(qū), A 區(qū)主要包含來自Z1、Z2、Z3、Z4、Z7 和Z8群體的個體，B 區(qū)主要包含來自Z1、Z5 和Z6 群體的個體，C 和D 區(qū)則分別來自YC 和DA 群體。其中，C 區(qū)的植株形態(tài)為葉小、中果，種子較小; D 區(qū)的植株形態(tài)為葉大、中果，種子較大；A 區(qū)的植株形態(tài)葉較小、果實有大有小，種子有大有??；B 區(qū)的植株形態(tài)為葉大、果實為小果，種子有大有小, 各類群與表型特征之間未呈現(xiàn)出明顯關聯(lián)性。

圖3 主坐標分析圖Fig. 3 Principal coordinate analysis map

3 結論和討論

物種遺傳分化程度的高低受地理范圍、生態(tài)環(huán)境以及繁育系統(tǒng)等因素的影響[26-27]。Wright[28]首次將群體遺傳分化程度進行了劃分: 0≤Fst≤0.05 表示遺傳分化極小，可以不考慮遺傳分化; 0.05≤Fst≤0.15 表示處于中等水平；0.15≤Fst≤0.25 表示遺傳分化較大；Fst≥0.25 表示遺傳分化極大。本研究采用SSR 分子標記對166 份廣東產(chǎn)益智種質進行遺傳多樣性分析，廣東益智的遺傳分化系數(shù)為0.043~0.265, Shannon’s 指數(shù)均值為0.946，高于海南產(chǎn)野生種質的0.337 3[12]，表明廣東栽培的益智種質遺傳多樣性較高，遺傳背景更為復雜。

本研究在形態(tài)分類的基礎上對群體遺傳結構分析，可將166 份廣東益智種質分為4 大類群，基于PCoA 分析在二維空間上同樣表現(xiàn)出集群分布特征，但4 個區(qū)域的益智植株個體并沒有反映出形態(tài)特征的規(guī)律性，表現(xiàn)在基于分子標記的聚類結果出現(xiàn)較多的個體混雜現(xiàn)象，與基于形態(tài)的分類群體不能較好地實現(xiàn)一致性，可能的原因: 首先，益智主產(chǎn)海南，廣東后于海南開展益智栽培，很長時間里，農(nóng)戶都自行從海南的不同地方分批引種，造成種源混雜，種質混亂的局面；其次，本研究所采用表型性狀僅包含果實，葉片性狀以及種子，而影響植物分類精確性的性狀多達幾十個[29]，因此性狀數(shù)量不足將會造成分類誤差，此外，植物表型性狀容易受到人為選擇和環(huán)境干擾的特性也會使分類結果產(chǎn)生誤差[30]；第三，引物數(shù)量影響分子標記準確性, 本研究所選用引物為14 對，引物不足會使覆蓋的基因組范圍受到限制，導致基因組信息顯示不全，從而對聚類結果產(chǎn)生影響。因此，后續(xù)研究應充分考慮多方面因素，提高植物形態(tài)分類和分子標記聚類的精確性。